CN109777805A - 矮牵牛锌指蛋白基因PhZFP1及其在提高植物抗寒性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种矮牵牛锌指蛋白基因PhZFP1及其在提高植物抗寒性中的应用。从抗寒的矮牵牛“H”中克隆出基因PhZFP1，其核苷酸序列为SEQ ID.1所示，利用农杆菌介导的遗传转化方法转化矮牵牛，获得的转基因植株，通过测定电导率、低温处理存活率等以及NBT染色，发现PhZFP1超表转基因株系抗寒性显著提高，突破了传统育种手段的障碍，为植物抗寒基因工程提供了重要的基因资源。

Description

矮牵牛锌指蛋白基因PhZFP1及其在提高植物抗寒性中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种从矮牵牛(Petunia hybrida)中分离、克隆的一个含有两个典型的C2H2型锌指结构域的锌指蛋白基因PhZFP1，还涉及PhZFP1基因在提高植物抗寒性中的应用。

背景技术

低温是限制植物生长、发育、产量及地理分布的主要环境因子之一，也是作物在生长发育过程中经常遇到的一种自然灾害。在漫长的进化过程中，植物形成了一套复杂而有效的防御机制，来适应低温，主要包括对外界低温信号的感知、信号转导以及转录调控等阶段(Hannah,etal.,2005)。低温被植物细胞膜感知后，低温信号主要通过Ca²⁺继续向下游传递，引起胞质Ca²⁺水平增加，之后经不同的信号元件转导，信号放大等传达过程，最终导致一系列的冷响应基因的表达，并通过生理形态改变来适应胁迫环境条件。与应激反应相关的基因大致可分为两类：一类是直接保护组织细胞免受伤害的功能蛋白基因，另一类则是编码调控蛋白的基因，如对目的基因表达进行调控的转录因子。

锌指蛋白(zinc-finger protein)转录因子是普遍存在于所有生物中的一类DNA结合蛋白，是转录因子中研究得较为深入的类型(Yang et al 2004)，在植物、果蝇(Lianget al 2008)、酵母(Mazauric et al 2010)和病毒(Morellet et al 2006)等都有相关报道。锌指蛋白具有可以稳定结合Zn²⁺，并能完成自我折叠成“手指”的锌指结构域。锌指蛋白主要通过与核酸的相互作用来发挥不同的功能，如促进或抑制转录、与RNA/DNA双向结合或与单链DNA结合(Laity et al 2001)。

而C2H2型锌指蛋白在植物锌指蛋白中是比较常见的一种类型，通常具有1-9个串联的锌指结构，且每个锌指结构中包含有保守的氨基酸序列，由于最初发现于TFⅢA因子中，所又称为TFⅢA类型锌指或经典锌指。大部分C2H2型锌指蛋白锌指结构普遍为C-X2-4-C-X3-P-X5-L-X2-H-X3-5-H(C表示半胱氨酸，H表示组氨酸，L表示亮氨酸，P表示苯丙氨酸，X表示任意氨基酸)，核磁研究表明，两个半胱氨酸和两个组氨酸与锌原子形成配位键，进而形成一个包含β发夹和一个α螺旋的紧密指状结构，形似“手指”。植物C2H2型巧指蛋白除了含有锌指结构外，一般还含有以下几个区域：一个核定位信号区NLS(也称B-box)，一个富含Leu的L-box，一个靠近C端的DLN-box。其中，NLS是功能区，与亚细胞定位相关，L-box可能是与蛋白质相互作用有关的功能区，DLN-box是疏水性转录阻遏域，可能与转录抑制活性相关的区域。然而并不是所有的植物C2H2型蛋白都有这些功能保守区域，有些没有NLS，有些没有DLN-box，有些没有L-box(赵丽娟，易小娅，曾幼玲，2016；Yanover,Bradley,2011)。有研究发现，拟南芥的AtZFP11(C2H2型转录因子蛋白)缺失NLS(B-box)区域后，该蛋白无法与GFP蛋白发生融合而在核内定位表达(Tavva,et al,2008)。若植物C2H2型锌指蛋白缺失DLN-box，则会抑制其转录活性(Sakamoto,et al,2004)。

低温可以诱导某些C2H2锌指蛋白基因产生功能从而令其能够耐低温胁迫，比如低温胁迫下，拟南芥中多条信号转导通路被激活(Thomashow,2010)。转录因子CBFs(CBF1,CBF2和CBF3)的表达受到ZAT12抑制(Vogel,et al,2005)，CBF3表达量下调。降低CBF3的表达会导致ZAT10/STZ(另一个C2H2型锌指蛋白)的表达量降低。而ZAT10/STZ又能够与CBF下游靶基因启动子中的顺式作用元件结合，直接调控CBF下游靶基因的表达(如RD29A的表达受到抑制)。基于多个冷胁迫相关C2H2锌指蛋白转录因子之间的相互作用，说明ZAT12位于ZAT10/STZ上游(Lee,et al,2002)。同时，ZAT12也可能与CBFs调控通路无关，独立调控CBFs的靶基因的表达(Kie\lbowicz-matuk,2012)。另外在低温敏感型拟南芥突变体中，锌指蛋白基因CSDP1和CSDP2的过量表达使其获得了低温耐受能力(Park,et al,2009)。Zhang等(Zhang,et al,2011)把番茄锌指蛋白基因SICZFP1转入水稻和拟南芥，发现均转化植株的耐低温胁迫能力要强于野生型，说明SICZFP1基因参与低温胁迫环境下的分子调控过程。所有这些研究表明，C2H2型锌指蛋白转录因子在低温响应中发挥有重要作用，在利用基因工程提高植物抗逆性方面有很大的潜力。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种从极抗寒矮牵牛“H”株系中分离克隆出的C2H2型锌指蛋白类转录因子基因(申请人将其命名为PhZFP1)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，其长度744bp。

本发明的另一个目的是提供了一种C2H2型锌指蛋白转录因子基因PhZFP1在提高矮牵牛抗寒中的应用。构建该基因的超量表达载体，并通过农杆菌介导法将其转入矮牵牛，鉴定其抗寒功能，为矮牵牛抗逆分子育种提供新的资源。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术手段：

设计引物从矮牵牛“H”株系中扩增出PhZFP1基因，其核苷酸序列为SEQID NO.1所示，其长度744bp，其编码的氨基酸序列如序列SEQ ID NO.2所示，编码247个氨基酸，预测的分子量为26.3kD。

设计1对含部分UTR区的外侧引物，其核苷酸序列如下所示：

正向引物：5’-GCTCACACTCAAAACAACTTCCATTC-3’

反向引物：5’-GCCTTTATCTTCATCAAGCCCTACA-3’

利用农杆菌介导的遗传转化方法转化矮牵牛野生型“W115”，获得的转基因植株经生物学功能验证，表明本发明所克隆的PhZFP1基因具有提高抗寒性的功能。在本发明的实施案例部分，我们阐述了矮牵牛PhZFP1基因的分离、功能验证和应用。

与现有技术相比，本发明有以下优点：本发明利用转基因技术得到抗寒性提高的矮牵牛株系，突破了传统育种手段的障碍；此外本发明的基因在矮牵牛中抗性稳定，为矮牵牛抗寒分子机制研究提供理论依据，同时为矮牵牛抗寒基因工程提供重要的基因资源。

附图说明

图1为本发明的技术流程图。

图2为PhZFP1组织特异性表达以及逆境诱导表达分析

其中，图2A PhZFP1基因在矮牵牛“H”(未转基因)不同器官组织中的表达，图2B是矮牵牛“H”(未转基因)组培苗2℃处理下，相应时间点取样，采用实时定量PCR分析本发明基因的相对表达量；图2C是矮牵牛“H”(未转基因)组培苗室温下脱水不同时间点下本发明基因的表达模式；图2D是矮牵牛“H”(未转基因)组培苗在200mM NaCl处理下不同时间点下本发明基因的表达模式；图2E是矮牵牛“H”(未转基因)组培苗在400mM甘露醇处理下不同时间点本发明基因的表达模式；图2F是矮牵牛“H”(未转基因)组培苗在100μM ABA喷施处理0h、3h、6h、12h和24h下本发明基因的表达情况；图2G是矮牵牛“H”(未转基因)组培苗在100μMMeJA的激素喷施处理下不同时间点下本发明基因的表达模式。

图3为PhZFP1超量表达载体的构建图谱

其中，图3A为本发明的超量植物表达载体pCAMBIA2300s结构示意图；

图3B为本发明的超量植物表达载体pCAMBIA2300s-PhZFP1构建示意图。

图4为PhZFP1转化矮牵牛过程

其中4A是矮牵牛共培的叶块，4B是筛培中产生的愈伤组织及抗性芽，4C是抗性芽转入生根培养基，4D是抗性芽生根，4E是组培苗下地。

图5为PhZFP1转化矮牵牛再生植株的PCR鉴定图。

图6为部分鉴定阳性植株中PhZFP1转基因株系T₀代表达量结果图。

图7为PhZFP1超表株系T1代抗性分离比筛选及电导率的测定

其中，图7A是PhZFP1超表株系T0代自交收种T1代在1/2MS培养基(100mg/L卡纳霉素)平板生长情况，假阳性出现黄化；图7B转基因株系T1代#11，#48与野生型WT离体叶盘在-2℃处理下的电导率的测定结果图。

图8为部分超表株系T2代PhZFP1表达量检测图。

图9为PhZFP1超表株系T2代抗寒性鉴定

其中，图9A分别为非驯化组转基因株系#48-3，#48-4与WT在-4℃处理前，处理6h、过夜解冻后，恢复7d后的表型图；图9B分别是驯化组转基因株系#48-3，#48-4与WT在-6℃处理前，处理6h、过夜解冻后，恢复7d后的表型图；图9C是非驯化组与驯化组转基因株系#48-3，#48-4与WT经低温处理而后恢复7-9d的存活率统计情况；图9D是转基因株系#48-3，#48-4与WT打孔叶盘在-2.5℃处理下的电导率测定图；图9E是2℃驯化后转基因株系#48-3，#48-4，#48-7与WT的打孔叶盘NBT染色结果图。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例1分离克隆PhZFP1基因

课题组前期对保存的矮牵牛自交系进行了抗寒性评价，从中筛选出较抗寒的株系“H”(Li B,Ning L,Zhang J,Bao M,Zhang W.Transcriptional profiling of Petuniaseedlings reveals candidate regulators of the cold stress response.Frontiersin Plant Science.2015；6:118.)，并利用低温胁迫下“H”的表达谱芯片初步筛选出冷响应途径中的候选基因PhZFP1。以表达谱芯片数据中获得的一段EST序列为信息探针，在矮牵牛数据库中分别与基因组序列和转录组序列进行比对，分析获得锌指蛋白基因PhZFP1的CDS序列，且发现该基因不含有内含子，用PrimerPremier 5软件设计1对含部分UTR区的外侧引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

P1正向引物：5’-GCTCACACTCAAAACAACTTCCATTC-3’

P2反向引物：5’-GCCTTTATCTTCATCAAGCCCTACA-3’

由于PhZFP1不含有内含子，故以精提的矮牵牛“H”DNA为模板进行克隆，扩增得到PhZFP1片段。总DNA的提取采用CTAB法，具体步骤如下：

1)称取0.1g植物叶片，置于磨样管中，用组织破碎仪磨碎；

2)吸取700μLCTAB溶液(使用前加入2％的巯基乙醇并65℃预热10min)加到磨样管中，65℃水浴30min，期间每隔10min上下颠倒混匀一次；

3)冷却至室温10000r/min离心10min；

4)取600μL上清，在通风橱加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿：异戊醇体积比24：1)，颠倒混匀，静置10min；

5)10000r/min离心10min；

6)快速转移上清(300-400μL)至新的1.5mL离心管，加入两倍体积的无水乙醇，轻轻摇匀；

7)静置沉淀10min，10000r/min离心10min；

8)弃上清，取沉淀加入500μL 75％的乙醇，静置5min；

9)10000r/min离心2min弃上清；

10)取沉淀加入500μL无水乙醇，静置5min；

11)10000r/min离心2min弃上清；

12)置于吸水纸上倒置晾干后加入30μL双蒸水溶解，并加入1μL RNA酶37℃温浴30min。

扩增程序如下：94℃预变性4min；94℃变性30s，退火温度58℃复性30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。将扩增获得的PCR产物连入18-T载体(购自宝生物工程大连有限公司)，筛选阳性克隆并测序，获得PhZFP1基因全长序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，长度744bp，其编码的氨基酸序列如序列SEQ ID NO.2所示，编码247个氨基酸，预测的分子量为26.3kD。

实施例2PhZFP1组织表达谱与诱导表达谱分析

根据矮牵牛数据库中获得的基因序列和实时定量PCR引物要求设计，用PrimerPremier 5软件设计1对特异引物，正向引物：5’-CCTCCACCTCTGCCACCACTT-3’，反向引物：5’-CACCGTTGCCGCCATCATAA-3’。采用RT-PCR的试验方法对候选基因PhZFP1进行组织表达谱及诱导表达谱分析。

总RNA的抽提及总RNA的反转录反应分别采用艾德莱公司生产的EASYspin植物RNA快速提取试剂盒和TaKaRa公司生产的PrimeScript^TM RTReagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒，具体步骤按照说明书进行。实时定量PCR反应在ABI 7500fast荧光检测系统中进行，操作步骤按照TaKaRa SYBRPremix Ex Taq^TM试剂盒使用说明完成。反应体系为10μL，其中1μL的cDNA模板、0.2μL正反向引物、5.2μL SYBR Premix Ex Taq^TM(2×)、ddH₂O补足10μL。实时定量PCR以矮牵牛GAPDH为内参(扩增引物为正向引物5’-CAAGGCTGGAATTGCTTTGAG-3’，反向引物：5’-CACCACTTTACTCCACTGATGCA-3’)，数据处理按照内参的ΔCT法分析(Livakand Schmittgen2001)。每个样品设3个重复。

利用实时定量PCR对PhZFP1在矮牵牛“H”根、茎、叶芽、成熟叶、老叶及花中的表达量进行检测，发现PhZFP1在根中的表达最为明显，具体见图2A。

同时，对“H”无菌苗进行低温、干旱、高盐、高渗胁迫处理和ABA、JA激素处理后，使用荧光实时定量PCR对PhZFP1锌指蛋白进行了表达差异分析。从图2B-2G可以发现：PhZFP1显著地，并且特异地只受到低温强烈诱导，而对其他逆境胁迫基本没有响应或者略有下调。

实施例3 PhZFP1超量表达载体的构建

将PhZFP1连接pMD 18-T载体后测序正确的质粒，经Sal1和BamH1双酶切，连接到植物表达载体pCambia2300s(由本实验室保存，见图3A)。以35S引物(5’-ACGCACAATCCCACTATCCTTC-3’)与目的基因外侧下游引物：5’-GCCTTTATCTTCATCAAGCCCTACA-3’配对进行菌落PCR检测，挑取阳性菌摇菌抽提质粒，经酶切验证获得构建成功的p2300-PhZFP1载体(具体见图3B)，并且将菌液与50％的甘油按7:3的体积比混合，放-80℃保存备用。然后将重组质粒电转到农杆菌菌株EHA105(由本实验室保存)。

实施例4矮牵牛遗传转化

采用叶盘转化法对矮牵牛W115(Petunia hybrida cv.‘Mitchell diploid’)(Griesbach RJ,Kamo KK(1996)The effect of induced polyploidy on the flavonolsof Petunia‘Mitchell’.Phytochemistry 42:361–363)进行遗传转化，具体步骤如下(转化所用培养基配方见表1)：

(1)选取6-8周大矮牵牛材料中上部，平展翠绿的实生苗叶片作为外植体进行遗传转化；

(2)外植体消毒：依次是蒸馏水冲洗3遍，75％酒精处理40s，0.1％升汞消毒7～8min，无菌水洗3遍；

(3)将叶片切去主叶脉和边缘部分，再切成1厘米见方的小块，切的过程中边将切好的小叶块儿夹到共培皿中，以防失水萎蔫；

(4)将摇好的菌液(OD值0.6～0.8)用无菌水稀释到50mL后倒入放小叶块儿的共培皿中，要求与菌液充分接触，静置30min；

(5)将侵染好的叶块儿夹到灭过菌的滤纸上吸去过量菌液，然后夹到共培皿中，近轴面朝上，包膜后放置暗培室共培3天；

(6)3天后转到选培皿中进行愈伤诱导；

(7)将分化出的抗性芽转到生根培养基中进行生根诱导。

愈伤，生根诱导均在24℃，16h光照/8h黑暗条件下进行，且整个遗传转化过程见图4。

表1矮牵牛转化培养基配方

实施例5阳性矮牵牛初步鉴定

按照上述方法得到转PhZFP1抗性生根苗，提取DNA(具体步骤见实施例1)。首先以上述正向引物35S(5’-ACGCACA ATCCCACTATCCTTC-3’)与PhZFP1外侧下游引物：5’-GCCTTTATCTTCATCAAGCCCTACA-3进行PCR扩增，鉴定阳性苗(见图5)。然后采用荧光定量方法(见实施例2)对初步鉴定的阳性植株T0代进行PhZFP1表达量检测，从图6中发现只有极少数转基因株系表达量上调(矮牵牛中经常存在有共抑制的现象)，再自交收种获得种子(T1代)。

后续我们挑选了表达量相对较高的株系#OE-11，#OE-48，#OE-42等进行后续卡那霉素平板筛选、分离比筛选，具体步骤如下：选取饱满的转基因株系及野生型W115矮牵牛种子，消毒(依次是8％次氯酸钠6-8min，95％乙醇50s重复两次，无菌水冲洗3-5遍)后分别均匀点播在含100mg/L卡那霉素(km)1/2MS培养基和1/2MS培养基上，每皿40粒，放于25℃光照培养室。培养室放置3-4周，在培养皿内萌发且子叶及真叶均保持绿色的植株即为转化植株，非转化植株其子叶及真叶会变为黄白色(图7A)，然后统计分离比并移栽。经过卡方检验后即可找出符合3:1的单拷贝株系(见表2)。从单拷贝筛选结果中，选择#OE-48进行抗性平板筛选，自交收种获得#48-1，#48-3，#48-4，#48-7等T2代。

表2 PhZFP1超表株系T1代抗性分离比筛选

实施例6转基因植株T1离体叶片电导率的测定

为初步确定PhZFP1是否使转基因株系抗寒性增强，我们对转基因株系T1代#11，#48进行电导率的测定，操作步骤如下：取转基因株系T1代与野生型矮牵牛相同部位的叶片用蒸馏水冲洗2-3次，用吸水纸吸干叶片表面的水分，打孔成叶盘(直径1cm)，放入冰上预冷的盛有500μL超纯水的15mL带盖玻璃管中。每管放有4个叶盘，每转基因株系设4个重复，并每组设置对照组0℃(加叶盘置于冰上)。将试管放入低温水浴锅(Huber，CC-K20，德国，液体媒介为34％的乙二醇溶液)。水浴锅初始温度设置为-1℃，保持30min，然后向每玻璃管(包括对照组)中加入冰晶(加ddH₂O于PCR板，低温冻成冰晶)，之后-1℃维持60min，而后匀速降温至-2℃(预实验中野生型株系的半致死温度)，降温速率为-0.5℃/3 0min。将所有处理完的试管置于冰上，放在冰上解冻3h。解冻后往玻璃试管中加入4.5mL ddH₂O，颠倒混匀后将所有玻璃试管中的所有溶液一起转入预先加入过20mL ddH₂O的50ml离心管中。室温下在试管翻转混合器上80r/min转1h后，静置后用电导仪(梅特勒，FE30-K，瑞士)测一次电导率记为S1；沸水浴10min彻底破坏叶片细胞后冷却至室温，再测一次电导率，记为S2。样品的相对电导率值计算公式为EL(％)＝100％×S1/S2。

低温胁迫下，植株细胞膜是受伤害最早也最严重的指标，相对电导率是反应细胞膜受伤害程度的重要指标之一。我们对两个超表PhZFP1的表达量较高的T1代株系#OE-48与#OE-11以及野生型进行离体叶片电导率的测定，由图7B可知，-2℃处理，#OE-48与#OE-11两个转基因株系离体叶片的相对电导率分别为31.2％，43.0％，均显著低于野生型。

实施例7转基因植株T2代抗寒性评价

为了验证该基因在抗寒中的功能，首先我们对经过Km平板筛选4周，移栽入土正常生长2-3周的部分超表T2代株系进行了目的基因的表达量检测(图8)，发现大部分T2代株系PhZFP1表达量都有上调。选择超表达株系T2代：#48-3，#48-4进行低温处理表型鉴定。具体方法如下：将转基因材料与野生型平均分成两组：驯化组，非驯化组。非驯化组直接进行低温处理(-4℃)6h，驯化组依次经过16℃，9℃，4℃驯化一周，而后进行低温处理(-7℃)6h，经过低温处理的材料都要放4℃过夜解冻，之后放入培养箱正常培养。

低温处理主要包括三步：首先，在黑暗条件下，用预设的温度-4℃(非驯化组)或-7℃(驯化组)处理矮牵牛6h，4℃过夜解冻后把材料转移到正常的生长条件下恢复7-9d并统计存活率，分别于低温处理前、解冻后和恢复后拍照。

驯化组与非驯化组在低温处理前，各超表达株系植株生长发育同野生型对照没有明显的差异。非驯化组-4℃处理6h，4℃过夜解冻后，超表达株系与野生型都受到冻害出现叶片萎蔫，但超表达株系总体萎蔫受害程度要轻于野生型(图9A)；驯化组-7℃处理6h，4℃过夜解冻后，转基因株系大部分叶片正常伸展开，几乎看不出受到冻害有萎蔫的症状，而野生型全部萎蔫，叶片水渍化严重(图9B)。之后正常生长恢复7-9d，统计非驯化组转基因株系T2代#48-3，#48-4存活率分别为33.5％、41.7％，显著大于野生型的存活率16.7％；低温驯化后转基因与野生型抗寒能力都增加，驯化组转基因株系存活率达80％左右，远大于野生型的存活率25％(图9C)。

此外选取转基因株系T2代#48-3，#48-4各4株，混合采样来测定-2.5℃处理下离体叶片的电导率(图9D)。由图可见，在冰上放置(0℃)的电导率，转基因株系与野生型间差异不显著，而-2.5℃处理下的叶盘，转基因株系电解质释放程度都小于野生型，综上所述，PhZFP1可以提高矮牵牛的耐寒性。

实施例8转基因植株T2代低温处理NBT组织化学染色

取2℃驯化后野生型和转基因矮牵牛株系T2代#48-3，#48-4，#48-7相同部位的叶片，打孔成直径2cm叶盘用于染色。每个处理三次重复，每重复3片叶片。O₂ ^-的检测采用NBT(氮蓝四唑)染色法：叶片浸入10mM的硝酸钾缓冲液中(pH7.8)，抽真空30min后25℃暗处孵育1-2h。染色结束后，倒去染液，加入由乙醇：冰醋酸：甘油(体积比3:1:1)配成的脱色液于95℃煮15min以便除去叶绿素，可重复脱色1-2次至叶绿色完全去除，观察拍照。从图9E可以看出，2℃驯化NBT染色后，转基因株系叶盘产生的深蓝色斑点明显少于野生型，说明转基因株系在低温下积累的O₂ ^-含量少于野生型。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 矮牵牛锌指蛋白基因PhZFP1及其在提高植物抗寒性中的应用

<130> 矮牵牛锌指蛋白基因PhZFP1及其在提高植物抗寒性中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcccttg aagcgttgaa ttcccctact accccaactc caccatcgtt tcagtttgac 60

aaaaccagtt acaattacct tgaccagtct tggactaagg gcaagagatc aaaaagacct 120

cgcagtatta atgatccaca agtagctata cctagtgagg aagaatacat ggctctctgc 180

ctaatcatgc ttgctcgtag cggcgctggt tcttcttctt ctcctacttc acccttattc 240

acttctccac caccgcggtc tcaagttata atcactacta cttcctcaaa ggccgtatcg 300

tacaagtgca ctgtatgtgg caaagcgttt gggtcatatc aagctttagg aggacacaaa 360

gccagtcacc gtaataaact tatcgttgat gacgtgtcca caacctccac ctctgccacc 420

acctccgcaa ccgctgccgc tacaagctcg ggtagtggaa ggactcatga gtgcagtatt 480

tgccacaagt gttttcctac tggacaggct ttgggtggtc acaagaggtg tcattatgat 540

ggcggcaacg gtggcggggg agcagtgaca tcatcggagg gttttggttc tacaactaca 600

aacagtcgcc gtgagtttga cttgaacatc cccgccttgc cggaattctt gccgggtttt 660

agctccggcg aggatgaggt ggaaagtcca catccagcca agaaagcgcg gctgtttcta 720

ccaactaaac ttcagttatt ctaa 744

<210> 2

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Leu Glu Ala Leu Asn Ser Pro Thr Thr Pro Thr Pro Pro Ser

1 5 10 15

Phe Gln Phe Asp Lys Thr Ser Tyr Asn Tyr Leu Asp Gln Ser Trp Thr

20 25 30

Lys Gly Lys Arg Ser Lys Arg Pro Arg Ser Ile Asn Asp Pro Gln Val

35 40 45

Ala Ile Pro Ser Glu Glu Glu Tyr Met Ala Leu Cys Leu Ile Met Leu

50 55 60

Ala Arg Ser Gly Ala Gly Ser Ser Ser Ser Pro Thr Ser Pro Leu Phe

65 70 75 80

Thr Ser Pro Pro Pro Arg Ser Gln Val Ile Ile Thr Thr Thr Ser Ser

85 90 95

Lys Ala Val Ser Tyr Lys Cys Thr Val Cys Gly Lys Ala Phe Gly Ser

100 105 110

Tyr Gln Ala Leu Gly Gly His Lys Ala Ser His Arg Asn Lys Leu Ile

115 120 125

Val Asp Asp Val Ser Thr Thr Ser Thr Ser Ala Thr Thr Ser Ala Thr

130 135 140

Ala Ala Ala Thr Ser Ser Gly Ser Gly Arg Thr His Glu Cys Ser Ile

145 150 155 160

Cys His Lys Cys Phe Pro Thr Gly Gln Ala Leu Gly Gly His Lys Arg

165 170 175

Cys His Tyr Asp Gly Gly Asn Gly Gly Gly Gly Ala Val Thr Ser Ser

180 185 190

Glu Gly Phe Gly Ser Thr Thr Thr Asn Ser Arg Arg Glu Phe Asp Leu

195 200 205

Asn Ile Pro Ala Leu Pro Glu Phe Leu Pro Gly Phe Ser Ser Gly Glu

210 215 220

Asp Glu Val Glu Ser Pro His Pro Ala Lys Lys Ala Arg Leu Phe Leu

225 230 235 240

Pro Thr Lys Leu Gln Leu Phe

245

Claims (3)

1.一种矮牵牛基因PhZFP1，其特征在于，序列为SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的矮牵牛基因PhZFP1编码的蛋白质，其特征在于，氨基酸序列为SEQID NO.2所示。

3.权利要求1所述的矮牵牛基因PhZFP1在提高矮牵牛抗寒性中的应用。