CN104004070A

CN104004070A - 一种具有锌指蛋白结构bbx24的基因及其应用

Info

Publication number: CN104004070A
Application number: CN201410165270.8A
Authority: CN
Inventors: 高俊平; 王美艳; 杨英杰; 洪波; 徐彦杰
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2014-04-24
Filing date: 2014-04-24
Publication date: 2014-08-27

Abstract

本发明提供了一种具有锌指蛋白结构BBX24的基因及其应用。本发明还提供了编码锌指蛋白转录因子的核苷酸序列以及它们在调控植物开花时间及非生物胁迫耐性上的应用。所述锌指蛋白转录因子在菊花上的基因沉默表现出对光周期的不敏感性，在长日照条件下可以明显地使短日照菊花的开花时间提前；在菊花上过表达表现出对低温和干旱耐性的增强。因此，它在调控植物开花时间和非生物胁迫耐性的应用上具有独特的优势。

Description

一种具有锌指蛋白结构BBX24的基因及其应用

技术领域

本成果涉及菊花的园艺栽培、生产以及菊花开花时间调节的领域。

背景技术

锌指蛋白(zinc finger protein)是一类具有“指状”结构域的转录因子(也称为反式作用因子，能够与真核基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异结合，并激活或抑制转录)。这一类蛋白的共同特征是通过多个半胱氨酸或/和组氨酸结合Zn²⁺来稳定一种很短的可自我折叠成“手指”的多肽空间构型。

BBX是B-box家族的一类锌指转录因子蛋白。B-box家族蛋白的N端为一个或两个串联的B-box结构域，由保守的半胱氨酸和组氨酸残基组成。B-box蛋白的三级结构由锌离子的结合而稳定.

在动物中，B-box经常与环指(A-box)以及螺旋-螺旋结构域一起出现在RBCC(三重基序)蛋白中，参与转录调节、蛋白定位等多种活动。B-box被认为是蛋白互作的结构域，但功能仍然不甚清楚。植物中不包含RBCC蛋白，但拟南芥中有32个N-端含B-box的蛋白，根据他们的蛋白结构分为五个结构亚组。亚组I(BBX1-6)，II(BBX7-13)和III(BBX14-17)的成员N端包含一个或两个B-box，C端含有一个CCT域。在光调控途径中控制开花时间的CONSTANS(CO，BBX1)属于亚组I。亚组IV(BBX18-25)和V(BBX26-32)的成员只在N端有两个或一个B-box结构域，而C端没有CCT域(图1)。

BBX蛋白被认为参与蛋白-蛋白之间的互作，并且已经有一些这方面的研究。比如BBX1(CONSTANS)，BBX4(COL3)，BBX21(STH2)，BBX22(STH3)，BBX24(STO)，以及BBX25(STH)可以和COP1互作。有研究结果表明，B-box结构域介导了蛋白与蛋白的相互作用，HY5通过B-box结构域与BBX21以及BBX22互作，COP1通过B-box结构域与BBX24产生互作。BBX21(STH2)的B-box结构域是蛋白互作和激活转录所必须的。在番茄中，BBX25(STH)的同源蛋白TSTO没有DNA结合域，但有很强的转录激活功能。B-box蛋白之间也会产生互作，如BBX32与BBX21即可发生互作，抑制BBX21与HY5蛋白复合体的正调控功能。

发明内容

本发明的目的是提供一种参与调控菊花开花时间和非生物胁迫耐性的锌指蛋白BBX转录因子。本发明的目的是通过如下技术方案来实现的。

1、一种锌指蛋白转录因子，其中，所述锌指蛋白转录因子与SEQ No.2具有50％至100％的同一性的核苷酸序列编码。

2、一种核苷酸序列，所述核苷酸序列为编码技术方案1所述的所述锌指蛋白转录因子；优选的是，所述核苷酸序列与SEQ No.1具有50％至100％的同一性。

3、用于对技术方案1所述的锌指蛋白转录因子或技术方案2所述的核苷酸序列进行克隆、检测、定位、过表达或沉默的引物或者引物对，所述引物包含SEQ No.3；所述引物对选自由如下引物对组成的组：引物对SEQ NO.4和6、5和7、8和9、10和11、12和13、14和15、16和17、18和19、20和21、22和23、24和25、26和27。

4、一种克隆技术方案1所述的锌指蛋白转录因子或技术方案2所述的核苷酸序列的方法，所述方法包括使用选自由如下引物或者引物对组成的组：所述引物包含SEQ No.3；所述引物对选自由如下引物对组成的组：引物对SEQ NO.4和6、引物对SEQ No.5和7、引物对SEQ NO.8和9、引物对SEQ NO.10和11、引物对SEQ NO.12和13、和引物对SEQ NO.26和27。

5、一种检测技术方案1所述的锌指蛋白转录因子或技术方案2所述的核苷酸序列的方法，所述方法采用1)引物对SEQ NO.14和15、和/或2)引物对SEQ NO.16和17。

6、一种过表达技术方案1所述的锌指蛋白转录因子的基因的方法，所述方法包括使用引物对SEQ NO.20和21进行。

7、一种使技术方案1所述的锌指蛋白转录因子的基因沉默的方法，所述方法包括使用1)引物对SEQ NO.22和23、和/或2)引物对SEQ NO.24和25。

8、一种调节植物开花特性与非生物胁迫耐性的方法，所述方法包括使技术方案1所述的锌指蛋白转录因子过表达或沉默的步骤。

9、一种载体，所述载体包含如技术方案2所述的核苷酸序列；优选的是，所述载体为质粒载体，更优选为质粒表达载体；另外优选的是，所述载体为微生物载体。

10、如技术方案1所述的锌指蛋白转录因子或者如技术方案2所述的核苷酸序列在参与调节植物开花时间或提高植物对非生物胁迫耐性尤其是耐旱和/或耐寒上的应用。

本发明所提供的锌指蛋白转录因子参与植物开花特性和非生物胁迫耐性的调节。例如，在植物中沉默该基因表现出对光周期不敏感的特性，在长日照的条件下能明显的使短日照植物的开花时间提前；在植物中过表达该基因表现出对低温和干旱耐性的增强。这将使锌指蛋白转录因子(zinc finger protein)编码基因CmBBX24在调节植物开花特性或者提高植物对非生物胁迫耐性上具有独特的优势。CmBBX24基因参与调节植物开花特性以及抗性的研究具有重要的意义，为利用基因工程手段培育性状优良的植物提供了基因储备。

附图说明

图1显示了BBX转录因子结构与分类。亚组I(BBX1-6)，II(BBX7-13)和III(BBX14-17)的成员N端包含一个或两个B-box，C端含有一个CCT domain。亚组IV(BBX18-25)和V(BBX26-32)的成员只在N端有两个或一个B-box结构域，而C端没有CCT domain。

图2显示了CmBBX24蛋白推定的氨基酸序列与其他物种的BBXs序列比对以及与拟南芥结构亚组IV中的8个BBXs进化树分析。其中，A图：多重序列比对使用ClustalW2和BioEdit软件完成。黑框内展示了具有50％以上的相似性的氨基酸序列，横线分别标示两个保守的B-Box结构域(B1和B2)，星号标示B-Box结构域内与Zn²⁺结合的半胱氨酸，组氨酸以及天冬氨酸。B图：进化树由软件MEGA4.02生成，分枝上的数值显示了各分枝间的分歧度，图下的比例尺显示了分枝的长度。

图3显示了菊花CmBBX24基因的表达模式。其中，A图：菊花CmBBX24基因组织特异性表达分析。L，叶片；F，花；R，根；S，茎；六个月大的菊花植株用于RNA的提取，Ubiquitin作为内标基因。B图：CmBBX24基因在低温、干旱胁迫下的表达分析。正常生长条件下培养的菊花在8叶龄时按照时间点进行不同的胁迫处理；对照，正常生长条件下的基因表达情况；冷处理，4℃条件下的基因表达情况；干旱处理，室内(相对湿度30％，室温22℃)滤纸上自然脱水下的基因表达情况。

图4显示了转基因菊花(过表达和RNAi)开花时间的表型。其中，A图：转基因菊花和WT不同阶段的花朵开放的差异；B图：转基因菊花和WT在生殖阶段的表型。在植株长到有8片叶后移栽，移栽后置于16h光照/8h黑暗条件下培养4个月后拍照。WT，野生型菊花，CmBBX24-OX-23，21，14为三个独立的CmBBX24过表达株系，CmBBX24-RNAi-1，2，3为三个独立的CmBBX24RNAi株系。

图5显示了CmBBX24在菊花中过表达提高低温和干旱耐性表型。其中，A图CmBBX24过表达和WT植株的冷冻胁迫耐性分析。B图：CmBBX24过表达和WT植株的干旱胁迫耐性分析。WT，野生型菊花，CmBBX24-OX-23，21，14为三个独立的CmBBX24过表达株系。

图6显示了转基因菊花植株(过表达和RNAi)与野生型植株的1.5倍差异表达基因分析。

具体实施方式

本发明在第一方面提供了一种锌指蛋白转录因子，其中，所述锌指蛋白转录因子与SEQ No.2具有至少50％，例如60％、70％、80％、90％、91％、92％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方式中，所述锌指蛋白转录因子可以由与SEQ No.2具有至少50％例如60％、70％、80％、90％、91％、92％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性的核苷酸序列编码。

本发明在第二方面提供了一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码与SEQ No.2具有至少50％，例如60％、70％、80％、90％、91％、92％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述核苷酸序列与SEQ No.1具有至少50％，例如60％、70％、80％、90％、91％、92％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方式中，所述核苷酸序列为所述锌指蛋白蛋白转录因子的基因序列或其片段，优选的是，所述片段至少包括所述所述锌指蛋白转录因子基因的开放阅读框。

本发明第三方面提供了用于上述锌指蛋白转录因子或核苷酸序列进行克隆、检测、定位、过表达或沉默的引物或者引物对，所述引物包含SEQ No.3；所述引物对选自由如下引物对组成的组：引物对SEQ NO.4和6、引物对SEQ No.5和7、引物对SEQ NO.8和9、引物对SEQ NO.10和11、引物对SEQ NO.12和13、引物对SEQ NO.14和15、引物对SEQ NO.16和17、引物对SEQ NO.18和19、引物对SEQ NO.20和21、引物对SEQ NO.22和23、引物对SEQ NO.24和25、引物对SEQ NO.26和27。

本发明的第四方面提供了一种克隆上述锌指蛋白转录因子或核苷酸序列的方法，所述方法包括使用选自由如下引物或者引物对组成的组：所述引物包含SEQ No.3，优选的是，所述引物为SEQ No.3。所述引物对可以选自由如下引物对组成的组：引物对SEQ NO.4和6、引物对SEQ No.5和7、引物对SEQ NO.8和9、引物对SEQ NO.10和11、引物对SEQ NO.12和13、和引物对SEQ NO.26和27。

本发明的第五方面提供了一种检测上述锌指蛋白转录因子或核苷酸序列的方法，所述方法采用1)引物对SEQ NO.14和15、和/或2)引物对SEQ NO.16和17。

本发明的第六方面提供了一种过表达上述锌指蛋白转录因子的基因的方法，所述方法包括使用引物对SEQ NO.20和21进行。

本发明的第七方面提供了一种使上述锌指蛋白转录因子的基因沉默的方法，所述方法包括使用1)引物对SEQ NO.22和23、和/或2)引物对SEQ NO.24和25。

本发明的第八方面提供了一种调节植物开花特性或者提高植物抗非生物胁迫耐性的方法，所述方法包括干预上述锌指蛋白转录因子的步骤。所述干预例如可以为过表达所述转录因子或者使所述转录因子的基因沉默。

本发明的第九方面提供了一种载体，所述载体包含上述核苷酸序列。优选的是，所述载体为质粒载体，更优选为质粒表达载体。另外，所述载体可以为微生物载体，例如微生物例如细菌(如大肠杆菌)细胞等。

本发明的第十方面提供了上述锌指蛋白转录因子和/或其基因或其片段在参与调节植物开花特性或提高植物对非生物胁迫耐性上的应用。所述调节植物开花特性例如为促进短日照植物开花、使短日照植物在长日照条件下开花等。例如，通过使植物中的所述锌指蛋白转录因子的基因沉默来使植物表现出对光周期的不敏感性，从而使植物在长日照条件下提前开花。所述非生物胁迫耐性例如为耐旱胁迫耐性或者耐寒胁迫等耐性。例如，通过使植物中所述锌指蛋白转录因子的过表达提高植物对低温和干旱胁迫耐性。在一些优选的实施方式中，所述植物为短日照植物；短日照植物在24小时昼夜周期中，日照长度必须短于一定时数，才能成花的植物。另外优选的是，所述植物为菊花植物。

本发明还提供了对上述锌指蛋白转录因子进行定位的方法，所述方法包括采用引物对SEQ NO.18和19进行。

本发明在第十一方面提供了如上所述的锌指蛋白转录因子或者如上所述的核苷酸序列在参与调控植物开花时间方面的应用。在一些优选的实施方式中，所述基因在菊花中的沉默表现了对光周期的不敏感性，使菊花在长日照条件下开花时间提前；在菊花过过表达该基因提高了对干旱和低温的耐性。

下文将通过实施例对本发明进行进一步的说明。应当理解的是，这些实施例仅仅出于说明目的，不应被理解为是对本发明请求保护的范围的限制。

实施例

1.基因克隆

试验材料是从菊花‘秋艳’(morifolium(Ramat.)KitamuraFall‘Color’)通过茎段再生获得的2个月大的菊花组培苗，从瓶中移出，洗净附着在根系上的培养基，在正常培养条件下炼苗24h(小时)，转移到4℃生长箱中存放6h，整株取样液氮速冻保存在-80℃冰箱，用于RNA的提取。

菊花植株RNA的提取采用Trizol试剂(Invitrogen，USA)，具体操作如下：

A.将0.1g叶片在液氮中充分研磨，加入1ml Trizol，室温放置5min。

B.加入200μl氯仿，剧烈震荡15s(秒)，室温静置分层。

C.4℃12000rpm(转/分钟)离心10min(分钟)，将上层水相转入新的离心管中。

D.加入相同体积的异丙醇，轻柔混匀，室温静置沉淀15min。

E.4℃12000rpm离心10min，在管侧和管底出现胶状沉淀，弃上清。

F.加入1ml75％乙醇洗涤沉淀，4℃7500rpm离心10min，弃上清。

G.室温放置或真空抽干RNA沉淀，不要真空抽干过于干燥，过于干燥会导致RNA溶解度降低。

H.加入40-100μl无RNase的水，用枪头吸打或轻弹管壁将RNA溶解。凝胶电泳检测RNA提取的质量。RNA可置于-80℃保存。

cDNA末端快速扩增(RACE)，RACE试剂盒为Clontech(USA)的SMARTer^TM RACE cDNA Amplification kit，以下步骤详见试剂盒说明书。

(1)RACE cDNA第一链合成

A.在PCR小管中按下表加样：

5’RACE cDNA 3’RACE cDNA

1-3μl RNA 1-3μl RNA

1μl5’-CDS引物(SEQNO.8)1μl3’-CDS引物(SEQ NO.3，具体序列参见下表2，提及其他引物时同样参见下表2)

1μl SMART II Aoligo(SEQ NO.9)

B.加灭菌水至5μl，混匀，稍离心；

C.70℃温育5min；

D.冰浴2min；

E.按下表所列加样至总体积10μl：

F.轻轻混匀，稍离心；

G.42℃温育1.5h；

(2)RACE扩增获得基因的3′和5′序列

A.按下表加样：

B.轻轻混匀，稍离心，加入

5’RACE cDNA或3’RACE cDNA：2.5μl

GSP1(SEQ NO.4/SEQ NO.11)/GSP2(SEQ NO.5/SEQ NO.13)(10μM)：1μl

UPM(SEQ NO.6/SEQ NO.10)/NUPM(SEQ NO.7/SEQ NO.12)(10×)：5μl

PCR反应条件：25循环；94℃30sec(秒)；60℃30sec；72℃2min

将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离，采用Axygen的DNA快速纯化/回收试剂盒回收目的DNA，连接到Promega公司的pGEM-T Easy Vector Systems.转化大肠杆菌，取1μl菌液为模板，进行PCR检测，琼脂糖凝胶电泳分析，显影后有目标条带的对应菌斑为阳性克隆，可以到公司测序并保存备用。

利用SEQ NO.26和SEQ NO.27引物扩增得到CmBBX24全长cDNA序列。

2.基因序列分析

本实验采用同源克隆手段，克隆到了菊花CmBBX2，全长cDNA为1133个核苷酸(见SEQ NO.1)，开放阅读框(ORF，Open Reading Frame)区包含738bp，编码245个氨基酸(见SEQ NO.2)。多序列比对表明，在最为保守的B-Box结构域，它与其他物种的同源性较高，而在非B-Box结构域，同源性较低。基于和拟南芥BBX结构亚组IV八个成员的系统进化分析，所克隆序列与AtBBX24和AtBBX25同源性最高(图2B)，但与AtBBX25同源性为57.09％，与AtBBX24为57.87％，同源性更近，故将其命名为CmBBX24。此外，在最为保守的B-box结构域，CmBBX24与AtBBX24、AtBBX25的同源性均为84.11％，而在特异的非B-box结构域，CmBBX24与AtBBX24、AtBBX25的同源性分别为38.10％和36.73％。这些数据说明，我们克隆到的确实是1个锌指蛋白转录因子编码基因，与已报道的拟南芥中的AtBBX24同源性较高，但与拟南芥BBX基因存在结构上的明显差别。

3.CmBBX24基因表达模式分析

为了研究CmBBX24在不同组织中的表达模式，分别提取菊花叶、花、茎以及根部的RNA。为了研究CmBBX24是否参与到非生物胁迫响应，进行了低温和干旱处理，在相应时间点取菊花的叶片和根部，处理方法如下：

待处理的植株经过12-24h平衡后，放置在相应的处理条件，在相应的时间点上根叶分别取样，液氮速冻后存放在-80℃冰箱。对照处理：植株根部浸在蒸馏水中置于正常培养条件下；冷处理：植株根部浸在4℃预冷的蒸馏水中置于4℃生长箱中；干旱处理：植株裸根放在滤纸上置于正常培养条件下。所有处理的开始时间均为亮灯时刻。

使用ImProm-IITM反转录酶(Promega，USA)合成cDNA，使用oligo(dT)(SEQ No.8)作为反转引物。CmBBX24的PCR扩增引物为引物SEQ NO.14和引物SEQ NO.15。半定量RT-PCR分析使用菊花的泛素(ubiquitin)作为内标，扩增引物为引物SEQ NO.16和引物SEQ NO.17。

PCR反应在25μl体系中进行，使用1μl cDNA作为模板。PCR首先经过95℃初始变性5min，然后经过30(27)个循环的95℃变性30s、54℃(58℃)退火30s和72℃延伸30s，最后经过72℃额外延伸5min。PCR产物在1.2％琼脂糖胶上电泳分离，并通过EB染色显影。

据图3A分析，CmBBX24基因在所有组织中均有表达，但主要集中在叶片和花中，根和茎中的表达量较低。

据图3B分析在叶片中，在正常生长条件下，CmBBX24基因的表达具有节律性，在光照的前3h内表达量较高，随后表现出下降趋势，在12h时表达量最低，在黑暗情况下表达水平重新升高。而低温处理3h后，CmBBX24基因的表达水平迅速升高。失水胁迫处理使CmBBX24基因表达水平短暂上升，之后恢复到原来的表达趋势。同叶片中CmBBX24基因的表达模式类似，在根中，CmBBX24基因的表达也具有一定的节律性，在光照后3h达到高峰，之后表达量降低，并在夜晚重新出现上升趋势。在低温下，虽然在3h存在一个短暂的下降趋势，但是6h之后一直保持较高表达水平。在失水胁迫下，根中CmBBX24基因的诱导模式与叶片相同。我们的结果显示，无论是地上部分还是地下部分，CmBBX24基因受低温胁迫和失水胁迫诱导。

4.亚细胞定位

掌握CmBBX24的细胞内分布情况，以了解其在哪些细胞区室内发挥功能。

细胞定位的详细实验过程如下：

1)载体构建

CmBBX24蛋白亚细胞定位使用pEZS-NL载体(D.Ehrhardt， http：//deepgreen.stanford.edu)。用含特定酶切位点的特异引物(引物SEQ NO.18 和引物SEQ NO.19)扩增CmBBX24基因的ORF序列(去掉终止密码子)，将pEZS-NL和PCR产物经EcoRI和SalI双酶切后连接，生成35S：：CmBBX24-GFP融合序列。将pEZS-NL载体中连接35S启动子和GFP序列的10个串联的丙氨酸(Ala)去除，作为对照载体。

2)质粒-金粉复合体的准备

(1)在无菌离心管中依次加入以下成分(按轰击5次)：金粉悬浮液：50μl；0.1M亚精胺：20μl；2.5M CaCl2：50μl；质粒：2.5μg。

(2)震荡3min；

(3)12000rpm离心20s，去上清；

(4)无水乙醇漂洗2-3次；

(5)60μl无水乙醇悬浮。

3)基因枪轰击和观察

用镊子撕取新鲜洋葱鳞片内表皮，光面向下置于MS培养基上，基因枪轰击后24℃暗培养16h，以蓝光为激发光进行显微镜观察。

亚细胞定位结果：荧光共聚焦显微镜下观察CmBBX24-GFP融合蛋白的亚细胞定位(CmBBX24-GFP：CmBBX24-GFP融合蛋白的亚细胞定位)。结果在激光共聚焦显微镜下拍摄，发现CmBBX24-GFP融合蛋白显著的以斑点的形式定位在细胞核内，而GFP负对照则分布于整个细胞中，说明CmBBX24蛋白是定位在细胞核内的。

5.转基因菊花鉴定和表型观察

为了进一步分析CmBBX24的功能，我们将其转入菊花中，观察转基因菊花与对照相比在开花时间方面的差异。菊花的转化过程如下：

1)载体构建：

构建35S：：CmBBX24载体使用pBIG载体(实验室保存)。用含特定酶切位点的特异引物扩增CmBBX24基因的ORF序列，引物序列为SEQ NO.20和SEQ NO.21。将pBIG和PCR产物经XbaI和SmaI双酶切后连接，生成35S：：CmBBX24载体。

RNAi载体使用pHANNIBAL中间载体和pART27双元载体。首先，PCR扩增正义和反义序列，扩增引物为SEQ NO.22，SEQ NO.23，SEQ NO.24和SEQ NO.25，经XhoI，EcoRI和XbaI，HindIII限制性内切酶酶切后插入到pHANNIBAL载体的Pdk两侧，形成intron containing`hairpin′RNA(ihpRNA)结构。NotI酶切，将含35S：：ihpRNA：：OSC terminater结构的序列插入到pART27载体中。

2)农杆菌介导的菊花转化

菊花遗传转化相关培养基：

IM诱导培养基：MS+1.5mg/lIBA+0.5mg/lBA+0.75mg/l2，4-D；RM分生培养基：MS+1.5mg/lIBA+0.5mg/lBA；DM发育培养基：MS+1.0mg/lKT+0.1mg/lNAA+2mg/lGA3；RTM生根培养基：1/2MS+0.01mg/lNAA。

具体操作方法为：

A.将菊花幼嫩叶片用打孔器打成直径为0.8cm大小的叶盘，接种于IM诱导培养基，预培养2d。

B.挑取含有目的基因农杆菌单菌落置于YEB液体培养基中，于28℃、200rpm悬浮过夜培养，并进行二次摇菌。直到OD600＝0.6。

C.将菌液5000prm离心5min，弃去上层菌液，用1/2MS溶液悬浮洗涤。

D.用1/2MS溶液重新悬浮，至OD600＝0.5。

E.用重新悬浮的菌液侵染经预培养的叶盘10min，并将叶盘转接回IM培养基上，在黑暗条件下(温度为24℃)共培养2d(天)。

F.将经共培养的叶盘转接入IM培养基同时附加10mg/l卡那霉素(Kan)、500mg/l头孢霉素(Cef)，进行诱导和筛选培养。

G.11d后将外植体接种于含10mg/l Km，500mg/l Cef分生培养基RM培养基上继续筛选培养，每隔2周用相同新鲜培养基转接一次，期间观察原初芽形成。

H.将原初芽接种于附加10mg/l Km、250mg/l Cef的发育培养基DM上，使原初芽伸长生长。当Km抗性芽长至1.5cm，转入添加10mg/lkm的生根培养基RTM上进行根生长培养。

I.将抗性苗进行继代繁殖，大量繁殖后一部分保存于组培瓶中，另一部分植于直径为9cm的方盆内用于表型观察。

将35S：：CmBBX24和RNAi载体通过农杆菌介导的转化方法侵染菊花，我们共获得了42个过表达株系和23个RNAi株系。从这些获得的株系中各挑选了3个用作以后的实验分析。以野生型WT植株为阴性对照，通过RT-PCR方法，检测外源CmBBX24基因的表达水平，如图4B所示，过表达株系CmBBX24基因的表达量升高，而RNAi株系中CmBBX24基因的表达量下降。

将菊花生殖生长阶段分为花芽分化、现蕾期、花瓣可见期和开花期四个阶段，如图4A所示，现蕾期以菊花顶端可见花蕾为起始点，花瓣可见期为花蕾发育膨大、花瓣可见的时期，开花期以花瓣展开为起点直至花朵完全开放。转基因与WT菊花在营养生长阶段并没有表现出生长差异，但是在营养生长阶段却出现了明显的差异。如图4所示，RNAi植株表现出明显的早花现象。但有趣的是，过表达菊花却没有表现出预期的晚花表型。

6.过表达CmBBX24菊花的非生物胁迫耐性分析

为了研究CmBBX24是否能增强菊花的非生物胁迫耐性，对过表达的转基因菊花进行了一系列的胁迫处理。

将8叶龄大的菊花组培苗从瓶中移出，洗净附着在根系上的培养基，水中平衡(驯化)2天后移栽至含草炭和蛭石1∶1的9cm X9cm方盆中，置于23℃、16h/8h，RH30％，100μm-2s-1光照条件下生长4周后，进行非生物胁迫处理，处理方式如下：

冷冻胁迫：将菊花植株转移到-6℃的培养箱中冷冻处理8h，4℃过夜，然后恢复到正常条件培养。恢复30d后进行拍照和成活率统计。

干旱胁迫：将菊花植株充分浇水后，保持在干燥不浇水的环境中23d，然后恢复正常浇水。40d后进行拍照和成活率统计。

经冷冻处理的菊花植株，正常温度条件下恢复生长30天后，野生型WT植株达到71.4％成活率，其中大部分(66.7％)成活的植株顶芽死亡，侧芽或脚芽萌发。CmBBX24过表达植株分别达到94.4％、93.3％和88.2％的成活率，且顶芽恢复生长的成活植株多于野生型，但仍以顶芽死亡，侧芽或脚芽萌发的植株居多，生长势明显高于成活的野生型植株(图5)。

图5所示经干旱控水处理的大部分野生型WT菊花植株严重萎蔫，而多数过表达植株只表现出轻微的萎蔫状况。复水后，多数过表达植株恢复生长，而只有少数WT植株恢复生长。经过复水后40d的恢复生长，高于70％，甚至92.5％的过表达植株成活，其中多于50％成活植株复水后直接恢复，少部分成活植株顶芽死亡，恢复一段时间后萌发侧芽或脚芽。WT植株成活率为54.2％，且多数为顶芽死亡，恢复一段时间后萌发侧芽或脚芽的情况，且新芽萌发较晚，发育较慢。

以上结果说明，CmBBX24在植物响应干旱与低温，调节干旱和低温胁迫耐性方面发挥功能。

7.CmBBX24调节开花时间和非生物胁迫的分子调控机理分析

为了深入了解CmBBX24调节开花时间和非生物胁迫的分子机理，进行了RNA-seq技术分析，操作步骤如下：

植物材料选用野生型，过表达以及RNAi沉默菊花各一个株系，每个株系3个重复。将8叶龄大的菊花组培苗从瓶中移出，洗净附着在根系上的培养基，水中平衡(驯化)2天后移栽至含草炭和蛭石1∶1的9cm X9cm方盆中，置于23±1℃、16h/8h，RH30％-40％，80-100μm^-2s^-1光照条件下生长4周后，于亮灯后3h取地上部顶端叶片样本，分别进行总RNA样本的提取、mRNA纯化、打断及文库构建，并送康奈尔大学基因组学研究所进行测序，测序仪器使用Illumina HiSeq2000二代测序仪。

对RNA-seq数据进行处理前，首先去除序列两段的接头，删除一些短于40bp或质量较差的核酸片段，然后通过GenBank病毒库和核糖体(rRNA)数据库的比对，去除病毒及rRNA序列RNA。对得到的高质量RNA-seq数据片段进行拼接，并去除冗余的重复片段。将拼接好的片段与GenBank等数据库进行比对并注释，并利用UniProt数据库进行GO分析。

为了获得最有代表性的CmBBX24调控基因，我们选定过表达植株中上调1.5倍、RNAi植株中下调1.5倍的基因作为主要的研究分析对象。通过RNA-seq，分离得到CmBBX24过表达植株中上调基因3240个，CmBBX24RNAi植株中下调基因3397个，过表达植株中上调且RNAi植株中下调基因234个，其中有162个基因为未知基因。经功能注释的72个基因可以分成两类，一类为调节蛋白，主要为可以进一步调节信号转导和基因表的的蛋白因子，包括转录因子，蛋白激酶以及信号蛋白等(图6)，这一类共包括12个蛋白，其中有2个转录因子，5个信号蛋白，5个蛋白激酶；另一类为调节植物生理生化反应的功能蛋白，包括渗透调节物质、解毒酶类、蛋白酶以及蛋白降解相关蛋白、衰老相关蛋白、蛋白酶抑制剂以及次生代谢相关蛋白等，这一类蛋白共有60个。这72个蛋白中有25个被报道过参与非生物胁迫响应。在RNAi植株中上调的基因中有15个开花相关蛋白，这15个蛋白主要可以划分为3类：赤霉素合成相关、光周期相关以及MADS box家族蛋白(见下表1)。顺便提及的是，MADS-box基因是真核生物中一类重要的转录调控因子，在生长发育调控和信号传导中发挥着重要作用，在植物中参与花器官的发育，开花时间的调节，在果实、根、茎、叶的发育中都起着重要的作用。

本研究克隆了CmBBX24基因，进行了表达特性和生化特性分析。通过在菊花中基因沉默检测了CmBBX24基因对植物开花时间的影响，并对其调节机理进行了解析。CmBBX24N端包含两个串联的B-Box结构域，在C端没有CCT结构域，为BBX家族的结构亚组IV成员。CmBBX24的表达主要集中在叶片和花中，根和茎中的表达水平较低。对于亚细胞地位，CmBBX24蛋白定位于细胞核内，与其作为转录因子的特性相符。CmBBX24在植物响应非生物胁迫，增强非生物胁迫耐性方面起正调控作用，且在调节开花时间方面起负调控作用。对其作用机理进行分析，发现CmBBX24通过上调一系列信号蛋白、蛋白激酶、渗透调节物质、解毒酶，以及次生代谢相关基因表达增强非生物胁迫耐性；RNAi植株通过调节光周期途径、赤霉素途径以及一系列MADS-box基因的表达调控植物的开花时间。

表1显示了CmBBX24-RNAi植株中上调的与开花相关基因分析

Claims

1.一种锌指蛋白转录因子，其中，所述锌指蛋白转录因子与SEQ No.2具有至少50％，例如60％、70％、80％、90％、91％、92％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性；优选的是，所述锌指蛋白转录因子由与SEQ No.1具有至少50％，例如60％、70％、80％、90％、91％、92％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性的核苷酸序列编码。

2.一种核苷酸序列，所述核苷酸序列为编码权利要求1所述的所述锌指蛋白转录因子；优选的是，所述核苷酸序列与SEQ No.1具有至少50％，例如60％、70％、80％、90％、91％、92％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性。

3.用于对权利要求1所述的锌指蛋白转录因子或权利要求2所述的核苷酸序列进行克隆、检测、定位、过表达或沉默的引物或者引物对，所述引物包含SEQ No.3；所述引物对选自由如下引物对组成的组：引物对SEQ NO.4和6、引物对SEQ No.5和7、引物对SEQ NO.8和9、引物对SEQ NO.10和11、引物对SEQ NO.12和13、引物对SEQ NO.14和15、引物对SEQ NO.16和17、引物对SEQ NO.18和19、引物对SEQ NO.20和21、引物对SEQ NO.22和23、引物对SEQ NO.24和25、引物对SEQ NO.26和27。

4.一种克隆权利要求1所述的锌指蛋白转录因子或权利要求2所述的核苷酸序列的方法，所述方法包括使用选自由如下引物或者引物对组成的组：所述引物包含SEQ No.3；所述引物对选自由如下引物对组成的组：引物对SEQ NO.4和6、引物对SEQ No.5和7、引物对SEQ NO.8和9、引物对SEQ NO.10和11、引物对SEQ NO.12和13、和引物对SEQNO.26和27。

5.一种检测权利要求1所述的锌指蛋白转录因子或权利要求2所述的核苷酸序列的方法，所述方法采用1)引物对SEQ NO.14和15、和/或2)引物对SEQ NO.16和17。

6.一种过表达权利要求1所述的锌指蛋白转录因子的基因的方法，所述方法包括使用引物对SEQ NO.20和21进行。

7.一种使权利要求1所述的锌指蛋白转录因子的基因沉默的方法，所述方法包括使用1)引物对SEQ NO.22和23、和/或2)引物对SEQ NO.24和25。

8.一种调节植物开花特性与非生物胁迫耐性的方法，所述方法包括使权利要求1所述的锌指蛋白转录因子过表达或沉默的步骤。

9.一种载体，所述载体包含如权利要求2所述的核苷酸序列；优选的是，所述载体为质粒载体，更优选为质粒表达载体；另外优选的是，所述载体为微生物载体。

10.如权利要求1所述的锌指蛋白转录因子或者如权利要求2所述的核苷酸序列在参与调节植物开花时间或提高植物对非生物胁迫耐性尤其是耐旱和/或耐寒上的应用。