CN103509804B - 沙冬青低温胁迫相关基因及其表达载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了沙冬青低温胁迫相关基因及其表达载体和应用，属于植物抗逆相关基因的分离及其应用领域。本发明提供了从沙冬青中分离的与低温胁迫相关的基因，其cDNA序列为SEQ ID No.1所示，所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。本发明还提供了含有该基因的重组植物表达载体以及含有该重组植物表达载体的宿主细胞。本发明进一步提供了一种提高或改善植物抗低温胁迫的方法，包括：构建含有所述基因的重组植物表达载体；将所述重组植物表达载体转化到受体植物或植物细胞中，培育筛选得到转基因植物品种。本发明所分离的沙冬青温度相关基因在提高植物对环境胁迫抗性或培育抗低温胁迫植物品种等方面具有重要的应用潜力。

Description

沙冬青低温胁迫相关基因及其表达载体和应用

技术领域

本发明涉及从高等植物中分离的温度相关基因，尤其涉及从沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus(Maxim.)Cheng f.）中分离的与低温胁迫相关的基因，本发明进一步涉及含有该与低温胁迫相关的基因的重组植物表达载体以及它们在提高植物低温胁迫抗性中的应用，属于植物抗逆相关基因的分离及其应用领域。 

背景技术

自然界中，植物不可避免会遭受各种环境因子的胁迫，如低温、高温、干旱和高盐等非生物胁迫都极易通过影响植物细胞膜成分，气孔开度等生理、生化过程对植物造成伤害，严重时会影响作物的产量和种植区域。冷害、干旱、高温、盐渍等非生物逆境是全球农业生产面临的严重问题，也是制约我国农业发展的重要因素。其中低温是一个非常重要的环境因子，很大程度上影响植物的生长发育、生存及分布，是限制作物的地理分布，并造成作物产量与质量下降的重要因素之一（Thomashow,1999）。低温胁迫会影响许多基因的表达：一方面低温胁迫直接影响代谢基因的表达；另一方面低温胁迫会引起其它胁迫的发生，由此与这些胁迫相关的基因受到低温胁迫的间接诱导。世界上每年因冷害造成的农业损失高达数千亿美元。因此植物的抗寒机理以及提高植物抗寒性的研究一直是植物抗逆性研究的一个热点。 

沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus(Maxim.)Cheng f.）是中国温带荒漠地区惟一的常绿灌木，是草原化荒漠区特有的古老荒漠残遗植物种，分为蒙古沙冬青(A．mongolicus)和新疆沙冬青(A．nanus)两个种，主要分布在我国西北地区的沙漠、荒漠区。沙冬青具有抗高温、抗低温、抗旱、耐盐碱等特性，能忍受地表温度高达70℃和气温在－20～－30℃范围的低温，能在年降雨量不足200mm的环境中正常生长，是开展植物逆境胁迫研究和抗逆基因筛选的理想材料。 

植物逆境胁迫是一个复杂的生理过程，植物对逆境胁迫的适应是一种综合反应，包含信号感受系统、信号传导系统、受体蛋白的激活、抗性基因的激活等一系列过程，是一个涉及多基因参与的过程。目前人们已经从植物中分离、克隆了多种逆境胁迫相关的基因，包括：调节基因，如与转录起始相关的各种转录因子合成基因；功能蛋白类基因，如孔道蛋白、载体蛋白、输送蛋白；细胞内溶物合成基因，如的可溶性糖合成相关基因等等。沙冬青抗逆研究方面，抗旱基因的研究和筛选主要集中在生理研究；抗寒研究方面，已从沙冬青中成功获得抗冻蛋白（费云标，1994）、胚胎发生晚期胚胎富集蛋白（1ate embryogenesis abundant protein，LEA）和AmCBL1(calcineurin B.1ike protein)（孙燕，2005）等冷诱导蛋白，以及冷诱导转录因子AmCBF（Wang Z L2006）等调节基因。迄今为止，未见文献报道从沙冬青中分离得到与低温胁迫相关的基因。 

发明内容

本发明目的之一是提供一种从沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus(Maxim.)Cheng f.）中分离的 与低温胁迫相关的基因。 

本发明目的之二是提供含有上述基因的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞。 

本发明目的之三是将所述的低温胁迫相关基因应用于提高或改善植物的低温胁迫抗性或培育耐低温或耐寒的植物新品种。 

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的： 

一种从沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus(Maxim.)Cheng f.）中分离的与低温胁迫相关的基因，其cDNA序列为（a）、（b）或（c）所示: 

（a）、SEQ ID No.1所示的核苷酸； 

（b）、编码SEQ ID No.2所示氨基酸的核苷酸； 

（c）、与SEQ ID NO:1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的核苷酸，该核苷酸所编码蛋白质的氨基酸为SEQ ID NO:2所示。 

优选的，本发明所述的从沙冬青中所分离的与低温胁迫相关基因的cDNA序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸。 

本发明目的之二是提供由上述与低温胁迫相关基因所编码的能够提高植物低温胁迫胁迫抗性的蛋白质，其氨基酸序列为（a）或（b）所示: 

（a）、SEQ ID No.2所示的氨基酸； 

（b）、将SEQ ID No.2所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有SEQ ID No.2所示能够提高植物抗低温胁迫功能或活性的蛋白变体。 

本发明中所述“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高（例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100%互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献（Tijssen,Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点（T_m）约5-10℃。T_m为在平衡状态下50%与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度（在指定离子强度、pH和核酸浓度下）（因为目标序列过量存在，所以在T_m下在平衡状态下50%的探针被占据）。严谨条件可为以下条件：其中在pH7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度（或其它盐），并且温度对于短探针（包括（但不限于）10到50个核苷酸）而言为至少约30℃，而对于长探针（包括（但不限于）大于50个核苷酸）而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50%甲酰胺，5×SSC和1%SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1%SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1%SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。 

本发明中所述的“多个”通常意味着2-8个，优选为2-4个，这取决于蛋白三维结构中氨基酸残基 的位置或氨基酸的种类；所述的“替换”是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基；所述的“缺失”是指氨基酸残基数量的减少，也即是分别缺少其中的一个或多个氨基酸残基；所述的“插入”是指氨基酸残基序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基。 

本发明所述的蛋白变体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本领域所了解。例如，可通过DNA的突变来制备氨基酸序列变体或片段，其中由于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。其中，保守的取代是将一种氨基酸残基替换成具有相似性质的另一种氨基酸。 

本发明还提供了含有所述与低温胁迫相关的基因的重组植物表达载体以及含有该重组植物表达载体的宿主细胞。 

将所述与低温胁迫相关的基因可操作的与表达调控元件相连接，得到可以在植物中表达该基因的植物表达载体。“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。该植物表达载体可以由5′端非编码区，SEQ ID No.1所示的核苷酸和3′非编码区组成，其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。 

另外，本领域技术人员可以将SEQ ID No.1所示的核苷酸进行优化以增强在植物中的表达。例如。可采用目标植物的偏爱密码子进行优化来合成多核苷酸以增强在目标植物中的表达。 

该重组植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。 

本发明提供了一种提高植物对低温胁迫抗性的方法，包括：构建含有所述与低温胁迫相关的基因的重组植物表达载体；将所构建的重组植物表达载体转化到植物或植物细胞中，能够有效提高目标植物对低温胁迫的抗性。 

本发明还提供了一种培育耐低温胁迫或耐寒的植物新品种的方法，包括：构建含有所述与低温胁迫相关的基因的重组植物表达载体；将所构建的重组植物表达载体转化到植物或植物细胞中，培育筛选得到耐低温或对于低温胁迫抗性提高的转基因植物新品种。 

所述的“转化”指将基因导入到植物细胞内部这样的方式将多核苷酸遗传转化到植物中。将所述多核苷酸或多肽引入到植物中的方法为本领域所习知，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法等。“稳定转化”指被引入的多核苷酸构建体整合至植物细胞的基因组中并能通过其子代遗传；“瞬时转化”指多核苷酸被引入到植物中但只能在植物中暂时性表达或存在。 

转化方案以及将所述多核苷酸引入植物的方案可视用于转化的植物（单子叶植物或双子叶植物）或植物细胞的类型而变化。将所述多核苷酸引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击等。在特定的实施方案中，可利用多种瞬时转化法将本发明的基因转化到植物体重。在其它实施方案中，本发明的基因可通过将植物与病毒或病毒核酸接触来引入到植物中，通常，这样的方法涉及将本发明的基因构建体引入病毒DNA或RNA分子中。 

利用常规方法可使已转化的细胞再生稳定转化植株（McCormick et al.Plant Cell Reports.1986.5:81-84）。本发明可用于转化任何植物种类，包括但不限于：单子叶植物或双子叶植物。更优选的，所述的目标植物包括农作物、蔬菜或观赏植物、果树等，例如，可以是玉米、水稻、高粱、小麦、大豆、马铃薯、大麦、番茄、菜豆、花生、甘蔗或棉花等。 

本发明以蒙古沙冬青为材料，设计引物筛选通过cDNA-AFLP技术得到的逆境相关TDFs；对筛选出的重要抗寒相关TDFs进行延伸，通过RACE技术获得与低温胁迫相关的AmDUF1517全长cDNA序列；利用生物信息学分析软件对全长cDNA的开放阅读框（ORF）进行分析；采用基因枪轰击洋葱表皮细胞，进行AmDUF1517基因的亚细胞定位。本发明还用实时定量PCR方法检测AmDUF1517基因的表达模式，分析在GA、NaCl、ABA等处理条件下AmDUF1517基因的表达模式以及在沙冬青不同组织中的表达模式；本发明将AmDUF1517基因导入模式植物烟草和拟南芥中，获得稳定的转基因纯系，分析AmDUF1517基因的功能；筛选拟南芥突变体，进行转AmDUF1517基因突变体功能恢复试验。检测转基因株系中重要胁迫相关基因的表达情况，分析AmDUF1517基因可能的调控途径。通过亚细胞定位发现，AmDUF1517定位在细胞膜与细胞核上，可能与维持细胞膜的稳定性有关，也可能参与沙冬青低温胁迫的调控途径，由此推测AmDUF1517可能是一个低温抗性相关基因；本实验通过southern blotting确定了AmDUF1517在沙冬青基因组中是以单拷贝形式存在，说明了其不易突变，具有稳定性，也预示了其重要性，从而推测AmDUF1517基因可能在沙冬青抗寒机制中起到关键性的作用。AmDUF1517只在低温处理后的沙冬青叶片中表达，而植物叶片是对抗低温最脆弱的器官，从而验证了此基因与抗寒性的直接关系。荧光定量实时PCR结果显示，AmDUF1517在低温处理后短时间就有表达，在冷诱导4h后出现第一个高峰，随后表达量开始下降，推测原因可能是当沙冬青遭遇低温时，AmDUF1517的表达量开始积累，超过了所需，而后可能是表达量下降到临界值以下，又启动其转录，表达量再一次上升到第二个高峰，通过两次波动，其表达量最后维持在一个高的水平上。在短时间内能被低温诱导，预示AmDUF1517可能是一个与表达调控相关的基因。 

本发明进一步发现，乙烯、SA、NaCl和GA能诱导AmDUF1517的表达。AmDUF1517的表达能够受到乙烯、SA、NaCl和GA的诱导，推测AmDUF1517在与这些诱导物相关的信号通路中起作用，而这些诱导物又和抗性相关，所以推测AmDUF1517在沙冬青的抗寒性信号通路中起作用，而且可能在抗性调控的网络中占据比较重要的位置。 

已有研究证明，电解质渗漏率、游离脯氨酸含量、可溶性糖含量、丙二醛（MDA）含量等生理指标可作为衡量植物抗逆性的标记（Zhao et al，2011；Si et al，2009）。电解质渗漏率和MDA含量与植物抗逆性呈负相关，而游离脯氨酸含量和可溶性糖含量与植物抗逆性呈正相关。通过拟南芥突变体的回复实验，本发明将AmDUF1517转入拟南芥突变体，测量4℃低温处理前后电解质渗漏率，游离脯氨酸含量，可溶性糖含量和丙二醛含量，发现除了回复突变体351-DUF1517的各项生理指标与其对应的突变体一致，其他回复突变体植株均发生了显著变化，均表现出对冷胁迫的抗性增强，与野生型抗性一致，或是抗性显著高于野生型，说明外源基因AmDUF1517提高了回复突变体对冷胁迫的抗性。对于野生型拟南芥的过表达实验，从可溶性糖和MDA含量上表现出过表达型的抗性增强，其他生理 指标没有显示出其抗性的变化，推测原因，可能是低温处理时间短，物质的积累没有显示出差异，也不排除可能存在实验误差或者一些未知原因，需要进一步推测和验证。回复突变体351-DUF1517的冷胁迫抗性没有变化，推测其原因可能是外源基因的整合位置影响了基因表达，表达量很低或无表达，没有发挥外源基因的作用。总之，通过拟南芥过表达和回复实验，外源基因AmDUF1517显著提高了过表达型CK-DUF1517及回复突变体353-DUF1517、357-DUF1517和361-DUF1517对冷胁迫的抗性，证明了AmDUF1517能提高植物对低温胁迫的抗性。 

附图说明

图1半定量RT-PCR结果。 

图2、3’RACE部分结果；M:marke；1、3、5、7：TDF1、TDF11、TDF140和TDF179外侧引物扩增结果；2、4、6、8：TDF1、TDF11、TDF140和TDF179内侧引物扩增结果。 

图3、5’RACE部分结果；M:marke；1、3、5、7、9：TDF1、TDF11、TDF36、TDF140和TDF445外侧引物扩增结果；2、4、6、8、10：TDF1、TDF11、TDF36、TDF140和TDF445内侧引物扩增结果。 

图4AmDUF1517的亚细胞定位；A1:pCAMBIA1302空载体转化细胞，A2：未转化细胞；B1、C1：pCAMBIA1302-DUF1517转化细胞，B2、C2：B1、C1对应的自然光下效果。 

图5AmDUF1517的组织特异性表达结果；1：根；2：根4℃处理；3茎；4：茎4℃处理；5：叶；6：叶4℃处理。 

图6AmDUF1517的低温处理相对定量表达结果。 

图7AmDUF1517的诱导表达结果。 

图8pBI121-DUF1517PCR结果。 

图9pBI121-DUF1517酶切结果。 

图10转化株筛选；A：未转基因拟南芥；B转基因拟南芥。 

图11PCR检测转基因植株。 

图12过量表达AmDUF1517基因的拟南芥与野生型的生理指标比较；A：电解质渗透率；B：游离脯氨酸含量；C：可溶性糖含量；D：丙二醛含量。 

图13野生型拟南芥、DUF1517基因突变体和转AmDUF1517基因回复突变体的各项生理指标比较；A：电解质渗透率；B：游离脯氨酸含量；C：可溶性糖含量；D：丙二醛含量。 

具体实施方式

以下通过实施例来进一步描述本发明的制备方法及有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。 

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法参照《分子克隆实验指南》（第三版，J.萨姆布鲁克）一书中所列的具体方法进行或者按照试剂盒产品说明书进行操作。 

实施例1沙冬青逆境表达谱的筛选 

1实验材料 

1.1沙冬青种子：由中国农业科学院生物技术研究所裴新梧研究员提供。 

1.2酶及试剂试剂盒 

DNA聚合酶Ex Taq和dNTPs购自宝生物（大连）公司；RQ1RNase-Free DNase购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；反转录试剂盒购自NEB公司；第一条链cDNA合成试剂盒（Toyobo First Stand cDNA Synthesis Kit）购自东洋纺(上海)生物科技有限公司。 

2实验方法 

2.1沙冬青逆境表达谱分析 

沙冬青逆境转录谱由本实验室获得并保存。通过cDNA-AFLP技术获得了大约5000条逆境相关的TDFs，挑选其中1478条TDFs进行回收、连接和测序，最终得到536条TDFs的序列信息。对沙冬青逆境差异表达的TDFs进行分析，通过将各个TDF与GenBank已知序列信息比对来预测其功能和分析各个TDF在逆境处理中的表达情况，确定需要进行进一步研究的TDFs。 

2.2沙冬青幼苗的培养 

2.3沙冬青幼苗逆境处理 

待生长良好的沙冬青幼苗长出4片以上真叶时，可用作实验材料，挑选生长状态一致的沙冬青幼苗进行以下处理：（1）CK：温室中正常生长；（2）低温处理：冬季置于室外7d（0～-15℃）；（3）高温处理1：培养箱内模拟夏季气温7d（28～40℃）；（4）高温处理2：45℃温箱内2d；每个处理取3棵幼苗，混合提取总RNA（本实验关于逆境处理后的总RNA提取，每个处理都是取3次重复）。处理完后取沙冬青叶片，迅速放入液氮内冷冻，再放入-80℃低温冰箱内保存备用。 

2.4沙冬青总RNA的提取(Tris-酚法) 

2.5沙冬青总RNA的纯化 

用Tris-酚法提取的RNA样品用RQ1Rnase-free Dnase去除混杂的DNA。 

2.6沙冬青cDNA第一条链的合成 

（1）将RNA溶液于65℃加热5min后迅速置于冰上，以降低RNA二级结构的影响，提高反转录效率。 

（2）按照Toyobo First Stand cDNA Synthesis Kit的操作说明进行cDNA第一条链的合成。 

2.7沙冬青cDNA第一条链合成结果检测-Actin检测 

2.8沙冬青逆境相关TDFs的验证 

对需要进一步研究的TDFs，设计引物，通过半定量RT-PCR验证表达情况，以actin基因为内参。本实验主要关注受逆境诱导表达的TDFs。首先确定包括扩增actin在内的各个引物对合适的半定量RT-PCR扩增程序循环数：以CK的第一条链cDNA为模版，以表1的各个引物对为引物，进行PCR扩增。扩增完后用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的亮度，从而确定每个引物对的合适扩增循环数；在以T1引物对进行RT-PCR扩增时各个模版的上样量用actin扩增时确定的上样量，扩增结果用1%琼脂糖凝胶电泳检测。在各个处理的Actin亮度一致的情况下比较其T1引物对扩增片段的亮度，若与 CK亮度不同就表示该引物对对应的基因表达发生了变化。 

表1沙冬青半定量RT-PCR引物 

3实验结果 

3.1沙冬青逆境表达谱分析 

对本实验室保存的沙冬青逆境转录谱进行分析，发现有的TDFs只受一种逆境胁迫诱导表达，有的对两种、甚至三种逆境胁迫都有响应。本实验主要研究与温度相关的TDFs。将温度相关的TDFs与 GenBank已知序列信息比对来预测其功能，预测各TDFs的功能相关性并分类，有大部分TDFs的因为没有同源已知基因或其同源基因功能不详而无法预测功能。分类结果见表2-1，其中转录表达调控相关19条，物质运输相关2条，信号传递相关8条，光合作用相关13条，细胞代谢相关24条，逆境相关的16条，细胞结构6条，功能未知256条。从中选择43条对沙冬青干旱高温诱导表达条带开展表达谱分析验证。以内源基因β-actin为对照半定量PCR分析，共确定温度诱导表达基因15条。其中细胞代谢相关的3条，逆境相关的3条，信号传递相关的1条，转录表达调控1条，物质运输1条，功能未知6条。 

3.2沙冬青总RNA的提取 

沙冬青幼苗叶片总RNA提取结果，可见清晰的28S、18S和5S条带。表明所得总RNA提取质量好，纯度较高，完整性较好，可用于下一步反转录。 

3.3第一条链cDNA的合成及Actin检测 

反转录获得第一条链cDNA后，用引物AmActinL和AmActinR进行PCR扩增Actin片段，扩增结果用1.5%琼脂凝胶糖电泳检测。显示Actin条带清晰，无杂带，表明第一条链cDNA的合成结果较好，获得了较高质量的单链cDNA，可用于其他逆境相关TDFs的扩增。 

3.4沙冬青逆境相关TDFs的验证 

半定量RT-PCR各处理cDNA上样量的确定。通过每次actin的PCR结果的亮度反复调整，确定了各个处理cDNA的上样量。对需要进一步研究的逆境相关TDFs，通过半定量RT-PCR验证表达情况，受到逆境诱导表达的TDFs如图1所示，TDF1、TDF36、TDF170、TDF227、TDF232、TDF445、TDF466这七条序列受高温诱导表达，TDF20、TDF140、TDF36、TDF148、TDF221、TDF224这六条序列受低温诱导表达，TDF11、TDF161、TDF179、TDF390这四条序列受高温和低温两种逆诱导表达。 

实施例2沙冬青温度诱导表达基因的克隆 

1实验材料 

1.1载体与菌株：克隆载体pEASY-T1Simple Cloning Vector和大肠杆菌（Escherichia coli）Trans1-T1Phage Resistant感受态细胞购自全式金生物技术有限公司。 

1.2酶及试剂盒：DNA聚合酶和dNTPs购自宝生物（大连）公司；RQ1RNase-Free DNase购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司。第一条链cDNA合成试剂盒（Toyobo First Stand cDNA Synthesis Kit）购自东洋纺(上海)生物科技有限公司；RACE试剂盒购于美国Invitrogen生命技术公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于Biomiga公司；EASYspin植物RNA快速提取试剂盒购自原平皓生物技术有限公司。 

2实验方法 

2.1高纯度沙冬青总RNA的提取（试剂盒法） 

采用植物RNA提取试剂盒提取沙冬青总RNA。 

2.2利用3’RACE获得基因3’末端 

本实验中3’RACE所用引物见表2。表中OP和IP后面的编号与各个TDF的编号相对应。 

表23’RACE所用引物 

2.2.1带5’接头的第一条链cDNA合成 

步骤同实施例1中的2.7，唯一不同之处是将Oligo(dT)20替换为adapter。合成结果通过检测β-actin来推断。检测合格后用合成产物稀释4-10倍做模版，进行3’RACE PCR扩增。 

2.2.23’RACE的巢氏PCR 

3’RACE利用外侧引物(OP Primer)和内侧引物(IP Primer)，采用巢氏PCR来完成 

2.2.3回收第二次PCR扩增的特异条带 

用BIOMOGA胶回收试剂盒回收凝胶中的DNA。 

2.2.4特异条带与克隆载体连接 

用pEASY-T1Cloning Kit（TRANS）将PCR回收产物与T载体相连，连接体系如下： 

混匀，在25℃金属浴反应10min，反应结束后放于冰上终止反应。 

2.2.5连接子的转化 

(1)将连接产物与30μL Trans1-T1感受态细胞轻柔混匀，冰浴20-30min。 

(2)42℃热激30s，立即至于冰上2min。 

(3)加入500μL LB液体培养基，37℃200rpm孵育1h。 

(4)加入10μL400mM IPTG和20μL40mg/mL X-gal，混匀后均匀涂于含有200mg/L kan的固体LB平板上，待平板上的水份干燥后，37℃倒置培养过夜。 

2.2.6阳性重组子的鉴定和测序 

(1)用牙签挑白色克隆于10μL无菌水中，并蘸剩余菌体于1mL液体LB（200mg/L kan）中。 

(2)用10μL水中的菌体质粒为模版，以M13F和M13R为引物进行PCR扩增，PCR反应条件：95℃5min；95℃50s，55℃50s，72℃1min10s，30个循环；72℃5min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。 

(3)含有菌体的液体LB放于摇床内37℃200rmp培养。 

(4)选PCR产物为阳性的菌液，送测序。保留部分菌液用于后续实验。 

(5)测序结果用DNAman软件进行比对，将3’端信息与已知的片段拼接，完成3’RACE。 

2.3利用5’RACE获得基因5’末端 

本实验中5’RACE所用引物见表3。表中OP（外侧结合引物）和IP（内侧结合引物）后面的编号与各个TDF的编号相对应。 

表35’RACE所用引物 

2.3.1带3’接头的第一条链cDNA合成 

使用由Invitrogen（USA）公司提供的GeneRacer RLM-RACE Kit，进行RACE实验获取基因全长。 

1去磷酸化反应 

用试剂盒中的试剂配制下列反应液，装于1.5mL的Rnase-free离心管中，置于冰上。 

2去帽反应 

向上述7μL的去磷酸化RNA溶液中加入以下试剂配成去帽反应体系： 

(1)用移液器轻轻混匀，顺时离心收集液体。37℃温浴1min，顺时离心，置于冰上。 

(2)重复去磷酸化反应中的(2)-(8)步，最后用7μL DEPC水重悬沉淀。 

3连接反应 

将7μL去磷酸化的、脱帽的RNA加至预先分装的、冷冻的GeneRacer^TM RNA Oligo中（0.25μg），用移液器吹吸混匀RNA Oligo。瞬时离心收集管底溶液。65℃温浴5min，使RNA的二级结构松开。立刻至于冰上冷却约2min，瞬时离心，在管中加入下列试剂，用移液器混匀后，瞬时离心。 

(1)37℃温浴1min，顺时离心，置于冰上。 

(2)重复去磷酸化反应中的(2)-(8)步，最后用10μL DEPC水重悬沉淀。 

4反转录mRNA 

至此，沙冬青总RNA已经被反转录成为cDNA，可以进行下一步的实验。 

2.3.25’RACE的巢氏PCR 

5’RACE的PCR反应体系和反应程序与5’RACE类似。 

2.3.3特异条带的回收、连接和测序 

2.4基因全长的检测与结构分析 

2.4.1特异引物PCR扩增检测获得的全长基因 

将获得的3’/5’RACE序列信息与对应的TDF拼接起来，得到全长基因，设计引物以cDNA为模板，PCR扩增全长序列，检测3’/5’RACE的结果是否正确。所用引物略，反应体系参考1.2.7，反应程序采用常规PCR程序，退火温度参照各特异引物而定。 

2.4.2开放阅读框分析 

基因全序列含有完整的开放阅读框，可作为检测序列完整性的一项指标。利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.Gov)提供的ORF Finder分析所得序列的开放阅读框。 

2.4.3全长cDNA的生物信息学初步分析 

选择具有完整开放阅读框的序列作为候选基因，利用网站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.Gov)提供的Blast功能同源序列比对，根据ORF Finder获得的氨基酸序列进行蛋白质序列同源蛋白比对， 初步预测所得基因的功能。 

3实验结果 

3.13’RACE和5’RACE结果 

图2是部分3’RACE结果，显示了TDF1、TDF11、TDF140和TDF179的3’RACE的PCR扩增结果，有时用外侧结合引物扩增后在琼脂糖凝胶上看不到特异条带，但用内侧引物进行第二轮PCR扩增后可以得到特异条带，如TDF1、TDF11和TDF140是这类情况。但TDF179的外侧引物和内侧引物都能扩增出可见的特异条带。 

3.2逆境相关基因序列的检测 

用表3-2中的检测引物进行PCR扩增，对得到的片段进行检测。PCR扩增用常规PCR程序，退火温度参照各特异引物而定。所得结果均与各自的拼接结果相同，只存在个别核苷酸差异，应为实验误差。 

3.3逆境相关基因全长的获得及初步功能预测 

通过3’/5’RACE得到的序列和对应的TDF相拼接，得到了3条基因的全长cDNA序列和5条基因的3’序列信息，其中与低温胁迫相关的AmDUF1517基因的信息如下：由片段TDF140获得，低温上调表达，编码301个氨基酸，含有DUF1517superfamily的保守氨基酸序列，命名为AmDUF1517，其cDNA序列为SEQ ID NO.1所示，推导的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。 

试验例1AmDUF1517的分子生物学分析 

1实验材料 

1.1载体与菌株 

克隆载体pEASY-T1Simple Cloning Vector和大肠杆菌（Escherichia coli）Trans1-T1Phage Resistant感受态细胞购自全式金生物技术有限公司。植物表达载体pCAMBIA1302由本实验室保存。 

1.2酶、试剂盒及其他 

各种限制性内切酶、DNA T₄ligase、DNA聚合酶、dNTPs、Genome walking kit和Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2.0购自宝生物（大连）公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于Biomiga公司；荧光实时定量PCR染料UltraSYBR Mixture（with ROX）购自康为世纪公司。 

2实验方法 

实验所用引物见表4。 

表4实验所需引物 

2.1内含子检测 

2.1.1沙冬青基因组DNA的提取 

真核生物基因组中的基因为断裂基因，即在基因序列上常含有内含子序列。采用CTAB法提取基因组DNA。 

2.1.2基因组DNA的纯化 

基因组DNA内存在RNA杂质，用RNase消化去除。 

2.1.3PCR检测内含子 

分别以沙冬青基因组DNA和cDNA为模板，用DUF1517ORF全长引物PCR扩增全长序列，若PCR结果在琼脂糖凝胶上反应的条带长度不一致，则表明有内含子的存在。回收以基因组DNA为模板的PCR产物，连接、测序，通过两个序列信息的比对，可得到内含子的序列和位置信息。 

2.2亚细胞定位 

2.2.1AmDUF1517基因植物表达载体的构建 

载体pCAMBIA1302的GFP序列前只有一个NcoI限制性内切酶位点可用，通过DNAMAN分析，AmDUF1517的ORF没有NcoI酶切位点，在AmDUF1517基因ORF两侧设计含有NcoI限制性内切酶位点的特异引物（除去终止子），以cDNA为模板，用上述引物PCR扩增两端含有Nco I酶切位点的Am DUF1517基因。将PCR产物连接到T载体测序，分别提取测序正确的T载体质粒DNA和pCAMBIA1302的质粒DNA， 

对质粒进行限制性完全酶切。酶切体系为： 

（1）用含有200mg/L kan的液体LB培养基培养阳性菌株（pEASY-T1-140）和pCAMBIA1302空载体菌株。各自提取质粒DNA。 

（2）两种质粒DNA分别用Nco Ⅰ单酶切，酶切体系如下： 

（3）混匀后37℃1h或过夜。 

（4）酶切产物用2倍体积的无水乙醇和1/10体积的NaAc沉淀，再用40μL ddH₂O溶解。 

2.2.2阳性片段的回收、连接和鉴定 

（1）酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收T载体上的小片段和pCAMBIA1302空载体的大片段，用于连接。 

（2）连接反应体系如下： 

（3）混匀，16℃过夜反应。 

（4）将连接产物转化大肠杆菌感受态（100μL），热激转化后用含有200mg/L kan的LB平板培样菌体。 

（5）用菌落PCR检测正确的连接子，特异引物是根据pCAMBIA1302的NcoI酶切位点两侧序列设计的1302-Nco1-checkL和1302-Nco1-checkR为引物进行PCR扩增，PCR反应条件：95℃5min；95℃50s，57℃50s，72℃1min20s，30个循环；72℃5min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。 

（6）选PCR产物为阳性的菌液，用NcoⅠ单酶切进一步验证，并自带引物1302-Nco1-checkL和1302-Nco1-checkR送三博远志公司测序，确保连接的方向正确。保留部分菌液用于后续实验。 

2.2.3绿色荧光蛋白GFP亚细胞定位 

首先从第五层开始每层选一片洋葱表皮，平铺在MS固体培养基上，暗培养4h以上。接下来用基因枪将载体打入洋葱表皮细胞的细胞核内。 

2.3southern blotting确定基因组内拷贝数 

2.3.1沙冬青基因组DNA的提取和纯化 

提取完后电泳检测DNA的质量。 

2.3.2沙冬青基因组的限制性内切酶消化 

（1）分别用BamH I和HindⅢ消化沙冬青基因组， 

（2）加入2倍体积无水乙醇和1/103mol/L NaAC(pH5.2)-20℃静置30min；1,2000rpm离心10min，弃上清液，沉淀用75%乙醇洗2次，超净台上抽干，加入50μL ddH₂O溶解DNA。 

2.3.3琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品 

2.3.4电泳凝胶预处理 

紫外灯下观察电泳结果，如果酶切条带呈弥散状，表明酶切完全，可进行凝胶预处理。 

2.3.5转膜 

2.3.6探针标记 

探针选择AmDUF1517一段大约500bp片段，没有BamH I或HindⅢ酶切位点，用RTL和RTR引物扩增，回收片段用作探针。探针标记用宝生物Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2.0； 

2.3.7杂交及显影 

2.4组织特异表达和瞬时表达 

2.4.1AmDUF1517的组织特异性表达 

用半定量RT-PCR检测AmDUF1517在不同沙冬青不同组织中的表达情况。将沙冬青放在低温培养箱中，4℃处理4h，分别提取低温处理和CK的根、茎、叶的总RNA，反转录成第一条链cDNA，用做半定量RT-PCR模版，引物对为RTL:ACATCTTCAGAATCCTCGCA和RTR:GCGCATAGTATGGTGTTGAGTAAG，总RNA提取、第一条链cDNA的合成和PCR反应参见第二章。 

2.4.2AmDUF1517在叶片中的瞬时表达情况 

对受低温诱导特异表达AmDUF1517的组织，用荧光实时定量PCR检测AmDUF1517在该组织的瞬时表达情况。将沙冬青4℃低温处理0h（CK）、1h、2h、4h、8h、16h、24h、32h和72h取叶片分别提取总RNA，反转录成第一条链cDNA，用作荧光实时定量PCR的模版，actin引物见表引物表2-1AmActinL和AmActinR，AmDUF1517特异引物realL：AGCGGTGTTGCTAGGTCTGC和realR：GCGCATAGTATGGTGTTGAGTAAG。实验步骤如下： 

（1）梯度稀释各样品的actin和AmDUF1517的阳性模版 

actin的阳性模版为AmActinL和AmActinR扩增的阳性片段，AmDUF1517的阳性模版为realL和realR扩增的阳性片段。制备两种阳性模版的10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹拷贝，以备用。 

（2）扩增效率检测 

反应体系如下： 

每个样品三次重复，制备好的两种片段的检测样本同时上机，反应条件为：95℃10min； 

95℃10min；95℃15s，60℃1min，40个循环。 

（3）采用双标准曲线的相对定量法，以Ct值对模版对数建立标准曲线。根据公式E=10^-(1/斜率)，扩增效率=（E-1）%来计算。 

2.5AmDUF1517的诱导表达分析 

分别用150mg/L乙烯(ethylene，ET)、100mM NaCl、20mg/L脱落酸(ABA)、45mg/L抗坏血酸(Vc）、500mg/L赤霉素(GA)、100mg/L水杨酸(SA)和0.1mM茉莉酸甲酯（MeJA）处理沙冬青幼苗，各种药品溶解在0.02%silwet L-77的水溶液中，ABA、GA和水杨酸先用少量乙醇溶解，再用0.02%silwet L-77的水溶液定容。MeJA取10μL加入到426μL无水乙醇中，配成100mM母液，用时再稀释。各种处理三次重复，每隔12h涂抹叶片并浇入土壤。处理三次后，取叶片提取总RNA，翻转录成第一条链cDNA，用于荧光实时定量PCR的模版。 

3实验结果 

3.1内含子检测 

分别以沙冬青基因组DNA和cDNA为模板，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳发现由于内含子的 存在，两个不同模版扩增的结果相差大约1kb，切胶回收以基因组DNA为模版扩增的片段，连接pEASY-T1载体测序，测序结果与AmDUF1517的cDNA全长比对，发现T140有一个969bp的内含子，在起始密码子开始623bp后。内含子剪切位点为GT-TG，不是常见的GT-AG规则。 

3.2.生物信息学分析 

生物信息学分析明确转录起始位点位于基因上游975bp处，转录起始位点上游127bp到78bp处有典型真核生物启动子序列特征，明确AmDUF1517基因的序列特征并有效验证基因序列全长的完整性。 

3.3亚细胞定位 

3.3.1AmDUF1517基因植物表达载体的构建 

以沙冬青cDNA为模板，用含Nco I限制性内切酶位点的引物，PCR克隆获得含有Nco I位点的AmDUF1517基因，条带单一，长度约1000bp，符合预期目标基因条带大小，连接T载体测序，挑选测序正确的T载体，命名为T-Nco I-140。将T-Nco I-DUF1517质粒DNA和pCAMBIA1302空载体质粒DNA，分别用NcoⅠ单酶切。因为T-Nco I-DUF1517质粒含有三个Nco Ⅰ酶切位点，故被切成了3段，其中约1kb的片段是含有Nco I位点的DUF1517基因片段；pCAMBIA1302质粒只含有一个Nco Ⅰ酶切位点，被切成了一条约10kb的大片段。将T-Nco I-DUF1517的约1kb的片段与pCAMBIA1302的大片段回收、连接、转化大肠杆菌。菌落PCR验证正确的连接子，命名为pCAMBIA1302-DUF1517，用NcoⅠ酶切来进一步验证其正确性，酶切后出现了一条约1kb的条带和一条约10kb的条带，这与正确的连接子性质相符合，推断此连接子是正确的，带有Nco Ⅰ酶切的AmDUF1517已经成功整合到了pCAMBIA1302上。最后用测序验证DUF1517基因整合在pCAMBIA1302的正确方向，挑选正确的连接子用于后续实验。 

3.3.2亚细胞定位 

洋葱表皮被轰击后在28℃暗培养16h，观察植物表达载体pCAMBIA1302-DUF1517的瞬时表达情况。结果发现洋葱细胞核和细胞膜可见明显绿色，C中细胞发生了轻微的质壁分离，可以看到上方质壁分离的细胞膜带有荧光，说明AmDUF1517编码的蛋白定位在细胞核与细胞膜上。 

3.4southern blotting确定基因拷贝数 

3.4.1基因组的提取 

提取的沙冬青基因组条带清晰，表明基因组DNA完整，经ND2000紫外分光光度计测定，OD260/OD280值为1.83，表明所得总DNA纯度较高，没有其它杂质的污染。 

3.4.2基因组的酶切 

用限制性内切酶充分酶切后取少量电泳，结果显示，DNA酶切条带在各自泳道上呈连续的弥散状态，无明显的特异条带，表明基因组DNA酶切完全，可用作转下一步杂交试验。 

3.4.3southern blotting 

CTP³²P同位素探针标记杂交结果显示目标基因为单拷贝。由于使用了两种不同的单酶切，酶切的片段不尽相同，杂交结果也一般不在同一水平上。 

3.5组织特异表达和瞬时表达 

3.5.1AmDUF1517的组织特异性表达 

半定量RT-PCR结果显示AmDUF1517只在冷处理后的叶片中表达，其他情况下不表达。 

3.5.2AmDUF1517在叶片中的瞬时表达情况 

（1）扩增效率检测 

溶解曲线显示扩增效率高，温度合适，达到了理想的反应体系，可进行下一步实验。每个扩增，取三次重复的C_T值的平均数为纵坐标，对应的拷贝数的对数值为横坐标，作标准曲线图来计算AmActinL和AmActinR、realL和realR两对引物的扩增效率。对于引物对AmActinL和AmActinR，标准曲线为Y=-3.4958x+43.915，R²=0.9999，根据公式E=10^-(1/斜率)，扩增效率=（E-1）%，计算其扩增效率为93.22%；对于引物对realL和realR，标准曲线为y=-3.5799x+27.522，R²=0.9978，计算其扩增效率为90.25%。两对引物的扩增效率在允许范围内（90%-105%），且R²>0.980可用下一步表达量的相对定量分析。 

（2）沙冬青AmDUF1517在叶片中表达的荧光实时定量PCR分析 

采用2^-ΔΔC _T法对基因表达量进行分析。低温处理后，沙冬青AmDUF1517在沙冬青叶片中的表达量开始上升，到处理4h后出现峰值，然后表达量开始下降，到32h再次出现峰值，后表达量有所下降，但仍维持在一个较高的水平（图6）。 

3.6AmDUF1517的诱导表达分析 

经过乙烯、ABA、SA、MeJA、NaCl、Vc和GA的诱导，荧光实时定量实时PCR结果显示（图7），乙烯、SA、NaCl和GA能诱导AmDUF1517的表达，表达量达到2倍或以上，NaCl对AmDUF1517的表达影响最大，表达量增加到2.5倍，而ABA、MeJA和Vc对AmDUF1517的表达没有太大影响。 

试验例2AmDUF1517的遗传转化和拟南芥突变体互补试验 

1试验材料 

1.1植物材料 

拟南芥哥伦比亚Col-0生态型由本实验室保存；DUF1517基因突变体购于俄亥俄州立大学拟南芥突变体库，共购得8个突变体，编号为37350、37351、37353、37357、37359、37361、37362和37363（为简便起见，以下只列出8个突变体编号的后三位数字），8种突变体均为插入失活，只是整合的位点不同。 

1.2植物表达载体 

植物表达载体pBI121购于北京拜尔迪生物技术有限公司。农杆菌LBA4404由本实验室保存。 

2实验方法 

2.1拟南芥的种植 

拟南芥的种植：种前将种子放入4℃3d以保证出芽整齐。将花盆内装入一致土量(蛭石：芳洁土：进口有机壤土=3:2:1)，用1/10MS₀润湿。将拟南芥种子点到土壤表面，种好种子后花盆口上覆保鲜膜以保持土壤水分，在人工光照培养箱内培养生长，16h/8h昼/夜23/21℃昼/夜，待种子发芽张成幼苗后，去掉保鲜膜。浸灌方法，2-3dd浇水一次。 

2.2植物表达载体的构建和对农杆菌的转化 

实验中所用引物见表5。 

表5引物 

2.2.1植物表达载体的构建。 

以沙冬青的cDNA为模版，用引物：DUF1517BamHⅠ和DUF1517SacⅠPCR扩增AmDUF1517，在其两头分别连入BamH Ⅰ和SacⅠ酶切位点。将PCR产物连接到T载体测序，分别提取测序正确的T载体质粒DNA和pBI121的质粒DNA，分别用BamH Ⅰ和Sac Ⅰ双酶切这两种质粒DNA，后切胶回收T载体约1000 bp的片段和pBI121的大片段，将这两个片段连接，构成AmDUF1517的组成型表达载体（过表达载体）。连接子转化到大肠杆菌感受态，连接子的检测用菌落PCR完成，阳性连接子检测用的特异引物是根据pBI121的BamH Ⅰ和Sac Ⅰ酶切位点外侧序列设计的121-BamH Ⅰ-check和121-Sac Ⅰ-check，选PCR产物为阳性的菌液，用BamH Ⅰ和Sac Ⅰ双酶切进一步验证，并用自带引物121-BamH Ⅰ-check和121-Sac Ⅰ-check测序，确保连接正确。保留部分菌液用于后续实验。 

2.2.2农杆菌电击感受态的制备。 

2.2.3植物表达载体的农杆菌电击转化 

(1)提取质粒DNA，酒精沉淀后用75%乙醇洗涤数次，除去离子，后溶解于去离子水中。 

(2)电击杯先用去离子水冲洗数次，再无水乙醇重复洗涤数次，除去盐离子。 

(3)向50μL农杆菌感受态菌液中加入0.5μg载体DNA，混匀，放入预冷的电击杯中，电击仪电压1.8kv、电容25μF电阻200Ω，电击杯铁片距离1mm，电击转化。 

(4)将感受态菌液取出，28℃、200rpm/min活化培养4h。 

(5)取菌液均匀涂于Kan抗性YEB固体培养基上。 

(6)28℃暗培养2d，挑取单克隆检测转化结果。检测可用引物121-BamH Ⅰ-check和121-Sac Ⅰ-check，通过菌落PCR完成。保存PCR产物为阳性的菌液。 

2.3农杆菌介导的遗传转化 

2.3.1蘸花法对拟南芥的遗传转化 

（1）对野生型和突变体均转化。当拟南芥长出3-4个荚果时，开始转化。转化前一天，剪去已开的花朵和长出的荚果。用含有100mg/LYEB液体培养基28℃、200rpm/min过夜培养得到的农杆菌。 

（2）取5mL转接至50mLYEB液体培养基中，28℃、150rpm/min培养至对数生长期(OD600 为0.8左右)。 

（3）5000rpm/min离心3min，收集菌体，用50mL含10%蔗糖和0.02%silwet-L77的溶液悬浮菌体。 

（4）转化时将花在溶液中浸泡1min左右，后避光培养1d，在放入光照培养箱内培养。 

(5)每隔3-4天蘸花一次。收集种子。 

2.3.2转基因拟南芥种子的筛选 

2.3.3对烟草的遗传转化 

（1）用含有100mg/L Kan的YEB液体培养基28℃、200rpm/min过夜培养5.2.1.2得到的的农杆菌。 

（2）取5mL转接至50mLYEB液体培养基中，28℃、150rpm/min培养至对数生长期(OD600为0.8左右)。 

（3）5000rpm/min离心5min，收集菌体，再用MS₀液体培养基悬浮菌体，使OD₆₀₀仍保持在0.8左右，备用。 

（4）将无菌的组培烟草叶片用剪刀剪出伤口后，浸入到菌悬液中10-15min，用滤纸吸干叶表面的液体，把叶片平铺在MS₀固体培养基上，培养基中含有0.2mg/L NAA和2mg/L6-BA，放于黑暗中共同培养3d，温度保持在25±1℃。 

（5）将叶片取出，移入含有0.2mg/L NAA,2mg/L6-BA,100mg/L Kan和500mg/L Carb的MS₀培养基上，于光照培养箱中培养，16h/8h昼/夜。 

（6）2-3周后，抗性苗被转移至含有100mg/L Kan和500mg/L Carb的MS₀固体培养基以诱导发根。 

2.3.4转化植株的鉴定 

取叶片提取基因组DNA，用引物121-BamHⅠ-check和121-SacⅠ-check进行PCR扩增，得到阳性条带的即为转化植株。 

2.4生理指标检测 

当烟草长出5-6片叶子时，进行生理指标测定。将野生型烟草NC89和AmDUF1517的转化株在4℃处理24天。每个品种选6棵长势一致的幼苗，测定冷处理前后不同时间的每种烟草的电解质渗漏率，游离脯氨酸含量，可溶性糖含量和丙二醛（MDA）含量的活性。结果用SAS软件的GLM程序统计分析，使用T-测试（SAS研究所，纽约，美国）。当拟南芥生长约20d，对野生型拟南芥Col-0、突变体和AmDUF1517的转化株进行生理指标检测。 

2.4.1电解质渗透率 

膜透性可通过测定电解质渗漏率得到。取5个拟南芥叶盘浸渍在5mL高纯水中，室温3h，期间轻柔震荡。用电导率仪（DDS-11A型，上海，中国）测定溶液的电导率。然后将溶液煮沸10分钟，再次测定溶液的电导率，为该样品的总电导率。电解质渗透率即溶液初始电导率占总电导率的百分比。 

2.4.2游离脯氨酸含量测定 

脯氨酸标准溶液：准确称取25mg脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250ml，浓度为100μg/mL。 再取此液10mL，用蒸馏水稀释至100mL，即成10μg/mL的脯氨酸标准液。 

绘制标曲线：吸取脯氨酸标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别加入蒸馏水至2.0mL,再分别加入2mL冰醋酸和2mL酸性茚三酮（1.25g茚三酮溶于30mL冰乙酸和20mL6M磷酸溶液中，搅拌加热（低于70℃）溶解），100℃30min，冰上冷却并加入4mL甲苯，震荡30s，静止片刻取上层液体测量在520nm处吸光度，0浓度为空白对照。测定结果以脯氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作标准曲线。 

样品加入3％磺基水杨酸酸，沸水浴10min，4℃10,000rpm离心15min，取2mL提取液，加入2mL酸性茚三酮和2mL冰醋酸，100℃孵育30min，后冰上冷却并加入4mL甲苯，震荡30s，静止片刻取上层液体测量在520nm处吸光度，甲苯为空白对照。脯氨酸含量通过比对标准曲线获得，再按照以下公式计算叶片中脯氨酸含量： 

公式中x为从标准曲线查得的脯氨酸含量（μg） 

2.4.3可溶性糖含量 

绘制标准曲线：准确制得总体积为2mL的0、10、20、30、40、50μg/mL蔗糖溶液，再分别加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯试剂（1g蒽酮溶于50mL乙酸乙酯）和5mL H₂SO₄（98％），混合煮沸1min，冷却后测定630nm处吸光度。以蔗糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标作准曲线。 

将新鲜样品放入蒸馏水，沸水30min。取2mL提取液，加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯试剂，混合煮沸1min，冷却后测定630nm处吸光度。可溶性糖含量通过比对标准曲线获得，再按照以下公式计算叶片中可溶性糖含量： 

公式中x为从标准曲线查得的可溶性糖含量（μg） 

2.4.4丙二醛（MDA）含量的测定 

取新鲜叶片在10％TCA中研磨，4℃10,000rpm离心10min，取2mL上清液，加入2mL TBA，混匀后100℃孵育15min，迅速放在冰上冷却，10,000rpm离心10min，取上清分别测量600nm，532nm和450nm处的吸光度。MDA含量计算公式：MDA含量（μmol/L）=6.45(OD₅₃₂-OD₆₀₀)-0.56×OD₄₅₀

3实验结果 

3.1植物表达载体的构建 

构建的载体命名为pBI121-DUF1517，经过PCR扩增及BamHⅠ和SacⅠ双酶切，都得到0.9kb的阳性条带，说明DUF1517已经整合到载体pBI121上。将构建正确的质粒转入农杆菌LBA4404，阳性菌株的鉴定用PCR扩增鉴定（图8和图9）。 

3.2转AmDUF1517基因拟南芥的获得 

拟南芥经蘸花法后收集的种子，在Kan抗性培养基上筛选，未转基因种子根系短，叶片发黄，一 般只长出子叶便不再生长，最后渐渐死去；转基因种子长出幼苗，且根系长，生长不受抑制（图10）。 

PCR扩增检测进一步鉴定了转AmDUF1517的阳性植株，转基因植株能扩增出约1.0kb的特异条带。鉴定结果，野生型得到1个转基因株系，突变体37351得到1个，突变体37353得到2个，突变体37357得到3个，37361得到2个（图11，部分阳性转基因植株的鉴定结果），均为T₀代。 

3.3拟南芥突变体的变形观察与比较 

拟南芥突变体和野生型均于同一时间播种于土中，经过5w，比较外形上的区别，发现突变体已经抽苔进入花期（花数量还少），野生型还处于营养生长阶段。 

植物在非正常生长状态下，会早开花，以缩短生长周期，提早得到果实，从而完成自身的生命周期并繁育下一代。本实验中，在适宜的条件下，与野生型相比，突变体转入生殖生长迅速，开花早，这可能是因为与野生型相比，突变体因为自身条件的不足，导致其提早进入生殖生长，初步预测可能因突变失活的基因DUF1517与突变体低温不适应性相关。 

3.4生理指标测定 

3.4.1过量表达AmDUF1517基因的拟南芥与野生型的生理指标比较 

对野生型拟南芥和过表达AmDUF1517基因拟南芥（用CK-DUF1517表示）各项生理指标进行了比较。电解质渗漏率方面，4℃2h处理前后两者的电解质渗漏率均没有显著差异（图12，A）；游离脯氨酸含量方面，正常生长状态下，CK-DUF1517的脯氨酸含量极显著高于野生型（P<0.01），是野生型的1.90倍。经过4℃2h处理，两者的游离脯氨酸含量无显著差异（图12，B）；可溶性糖含量方面，正常生长状态下，CK-DUF1517的可溶性糖含量显著高于野生型（P<0.05），是野生型的1.29倍。经过4℃2h处理，CK-DUF1517的可溶性糖含量显著高于野生型（P<0.05），是野生型的1.31倍（图12，C）；MDA含量方面，4℃2h处理前后两者的MDA含量均没有显著差异（图12，D）。 

3.4.2拟南芥回复突变体生理指标的比较 

对野生型拟南芥、DUF1517基因突变体和转AmDUF1517基因回复突变体的各项生理指标进行了比较（各回复突变体用对应的突变体编号与DUF1517共同表示）。电解质渗漏率方面，正常生长状态下，各个株系的电解质渗漏率没有显著差异；经过4℃2h处理，突变体351、353、357、361和回复突变体351-DUF1517的电解质渗透率显著高于野生型（P<0.05），分别是野生型的1.24、1.20、1.28、1.30和1.32倍，回复突变体353-DUF1517、357-DUF1517和361-DUF1517的电解质渗透率与野生型之间没有显著差异（图13，A）。 

游离脯氨酸含量方面，正常生长状态下，突变体351、353、357、361和回复突变体351-DUF1517的脯氨酸含量与野生型没有显著差异。回复突变体353-DUF1517、357-DUF1517和361-DUF1517的脯氨酸含量极显著高于野生型（P<0.01），分别是野生型的1.47、1.62和1.56倍；经过4℃2h处理，突变体351、353、357、361和回复突变体351-DUF1517的游离脯氨酸含量极显著低于野生型（P<0.01），分别是野生型的0.66、0.69、0.67和0.78倍。回复突变体353-DUF1517、357-DUF1517和361-DUF1517的游离脯氨酸含量与野生型之间没有显著差异（图13，B）。 

可溶性糖含量方面，正常生长状态下，突变体351、353、357、361和回复突变体351-DUF1517的可溶性糖含量均极显著低于野生型（P<0.01），分别是野生型的0.46、0.49、0.49、0.59和0.51倍。 回复突变体353-DUF1517和357-DUF1517的可溶性糖含量与野生型之间没有显著差异，回复突变体361-DUF1517的可溶性糖含量显著高于野生型（P<0.05），是野生型的1.25倍；经过4℃2h处理，突变体351、353、357、361和回复突变体351-DUF1517的可溶性糖含量极显著低于野生型（P<0.01），分别是野生型的0.39、0.60、0.63、0.59和0.42倍。回复突变体353-DUF1517和357-DUF1517的可溶性糖含量与野生型之间没有显著差异，回复突变体361-DUF1517的可溶性糖含量显著高于野生型（P<0.05），是野生型的1.27倍（图13，C）。 

MDA含量方面，正常生长状态下，突变体351、353、357、361和回复突变体351-DUF1517的MDA含量均极显著高于野生型（P<0.01），分别是野生型的1.68、1.61、1.71、1.77和1.73倍。回复突变体353-DUF1517、357-DUF1517和361-DUF1517的MDA含量与野生型之间没有显著差异；经过4℃2h处理，突变体351、353、357、361和回复突变体351-DUF1517的MDA含量极显著高于野生型（P<0.01），分别是野生型的1.73、1.62、1.79、1.56和1.55倍。回复突变体353-DUF1517、357-DUF1517和361-DUF1517的MDA含量与野生型之间没有显著差异（图14，D）。 

Claims (8)

1.从沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus(Maxim.)Cheng f.)中分离的与低温胁迫相关的基因，其cDNA序列为(a)或(b)所示: 

(a)、SEQ ID No.1所示的核苷酸； 

(b)、编码SEQ ID No.2所示氨基酸序列的核苷酸。 

2.权利要求1所述基因编码的蛋白质。 

3.按照权利要求2所述的蛋白质，其特征在于：其氨基酸为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。 

4.含有权利要求1所述基因的重组表达载体。 

5.按照权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述的重组表达载体是重组植物表达载体。 

6.权利要求1所述基因在提高植物对低温胁迫抗性中的应用。 

7.按照权利要求6所述的应用，其特征在于，包括：构建含有权利要求1所述基因的重组植物表达载体；将所述重组植物表达载体转化到植物或植物细胞中，培育筛选得到转基因植物。 

8.一种培育耐低温或耐寒的植物品种的方法，包括：构建含有权利要求1所述基因的重组植物表达载体；将所述重组植物表达载体转化到受体植物或植物细胞中，培育筛选得到低温胁迫抗性提高的转基因植物品种。