CN102154315A

CN102154315A - 甘薯金属硫蛋白基因IbMT1及其在提高植物耐盐及抗旱方面的应用

Info

Publication number: CN102154315A
Application number: CN 201110024931
Authority: CN
Inventors: 宿红艳; 王磊; 张娟; 韩立亚; 吴凡林; 王洋
Original assignee: Ludong University
Current assignee: Ludong University
Priority date: 2011-01-17
Filing date: 2011-01-17
Publication date: 2011-08-17

Abstract

本发明公开了一种甘薯(Ipomoea batatas)金属硫蛋白基因IbMT1及其在提高植物耐盐及抗旱方面的应用，属于分子生物学和生物技术领域。本发明构建甘薯盐胁迫抑制消减文库，从文库中随机挑取克隆进行测序，获得一个金属硫蛋白基因，将其命名为IbMT1。进一步构建该基因的植物表达载体，通过农杆菌介导的方法转化烟草。在高盐和干旱胁迫等条件下转基因烟草的生长状态及生理指标均明显优于野生型。因此，本发明提供的来源于甘薯的基因IbMT1具有提高植物耐盐和抗干旱等逆境的作用，具有很高的应用价值。

Description

甘薯金属硫蛋白基因IbMT1及其在提高植物耐盐及抗旱方面的应用

技术领域：

本发明涉及一种甘薯金属硫蛋白基因IbMT1及其在提高植物耐盐及抗旱方面的应用，属于分子生物学和生物技术领域。

背景技术：

水资源短缺以及土壤盐渍化是目前制约农业生产的全球性问题，全球约有20％的耕地受到盐害威胁，43％的耕地为干旱、半干旱地区。近年来我国自然灾害严重，不利气象因素较多，北方地区降水持续偏少，干旱化趋势严重。今后受全球气候变暖影响，我国干旱缺水状况呈加重趋势，可能会给农业生产带来诸多不利影响，将对我国中长期粮食安全构成极大威胁。植物抗盐碱、耐干旱能力的提高，适宜在盐碱地上生长并具有较高经济和生态价值的物种或品系的选育，则是利用盐碱地经济、有效的措施。然而绝大多数植物对盐碱、干旱的耐受性差，只能生长在氯化钠含量为0.3％以下的土壤中，这极大的限制了植物在盐碱滩地上的广泛生长。过去半个多世纪的研究表明，同种作物的不同基因型品种或不同种类作物的耐盐、抗干旱耐低温等抗逆性状是不同的，表明植物的抗逆性状是受遗传基因控制的。因此，寻找、与盐、干旱胁迫相关的基因并研究其具体功能具有重要的理论和实践意义。

本发明人本发明构建甘薯盐胁迫抑制消减文库，从文库中随机挑取克隆进行测序，获得一个金属硫蛋白基因，将其命名为IbMT1。进一步构建该基因的植物表达载体，通过农杆菌介导的方法转化烟草。结果表明，获得的转基因烟草在高盐和干旱等胁迫条件下的生长状态及生理指标均明显优于野生型。因此，本发明提供的来源于甘薯的基因IbMT1具有提高植物耐盐和抗干旱等逆境的作用，具有很高的应用价值。

发明内容：

本发明目的在于提供一种甘薯金属硫蛋白基因IbMT1及其在提高植物对高盐、干旱等抗性方面的应用。

分别从200mM NaCl处理的甘薯幼苗和正常生长的甘薯幼苗中提取总RNA，然后各取2μg总RNA反转录成cDNA，构建甘薯盐胁迫抑制消减文库。从文库中随机挑取克隆进行测序，获得一条561bp cDNA序列，3′端具有多聚A尾巴，包含一个201bp开放阅读框，编码66个氨基酸序列。将此氨基酸序列在基因银行(Genbank)中进行BLAST比较分析，发现与已发表的其它物种的金属硫蛋白的氨基酸有较高同源性，表明经过上述步骤筛选获得的是甘薯金属硫蛋白基因，命名IbMT1。IbMT1基因核苷酸序列和其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明将甘薯金属硫蛋白基因的编码区全序列正向插入到植物表达载体PBI121的35S启动子的下游，构建得到载体PBI121-IbMT1，通过农杆菌介导的方法转化烟草。在高盐和干旱等胁迫条件下转基因烟草的株高和鲜重均明显优于野生型，在生理性状上表现为转基因烟草的叶绿素含量均高于野生型，而转基因烟草的MDA含量明显低于野生型，表明甘薯金属硫蛋白IbMT1在烟草中的过量表达可以降低植物膜脂的过氧化作用，保护植物的细胞膜系统。因此，来源于甘薯的IbMT1基因具有提高植物耐盐和抗干旱等逆境的作用。

使用IbMT1基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定和筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的选择性基因(GUS基因、荧光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

本发明同已有技术相比可产生如下积极效果：本发明从甘薯中获得一个金属硫蛋白基因IbMT1，提出了一种利用该基因提高植物耐盐和抗干旱能力的基因工程改良方法。

附图说明

图1为构建植物表达载体所用的PBI121载体图

图2为野生型和转基因烟草植株株高的测定结果柱状图

其中，wt，野生型；T1-1和T1-2为转基因株系

图3为野生型和转基因烟草植株鲜重的测定结果柱状图

其中，wt，野生型；T1-1和T1-2为转基因株系

图4为野生型和转基因烟草植株叶绿素含量的测定结果柱状图

其中，wt，野生型；T1-1和T1-2为转基因株系

图5为野生型和转基因烟草植株丙二醛含量的测定结果柱状图

其中，wt，野生型；T1-1和T1-2为转基因株系

具体实施方式：下面结合附图对本发明作进一步的详细说明：

下述实例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

试验材料

1.菌株与载体：大肠杆菌菌株DHα、农杆菌菌株EHA105购自华美生物公司；表达载体pBI121购自Clontech公司。

2.主要试剂：SMART^TM PCR cDNA Synthesis Kit和ClontechPCR-Select cDNASubtraction Kit购自Clontech公司；Taq DNA聚合酶购自北京全式金公司、DNA标准分子量购自Takara公司；限制性内切酶、T4DNA连接酶、M-MLV反转录酶购自Promega公司；RNeasy Plant Mini Kit购自Qiagen；其它化学试剂均为国产分析纯。

3.本发明设计的引物序列：

引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列如下：

IbMT-BamHI：5′-AAGGATCCATGTCTTCCGGTTGCAAG-3′(引入BamH I酶切位点)

IbMT-Sac I：5′-ATGAGCTCCTAACAGTTGCAAGGGTC-3′(引入Sac I酶切位点)

4.本发明所用的培养基：

LB培养基：每升含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用NaOH调pH至7.0，灭菌待用。加1.5％琼脂配成固体培养基。

YEB培养基：每升含胰蛋白胨5g，酵母提取物1g，蔗糖5g，MgSO₄0.5g，用NaOH调pH至7.5，灭菌待用。加1.5％琼脂配成固体培养基。

MS培养基：购自Sigma公司，加8％琼脂配成固体培养基。

MS共培养培养基：MS培养基中加入6-苄氨基嘌呤(6-BA，2mg/L)及萘乙酸(NAA，0.2mg/L)。

MS选择培养基：MS共培养培养基中加入羧苄青霉素(250mg/L)及卡那霉素(100mg/L)。

MS生根培养基：1/2MS培养基中加入NAA(0.3mg/L)、羧苄青霉素(250mg/L)及卡那霉素(50mg/L)，1/2MS培养基是指MS大量元素减半。

5.植物材料：甘薯(Ipomoea batatas)

6.主要仪器：常温离心机、冷冻离心机来自Eppendorf公司；PCR仪、凝胶成像仪购自Biorad公司。

实施例1：甘薯金属硫蛋白基因IbMT1的获得

1.甘薯幼苗的处理：选取甘薯植株的茎尖或尚未分化的腋芽，经消毒后，切成段接种到MS固体培养基上培养，培养温度为27±2℃，光照约2000Lux。待无菌苗生长到约3厘米高时，选取生长旺盛的健康无菌苗转移至含有200mMNaCl的MS固体培养基上诱导培养24小时。

2.总RNA的提取：利用RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen公司)分别提取NaCl处理和未处理的甘薯幼苗总RNA，具体操作参照试剂盒说明书进行。

3.盐胁迫抑制消减文库的构建：各取NaCl处理和未处理的甘薯幼苗总RNA 2μg反转录成cDNA，构建甘薯盐胁迫抑制消减库。具体操作均参照SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit(Clontech公司)和PCR-Select cDNA Subtraction Kit(Clontech公司)试剂盒说明书进行。

4.甘薯金属硫蛋白基因IbMT1的获得

随机挑取文库中的克隆在LB液体培养基(含氨苄青霉素100mg/L)中过夜培养，取1mL过夜培养菌液送北京华大基因研究中心测序。利用美国国立生物技术信息中心(NCBI，网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的VecScreen程序将测序结果中的载体序列去掉，再分别用Blast程序将克隆片段的碱基序列在基因银行数据库(GenBank)中进行序列相似性搜索。通过以上筛选分析，获得一条561bp cDNA序列，3′端具有多聚A尾巴，包含一个201bp开放阅读框，编码66个氨基酸序列，此氨基酸序列与基因银行中已发表的其它物种的金属硫蛋白的氨基酸有较高同源性，表明经过上述步骤筛选获得的是甘薯金属硫蛋白基因，命名为IbMT1。IbMT1基因核苷酸序列和其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。

实施例2：PBI121-IbMT1植物表达载体的构建

1.IbMT1cDNA编码区的扩增：根据的IbMT1cDNA编码区两端序列设计引物IbMT-BamH I和IbMT-Sac I，以含有IbMT1的菌液作为模板进行PCR扩增。在25μL反应体系中依次加入：10×buffer(Mg²⁺)2.5μL，dNTP(10mM)1μL，引物各1μL(10μM)，模板1μL，Taq酶0.2μL，其余用ddH₂O补足。

PCR扩增的条件为：94℃5分钟预变性后，94℃1分钟，56℃1分钟，72℃1分钟，共35个循环。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，扩增出一条大小为200bp左右的特异条带，送北京华大基因研究中心测序证实为IbMT1cDNA编码区全序列。

2.酶切、连接：将扩增的IbMT1片段和PBI121载体(载体图谱见图1)分别用BamH I(Takara公司)和Sac I(Takara公司)进行双酶切。双酶切反应按照Takara说明书进行。回收、纯化IbMT1片段和PBI121载体片段，按照2～10∶1的比例在T4DNA连接酶作用下16℃过夜。

3、转化：大肠杆菌DHα感受态细胞的制备方法参照F.奥斯伯等(《精编分子生物学实验指南》，1998，科学出版社)进行。将连接产物通过42℃热激导入大肠杆菌DHα感受态细胞中，在含有卡那霉素(50mg/L)的LB平板上筛选抗性菌落，提质粒，酶切鉴定，正确的即为为重组质粒PBI121-IbMT1。

实施例3：pBI121-PeMYB103RNAi质粒向农杆菌EHA105的导入

3.1农杆菌EHA105感受态细胞的制备

1、挑取农杆菌EHA105单菌落，接种于5mL附加有50mg/L的利福平的液体YEB培养基中，28℃过夜培养；

2、取2mL培养物至液体YEB中，继续培养至OD₈₀₀为0.5左右；

3、将培养物冰浴30分钟，4℃，5000rpm，离心5分钟；

4、弃去上清，10mL冷的NaCl(0.1mol/L)悬浮菌体；

5、4℃，5000rpm，离心5分钟；

5、弃上清，1mL冷的CaCl₂(20mmol/L)悬浮，分装成200μL/管，液氮中冷冻后-70℃保存。

3.2转化、筛选

1、冰上融化感受态细胞，加入1-2μL重组质粒DNA(PBI121-IbMT1)，冰浴45分钟，液氮中冷冻1分钟，再37℃水浴3分钟。

2、加入1mL无抗生素的YEB，28℃，200rpm，3小时。

3、12000rpm离心1分钟以浓缩菌液，100μL回溶菌体。

4、将转化后的菌液涂于附加50mg/L卡那霉素，50mg/L利福平的固体LB培养基上，置于28℃下培养2-3天。

5、进行菌落PCR反应验证，阳性菌落即为已导入pBI121-IbMT1载体的农杆菌EHA104。

实施例4：IbMT1基因对烟草的遗传转化

以下组织培养条件若无特别说明，均为26℃左右，光照强度1500-2000Lux，光照时间16小时/天。

4.1无菌材料的培养

选取籽粒饱满的野生型烟草种子，先用清水冲洗，放入0.1％升汞溶液中消毒6分钟，无菌水冲洗数次，接种于MS基本培养基中，培养至5-6片真叶期即可取其叶片作遗传转化的外植体。

4.2农杆菌的培养

挑取农杆菌(携带重组质粒的农杆菌单菌落)接种于含有50mg/L卡那霉素的YEB培养基中，28℃振荡培养过夜。然后取250μL菌液接种于25mL新鲜的相同培养基中28℃振荡培养至对数生长期。取该菌液于5000rpm离心5分钟，以同体积MS液体培养基悬浮后用于转化。

4.3转化方法

1.预培养：取烟草叶片，剪成小块(0.5×0.5cm)，将剪好的烟草叶片置于MS共培养培养基中，预培养两天。

2.侵染、共培养：将预培养后的烟草叶片浸入菌液，轻轻摇动5-10分钟，以使叶片边缘充分与农杆菌培养液接触。然后，用灭菌的滤纸吸干多余菌液，再将侵染后的叶片转移至共培养培养基上，28℃黑暗培养两天。

3.筛选培养：共培养后的外殖体先用含羧苄青霉素250mg/L的无菌水洗涤3次，再用含羧苄青霉素250mg/L的MS培养液洗1次，然后用灭菌滤纸吸干。然后，转入MS选择培养基上筛选，光照培养获得抗性芽。

4.生根培养：待抗性芽长至1厘米左右时切下，移入MS生根培养基中，促其生根。待根系发育好后(5-6片叶)，移入盛有无菌土的花盆中，温室常规管理。

实施例5：转基因烟草的PCR检测及其抗逆境胁迫分析

5.1转基因烟草的PCR检测。

利用RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen公司)分别提取5个转基因株系和野生型的总RNA。利用引物IbMT-BamH I和IbMT-Sac I进行RT-PCR分析。用One stepRNA PCR Kit(Takara)进行RT-PCR扩增，反应体积为20μL，反应体系为：总RNA1μg，10μmol/L的正向和反向引物各1μL，RNA酶抑制剂20U，10×Buffer2μL，25mmol/L的MgCl₂4μL，10mmol/L的dNTP 2μL，反转录酶2U。反应条件：反转录反应，50℃30分钟；预变性94℃2分钟；94℃30秒，56℃30秒，72℃30秒，30个循环；延伸72℃7分钟。结果显示，转基因植株中均扩增出与目的片段大小一致的产物，而阴性对照的野生型植株则无相应的PCR产物出现。经测序证实，该片段为甘薯的金属硫蛋白基因IbMT1。以上结果表明证明基因已整合到烟草基因组中，并且已在转基因烟草中表达。

5.2转基因烟草的抗逆性分析

将转基因烟草株系播种到含100mg/L卡那霉素的MS培养基上，野生型烟草播种到不含卡那霉素的MS培养基上。1个月后进行下述不同条件处理：

(1)盐处理：将抗卡那霉素的转基因植株和对照野生型植株移栽到含200mMNaCl、300mM NaCl的MS培养基上，每个株系5株重复。

(2)模拟干旱处理：将抗卡那霉素的转基因植株和对照野生型植株移栽到含25％PEG的MS培养基上，每个株系5株重复。

处理50天后测量植株的株高和鲜重，并测定其叶绿素和丙二醛等衡量植物耐胁迫的重要生理指标。叶绿素可以反映植物进行光合作用、合成碳水化合物的潜力。丙二醛是(malondialdehyde，MDA)脂质过氧化作用的最终产物之一，其含量可作为细胞膜脂过氧化作用强弱和质膜被破坏程度的指标。具体测定方法如下：

(1)叶绿素含量测定。

利用SPAD-502叶绿素仪(Minolta，Japan)测定叶绿素的相对含量。

(2)丙二醛含量的测定

植物材料用5％三氯乙酸(TCA)研磨成匀浆，3000rpm离心10分钟。取上清加0.6％硫代巴比妥酸，混匀后沸水中30min，自来水冲洗冷却至室温后离心，上清液分别在450nm、532nm和600nm处测定吸光值，按公式C(μrmol·L^-1)＝6.45×(A532-A600)-0.56×A450计算MDA浓度，并进一步根据公式计算单位鲜重的植物组织中MDA含量：MDA含量(μmol·g^-1)＝MDA浓度(μmol·L^-1)×提取液体积(L)/植物组织鲜重(g)

结果显示，在高盐和干旱等胁迫条件下转基因植株的株高和鲜重均明显优于野生型(图2和图3)。在生理性状上表现为转基因烟草的叶绿素含量均高于野生型(图4)，而转基因烟草的MDA含量明显低于野生型(图5)。表明甘薯金属硫蛋白IbMT1在烟草中的过量表达可以降低植物膜脂的过氧化作用，保护植物的细胞膜系统。因此，来源于甘薯的IbMT1基因具有提高植物耐盐和抗干旱等逆境的作用。

Claims

1.一个甘薯金属硫蛋白基因IbMT1，其特征在于其核苷酸序列及其编码的蛋白质序列分别如序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

2.一种植物表达载体，其特征在于其含有权利要求1所述的基因IbMT1。

3.根据权利要求2所述的一种植物表达载体，其特征在于所述的载体为pBI121-IbMT1。

4.一种宿主细胞，其特征在于其含有权利要求2所述的植物表达载体。

5.根据权利要求4所述的一种宿主细胞，其特征在于包括大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。

6.根据权利要求1所述的一个甘薯金属硫蛋白基因IbMT1的用途，其特征在于该基因在烟草中过量表达，能有效提高转基因植株对高盐和干旱的耐受性。