CN103255165B - Soar1蛋白及其编码基因在调控植物抗逆境胁迫中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种SOAR1蛋白及其编码基因在调控植物抗逆境胁迫中的应用。本发明所提供的应用具体为由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质在如下a1）或a2）中的应用：a1）调控植物抗逆性；a2）选育抗逆性提高的植物品种。实验证明，本发明所得的SOAR1转基因植株，相比未转基因的对照植株，对盐、干旱、低温及渗透等多种非生物逆境胁迫的耐受性均提高。本发明对植物抗逆性分子机制以及分子育种研究方面具有重要意义，对于粮食和经济作物的遗传改良，提高作物对自然气候灾害和不良土壤环境的抗逆性和耐受性等方面具有重要的实用价值和广阔的市场前景。

Description

SOAR1蛋白及其编码基因在调控植物抗逆境胁迫中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种SOAR1蛋白及其编码基因在调控植物抗逆境胁迫中的应用。

背景技术

陆生植物在整个生长发育阶段都可能受到逆境胁迫的影响，其中干早、盐碱、低温（冷害与冻害）等非生物胁迫是强烈制约植物生长和作物产量的重要因素。植物为生存进化出一系列抵抗、耐受以及躲避逆境胁迫的策略。有关植物抗逆性的研究一直是植物学领域的热点。传统的育种技术改良耐胁迫性状难度较大，而随着分子生物学技术的发展及对植物抗逆分子机制的深入研究，分子水平抗逆基因工程取得重大进展。采用转基因技术向植物导入抗逆性外源基因已成为改良植物抗逆性的新途径。植物抗逆机制及相关基因工程的研究具有非常广阔的前景和十分重要的意义。

植物对逆境的适应过程涉及到多种信号传导途径，植物激素可能作为抗逆基因表达的启动因素。脱落酸ABA作为最重要的植物激素之一，参与调控植物生长发育各个阶段，包括种子休眠、成熟、萌发，幼苗生长，气孔运动，以及营养生长向生殖生长转换等方面。同时，ABA在植物对外界各种逆境胁迫的响应中起着重要作用，尤其是非生物胁迫关系最密切，包括盐、干旱、低温以及渗透胁迫，还有机械伤害等。随着新基因不断地被发现，一个ABA作用的信号网络逐步呈现在人们面前，并且这个网络越来越清晰完善。

PPR（pentatricopeptide repeats）基因家族是在植物中发现的最大家族之一。PPR蛋白（三角形五肽富足蛋白）在植物生长发育中的重要作用。在拟南芥中鉴定出大约450个成员，其他陆生植物基因组序列中可编码更多；然而在水生植物、微生物以及动物中，其成员数量显著降低。在陆生生物中，来自不同种属的PPR蛋白具有高度同源性。PPR蛋白家族较少有基因丢失或者重复的情况，并且PPR蛋白基因的单基因突变即可引起较严重的突变体表型，说明PPR蛋白在植物生长发育中的重要性。PPR蛋白在细胞内主要分布在线粒体、叶绿体或其他亚细胞结构内，研究发现PPR蛋白参与细胞器mRNA的加工过程，包括剪切、剪接、稳定、RNA编辑，以及蛋白质翻译起始和核糖体组装。有的PPR蛋白与雄性胞质不育有密切联系。目前人们在拟南芥中仅发现几个PPR蛋白参与抗逆过程，如PPR40、ABO5、SLG1、PGN与AHG11等，这在庞大的陆生PPR蛋白家族中仅是冰山一角，更多的调控植物抗逆境胁迫的PPR蛋白还有待研究发现。

发明内容

本发明的目的是提供一种SOAR1蛋白及其编码基因在调控植物抗逆境胁迫中的应用。

本发明所提供的应用，具体为如下A或B：

A：由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质（命名为SOAR1）在如下a1）或a2）中的应用：

a1）调控植物抗逆性；

a2）选育抗逆性提高的植物品种。

B：由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因（命名为SOAR1）在如下a1）或a2）中的应用：

a1）调控植物抗逆性；

a2）选育抗逆性提高的植物品种。

在本发明中，以上所有a1）中的所述调控植物抗逆性均具体为提高植物抗逆性；以上所有a2）中的所述选育抗逆性提高的植物品种的方法，均具体可包括将所述SOAR1蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。

在上述应用中，所述抗逆性可为如下中的至少一种：抗盐性、抗旱性和抗低温性。

本发明还提供一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育抗逆性提高的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：

a）向目的植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；

b）从步骤a）所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，抗逆性提高的转基因植物。

在上述应用或方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因（即SOAR1基因）是如下1）至5）中任一所述的DNA分子：

1）编码序列为序列表中序列2自5’末端第89至1897位核苷酸所示的DNA分子；

2）序列表中序列2所示的DNA分子；

3）序列表中序列1所示的DNA分子；

4）在严格条件下与1）-3）任一所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；

5）与1）-4）任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

其中，序列1由2216个核苷酸组成，为所述SOAR1基因在拟南芥基因组中序列，其中第653-763位为内含子序列；序列2由2105个核苷酸组成，为所述SOAR1基因的cDNA序列，其中第89-1897位为编码序列（ORF）；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由602个氨基酸残基组成。

在上述方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中的。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子（pUbi）、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明中，所述重组表达载体中启动所述蛋白质的编码基因转录的启动子为35S启动子。

更为具体的，所述重组表达载体为将所述SOAR1基因插入到pCAMBIA-1300-221载体的多克隆位点用限制性内切酶BamH I与Sal I之间后得到的重组质粒。

在上述方法中，将携带有所述SOAR1基因的所述重组表达载体导入所述目的植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

在上述应用或方法中，所述植物即可为单子叶植物，也可为双子叶植物。

在本发明的一个实施例中，所述植物为双子叶植物，具体为拟南芥，更加具体为拟南芥野生型（Col-0生态型）。

在上述方法中，所述抗逆性可为如下中的至少一种：抗盐性、抗旱性和抗低温性。

实验证明，本发明所得的SOAR1转基因植株，相比未转基因的对照植株，对盐、干旱、低温及渗透等多种非生物逆境胁迫的耐受性均提高。本发明对植物抗逆性分子机制以及分子育种研究方面具有重要意义，对于粮食和经济作物的遗传改良，提高作物对自然气候灾害和不良土壤环境的抗逆性和耐受性等方面具有重要的实用价值和广阔的市场前景。

附图说明

图1为SOAR1基因相关T-DNA插入突变体的鉴定。测序比对结果，突变体soar1-2以及soar1-3T-DNA分别插入在SOAR1基因的起始密码子（ATG）前352bp（启动子区）和77bp（5’非翻译区）位置。

图2为各遗传材料SOAR1基因表达量的分析结果。其中，(a)为SOAR1相关突变体的实时荧光定量PCR检测结果，SOAR1基因的表达均为相对值，以拟南芥野生型（Col-0生态型）SOAR1基因的表达为1；(b)为SOAR1相关突变体免疫印迹检测结果，SOAR1蛋白的表达均为相对值，以拟南芥野生型（Col-0生态型）SOAR1蛋白的表达为100。

图3为NaCl对SOAR1各遗传材料种子萌发的影响分析结果。

图4为NaCl对SOAR1各遗传材料幼苗生长的影响分析结果。其中，（a）为将SOAR1各遗传材料种子分别播种在含有不同NaCl浓度的MS培养基上（0mM和100mM），竖直生长10d后的幼苗生长情况；（b）为（a）中对应幼苗的主根长度统计。

图5为甘露醇对SOAR1遗传材料种子萌发的影响分析结果。其中，（a）为0mM甘露醇；（b）为300mM甘露醇。

图6为甘露醇对SOAR1遗传材料幼苗生长的影响分析结果。其中，（a）为0mM甘露醇；（b）为300mM甘露醇。

图7为低温胁迫对SOAR1各遗传材料幼苗生长的影响分析结果。其中，（a）为当温度降到-4℃后，0h取出的结果；（b）为当温度降到-4℃后，2h取出的结果。

图8为低温胁迫对SOAR1各遗传材料幼苗存活率的统计结果。其中，横坐标的低温胁迫时间为当温度降到-4℃后持续时间。

图9为低温胁迫后SOAR1各遗传材料的电解质渗透率的测定结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的%，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。

pCAMBIA-1300-221载体：由清华大学提供（记载文献：Lijing Liu,Yiyue Zhang,Sanyuan Tang,et al.An efficient system to detect protein ubiquitination by agroinfiltrationin Nicotiana benthamiana.The Plant Journal,2010(61):893-903.）。在pCAMBIA-1300-221载体中，位于多克隆位点（MCS）上游的启动子为35S启动子。在pCAMBIA-1300-221载体中，含有GFP基因。pCAMBIA-1300-221载体相关信息：http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/vectors/585.html。

拟南芥野生型（Col-0生态型）：拟南芥野生型种子（Arabidopsis thaliana，ecotypeColumbia-0）购自拟南芥生物研究中心（ABRC）。

T-DNA插入突变体soar1-2、soar1-3种子：购自凡尔赛遗传学和植物育种实验室拟南芥资源中心（Versailles Genetics and Plant Breeding Laboratory Arabidopsis thalianaResource Centre）。背景为拟南芥野生型（Col-0生态型），soar1-2、soar1-3为SOAR1基因表达降低的两个T-DNA插入突变体。种子编号信息：soar1-2：(stock number:FLAG_546D07)；soar1-3：(stock number:FLAG_500B04)。

根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）：根癌农杆菌菌株GV3101，由清华大学提供（记载文献：R.Berres,L.Otten,B.Tinland et al.Transformation of vitis tissue bydifferent strains of Agrobacterium tumefaciens containing the T-6b gene.Plant Cell Reports,1992(11):192-195.）。

大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α（DE3）感受态，购自全式金生物有限公司。

SOAR1蛋白抗体：以特异性较高的由序列表中序列3的第299-602位氨基酸组成的肽段作为免疫原，免疫兔子，制备得到的兔源多克隆抗体。

实施例1、SOAR1转基因植物的获得及鉴定

本实施例中所涉及的SOAR1基因来源于拟南芥（Arabidopsis thaliana），其在拟南芥基因组中的序列如序列表中序列1所示，序列1由2216个核苷酸组成，其中第653-763位为内含子序列；所述SOAR1基因的cDNA序列如序列表中序列2所示，序列2由2105个核苷酸组成，其中第89-1897位为编码序列（ORF）；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由602个氨基酸残基组成。

经过生物信息学预测，SOAR1是PPR蛋白家族中的一员。

在http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/index.htmla数据库中对SOAR1进行预测，发现SOAR1蛋白是由N端信号肽、中间三角形五肽富足蛋白区和C端未知功能区段构成。

生物信息学预测表明所发现蛋白SOAR1是一种新发现的PPR蛋白（三角形五肽富足蛋白），其编码基因（SOAR1）是PPR蛋白家族中的一个新基因。

一、重组表达载体pCAMBIA-1300-221-SOAR1的构建

提取拟南芥野生型（Col-0生态型）的总RNA，反转录后获得cDNA。以所得cDNA为模板，通过引物1与引物2进行PCR扩增，反应结束后对其产物进行纯化，表明扩增得到约1800bp片段，测序表明，该片段具有自序列表中的序列2自5’端起第89-1897位核苷酸序列（SOAR1基因的编码序列，ORF）。

引物1：5’-CGGGATCCTATGAACTCTCTGTTCACCGCC-3’（下划线部分为BamH I的识别位点，该序列的第10-30位为序列2的第89-109位）

引物2：5’-ACGCGTCGACTCACTCAAAATCCCCTGCATCTC-3’（下划线部分为Sal I的识别位点，其后的序列为序列2的第1875-1897位的反向互补序列）

用限制性内切酶BamH I和Sal I双酶切以上所得PCR产物，胶回收酶切片段，与经过同样双酶切的pCAMBIA-1300-221载体骨架大片段相连，得到重组质粒。将所述重组质粒送样测序，将经测序表明在pCAMBIA-1300-221载体的酶切位点BamH I和Sal I之间插入“T+序列2的第89-1897位”所示DNA片段的重组质粒命名为pCAMBIA-1300-221-SOAR1。在重组表达载体pCAMBIA-1300-221-SOAR1中，启动所述SOAR1基因转录的启动子为35S启动子。

在重组表达载体pCAMBIA-1300-221-SOAR1的构建过程中，也可以人工合成的序列表的序列2所示的SOAR1基因为模板。

二、SOAR1基因表达降低突变体鉴定

SOAR1基因表达降低的两个T-DNA插入突变体，将其命名为soar1-2和soar1-3，购买自INRA凡尔赛遗传学和植物育种实验室拟南芥资源中心（Versailles Genetics andPlant Breeding Laboratory,Arabidopsis thaliana Resource Centre，http://dbsgap.versailles.inra.fr/portail/）,背景为拟南芥野生型（Col-0生态型）。通过分子生物学方法鉴定出各自的纯合体，并通过测序对突变体T-DNA插入位点进行分析。

测序比对结果如图1所示：

soar1-2突变体中的T-DNA插入在SOAR1基因的起始密码子（ATG）前352bp（启动子区）位置；

soar1-3突变体中的T-DNA插入在SOAR1基因的起始密码子（ATG）前77bp（5’非翻译区）位置。

所用引物序列如下：

(1)soar1-2(stock number:FLAG_546D07)

LB4:5’-CGTGTGCCAGGTGCCCACGGAATAGT-3’(Left border primer,LB)

soar1-2LP:5’-GTGAACCAACTCAACACTCGG-3’(Left primer,LP)

soar1-2RP:5’-TCACCGCAATGTATCTACCATC-3’(Right primer,RP)

(2)soar1-3(stock number:FLAG_500B04)

LB4:5’-CGTGTGCCAGGTGCCCACGGAATAGT-3’

soar1-3LP:5’-GCTCGTATAGCTTGTTGCACC-3’

soar1-3RP:5’-ATAACCACATCCATTGCCTTG-3’

三、SOAR1转基因拟南芥的获得及鉴定

1、SOAR1转基因拟南芥及转入pCAMBIA-1300-221空载体的拟南芥植株的获得

将步骤一构建的重组表达载体pCAMBIA-1300-221-SOAR1通过冻融法导入农杆菌GV3101感受态。对转化后的重组农杆菌用由引物1和引物2组成的引物对进行PCR鉴定。将经鉴定表明含有SOAR1基因（PCR目的条带大小为1800bp）的农杆菌GV3101命名为pCAMBIA-1300-221-SOAR1；将转入pCAMBIA-1300-221空载体的农杆菌GV3101命名为空-GFP/pCAMBIA-1300-221。

采用农杆菌花序侵染的方法（SJ Clough,AF Bent.Floral dip:a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.The Plant Journal,1998,16(6):735-743.）将上述所得的重组农杆菌pCAMBIA-1300-221-SOAR1（或空-GFP/pCAMBIA-1300-221）转化拟南芥野生型（Col-0）。

转化后进行潮霉素抗性筛选，在含40mg/L潮霉素MS培养基上培养，收集具有潮霉素抗性的转基因拟南芥的种子，获得具有潮霉素抗性的两种转基因苗，即转入pCAMBIA-1300-221-SOAR1的拟南芥植株和转入pCAMBIA-1300-221空载体的拟南芥植株（T₁代）。

2、SOAR1转基因拟南芥鉴定

（1）PCR鉴定

从步骤1获得的T₁代SOAR1转基因拟南芥，以及转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株中分别提取基因组DNA。对于SOAR1转基因拟南芥，以引物1和引物2（序列同步骤一所述）进行PCR扩增，经鉴定同时得到大小约为1800bp（外源插入的序列2所示SOAR1基因）和1900bp（拟南芥内源的序列1所示SOAR1基因）两个目的条带的植株即为SOAR1转基因阳性植株，而鉴定只得到大小为1900bp目的条带的植株为SOAR1转基因阴性植株。对于转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株，用GFP引物GFP-F1和GFP-R1（引物序列如下）进行PCR鉴定，经鉴定表明含有GFP基因的（PCR产物大小约为700bp）植株即为pCAMBIA-1300-221空载体转入阳性的植株。所用引物序列如下：

GFP-F1：5’-AGGAGAAGAACTTTTCACTGG-3’；

GFP-R1：5’-GTATAGTTCATCCATGCCATG-3’。

经上述PCR分子鉴定，将鉴定阳性的其中三个SOAR1转基因拟南芥株系分别记作OE1、OE3和OE6。

（2）遗传学分离比方法鉴定插入拷贝数

根据遗传学原理，单拷贝插入之后自交后代会产生3:1的分离比。结合统计学的方法，统计抗生素培养基上抗性苗和非抗性苗的数量。用分离比方法鉴定出转基因植株为单拷贝插入的株系（单拷贝SOAR1转基因拟南芥），从而用于纯合体的筛选。

（3）转基因拟南芥OE1、OE3和OE6纯合系的筛选

经上述鉴定分析后，选择其中三个代表性单拷贝SOAR1转基因拟南芥株系，OE1、OE3和OE6（T₁代）。播种于含40mg/L潮霉素MS培养基上，经过连续2代筛选，以所有自交后代均能正常生长（即所有后代均具潮霉素抗性）的亲本植株为纯合系，最终获得T₃代转基因拟南芥OE1、OE3和OE6的纯合系植株，作为实验材料进行以下ABA耐受性试验分析。

四、转基因拟南芥OE1、OE3和OE6纯合系中SOAR1基因表达量分析

提取拟南芥野生型（Col-0生态型）与T-DNA插入突变体soar1-2、soar1-3，过表达植株OE1、OE3和OE6的总RNA和总蛋白，利用实时荧光定量PCR和免疫印迹技术，分别检测这些遗传材料中SOAR1基因在转录水平和翻译水平上的RNA和蛋白表达情况。具体如下：

1、转录水平分析（RNA表达量）

以上述获得的转基因拟南芥OE1、OE3和OE6纯合系，T-DNA插入突变体soar1-2、soar1-3,以及拟南芥野生型（Col-0生态型）萌发后1d的种子为实验材料。提取各实验材料的基因组RNA，分别通过实时荧光定量PCR方法分析SOAR1基因在各实验材料中的表达情况。其中，扩增SOAR1基因的引物序列为：

引物SOAR1-F：5’-TACGGAACTTAGGTTGCTTGAG-3’（序列2的第715-736位），

引物SOAR1-R：5’-AACAACAGTCGGCTTCACATTC-3’（序列2的第925-946位的反向互补序列）。

以Actin2/8作为内参基因，扩增内参Actin的引物序列为：

Actin-F：5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’，

Actin-R：5’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’。

上述引物的反应条件如下：

（1）反应体系的建立

实时荧光定量PCR反应体系

（2）三个重复，轻甩混匀，用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪进行实验。

（3）反应程序的设定：

实时荧光定量PCR反应程序

（4）数值分析，Ct值为PCR管中荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数，ΔCt=Ct(Gene)-Ct(Actin)，以2^-ΔCt的值衡量基因转录水平,分析各基因的表达情况。

2、翻译水平分析（蛋白表达量）

（1）拟南芥总蛋白提取

1)取适量植物材料（萌发后1d的种子），在液氮中充分研磨，粉末移入遇冷的离心管中，称重并记录；

2)按2mL/g加入拟南芥总蛋白提取缓冲液，混匀后在冰上放置1h，期间颠倒混匀3～4次；

3)4℃下12,000rpm离心2次，每次15min，取上清，液氮速冻，-80℃保存。

（2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE

1)样品准备：蛋白样品与上样缓冲液混合，沸水煮5～10min，12000rpm离心5min；

2)玻璃板洗净装好，配制适当浓度的分离胶与浓缩胶溶液，注入胶板制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶。分离胶与浓缩胶配方如下所示：

分离胶配方

浓缩胶配方

3)把胶板按Bio-Rad Mini III的要求装好后，加入400mL1×电泳缓冲液，上样，80V恒压电泳20～30min后，换150V恒压电泳约1h，至溴酚蓝跑出分离胶后停止电泳。

（3）蛋白质免疫印迹Western blot

1)按照Bio-Rad湿转法转膜的要求进行电泳（100mA恒流电泳8～10h），将胶上的蛋白转至硝酸纤维膜上；

2)把膜放入封闭液中，在脱色摇床上室温慢摇3h；

3)封闭结束后，把膜放入一抗（SOAR1蛋白抗体，兔源多克隆抗体）溶液中，在脱色摇床上室温慢摇2h；

4)用TBST1洗膜3次，每次10min，洗膜时摇床转速为150～160rpm；

5)把膜放入二抗（Cell Signaling Technology公司产品，其产品目录号为Anti-rabbitIgG,AP-linked Antibody#7054，为羊抗兔抗体）溶液中，在脱色摇床上室温慢摇1h；

6)用TBST2洗膜2次，每次10min，洗膜时摇床转速为150～160rpm；

7)用TBS洗膜2次，每次10min，洗膜时摇床转速为150～160rpm；

8)把膜放入显色液中进行显色，显色完成后将膜放入ddH₂O中，终止反应。

同时以Actin作为内参。

各遗传材料中SOAR1基因表达量的分析结果如图2所示。具体的，SOAR1相关遗传材料的实时荧光定量PCR检测结果如图2中(a)所示，SOAR1基因的表达均为相对值，以拟南芥野生型（Col-0生态型）SOAR1基因的表达为1。SOAR1相关遗传材料免疫印迹检测结果如图2中(b)所示，SOAR1蛋白的表达均为相对值，以拟南芥野生型（Col-0生态型）SOAR1蛋白的表达为100。从图2中可以看出，相比拟南芥野生型（Col-0生态型），步骤三获得的转基因拟南芥OE1、OE3和OE6纯合系中SOAR1基因的表达量显著提高，T-DNA插入突变体soar1-2、soar1-3中SOAR1基因的表达在转录水平和翻译水平上相对于拟南芥野生型（Col-0）均明显调低。

实施例2、SOAR1转基因植物抗盐胁迫分析试验

盐胁迫作为一个重要的非生物胁迫，是指植物生长在高盐分环境下受到的高渗透势对植物生长产生的胁迫作用。植物抵抗盐胁迫主要是依靠细胞合成一些对原生质无伤害的物质以调节细胞渗透势，从而抵御盐胁迫伤害的生理过程。

一、NaCl对SOAR1各遗传材料种子萌发的影响

以拟南芥野生型（Col-0生态型）、SOAR1基因表达降低的两个T-DNA插入突变体soar1-2和soar1-3、实施例1得到的单拷贝插入的T3代纯合体SOAR1转基因株系OE1、OE3和OE6，以及实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株为实验材料。将各实验材料的种子播种在含有不同浓度NaCl的MS培养基上（0mM和100mM）（每种实验材料播种80-100粒）。4℃下低温层积3d后移入光照培养箱中。记录种子在层积后的24h到60h之间的萌发数，每隔12h记录一次，并对结果进行统计。实验重复3次，结果取平均值。

结果如图3所示，在含有0mM NaCl的培养基上，各种实验材料种子的最终萌发情况基本一致。在含100mM NaCl的培养基上，soar1-2、soar1-3相对于拟南芥野生型（Col-0生态型），其种子萌发明显受到抑制；而SOAR1转基因株系OE1、OE3和OE6的种子萌发几乎没有受到盐胁迫的影响。而对于实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株，无论是在含有NaCl的培养基上，还是在不含有NaCl的培养基上，其种子萌发情况均与拟南芥野生型（Col-0生态型）基本一致，无统计学差异。

二、NaCl对SOAR1各遗传材料幼苗生长的影响

以拟南芥野生型（Col-0生态型）、SOAR1基因表达降低的两个T-DNA插入突变体soar1-2和soar1-3、实施例1得到的单拷贝插入的T3代纯合体SOAR1转基因株系OE1、OE3和OE6，，以及实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株为实验材料。将各实验材料的种子分别播种在含有不同浓度NaCl的MS培养基上（0mM和100mM）（每种实验材料播种80-100粒）。4℃下低温层积3d后移入光照培养箱中，10d后观察各拟南芥幼苗子叶及主根的生长情况。实验重复3次，结果取平均值。

结果如图4所示，在含0mM NaCl的培养基上，各种遗传材料的幼苗都能够正常生长，且主根生长一致。在含100mM NaCl的MS培养基上，soar1-2、soar1-3相对于拟南芥野生型（Col-0生态型），幼苗发育缓慢，且主根生长受阻明显。而SOAR1转基因株系OE1、OE3和OE6的幼苗生长以及主根生长受到的抑制较弱，与拟南芥野生型（Col-0）差异显著。而对于实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株，无论是在含有NaCl的培养基上，还是在不含有NaCl的培养基上，其幼苗生长情况均与拟南芥野生型（Col-0生态型）基本一致，无统计学差异。

综合本实施例的实验结果，可见实施例1得到的单拷贝插入的T3代纯合体SOAR1转基因株系OE1、OE3和OE6表现出较高的抗盐性。

实施例3、SOAR1转基因植物抗旱分析试验

本实施例以甘露醇模拟干旱对植物的逆境胁迫。

一、甘露醇对SOAR1遗传材料种子萌发的影响

以拟南芥野生型（Col-0生态型）、SOAR1基因表达降低的两个T-DNA插入突变体soar1-2和soar1-3、实施例1得到的单拷贝插入的T3代纯合体SOAR1转基因株系OE1、OE3和OE6，以及实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株为实验材料。将各实验材料的种子分别播种在含有不同浓度甘露醇的MS培养基上（0mM和300mM）（每种实验材料播种80-100粒）。4℃下低温层积3d后移入光照培养箱中。记录种子在层积后的24h到120h之间的萌发数，每隔12h记录一次，并对结果进行统计。实验重复3次，结果取平均值。

结果如图5所示，在含有0mM甘露醇的培养基上，各种实验材料种子的萌发情况基本一致。在含300mM甘露醇的培养基上，soar1-2、soar1-3相对于拟南芥野生型（Col-0生态型），其种子萌发明显受到抑制；而SOAR1转基因株系OE1、OE3和OE6的种子萌发几乎没有受到甘露醇胁迫的影响。而对于实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株，无论是在含有甘露醇的培养基上，还是在不含有甘露醇的培养基上，其种子萌发情况均与拟南芥野生型（Col-0生态型）基本一致，无统计学差异。

二、甘露醇对SOAR1遗传材料幼苗生长的影响

以拟南芥野生型（Col-0生态型）、SOAR1基因表达降低的两个T-DNA插入突变体soar1-2和soar1-3、实施例1得到的单拷贝插入的T3代纯合体SOAR1转基因株系OE1、OE3和OE6，以及实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株为实验材料。将各实验材料的种子分别播种在含有不同浓度甘露醇的MS培养基上（0mM和300mM）（每种实验材料播种80-100粒）。4℃下低温层积3d后移入光照培养箱中水平生长，7d后观察各个突变体幼苗生长的情况。实验重复3次。

结果如图6所示，在含有0mM甘露醇的培养基上，各种实验材料幼苗的生长情况基本一致，都能够正常生长。在含300mM甘露醇的培养基上，相对于拟南芥野生型（Col-0生态型），soar1-2和soar1-3突变体幼苗发育缓慢，且幼苗的子叶与主根生长受阻明显。而SOAR1转基因株系OE1、OE3和OE6的幼苗生长以及主根生长受到的抑制较弱。而对于实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株，无论是在含有甘露醇的培养基上，还是在不含有甘露醇的培养基上，其幼苗生长情况均与拟南芥野生型（Col-0生态型）基本一致，无统计学差异。

综合本实施例的实验结果，可见实施例1得到的单拷贝插入的T3代纯合体SOAR1转基因株系OE1、OE3和OE6表现出较高的抗旱性。

实施例4、SOAR1转基因植物抗低温分析试验

低温胁迫作为一种非生物胁迫分为冷害与冻害两种：冷害是0℃以上低温对植物细胞造成的危害；冻害是0℃以下低温对植物细胞造成的危害。

一、低温胁迫对SOAR1各遗传材料幼苗生长的影响

以拟南芥野生型（Col-0生态型）、SOAR1基因表达降低的两个T-DNA插入突变体soar1-2和soar1-3、实施例1得到的单拷贝插入的T3代纯合体SOAR1转基因株系OE1，以及实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株为实验材料。将各实验材料的种子播种在MS基本培养基上（每种实验材料播种80-100粒），4℃低温层积3d后移入光照培养箱培养2周，将幼苗与培养皿一起放入低温培养箱从-1℃开始，每小时降低1℃，直至到-4℃，之后每隔0.5h时间梯度取出一组实验材料。取出的实验材料放入4℃避光过夜，之后移入光照培养箱正常培养24h，观察各个遗传材料的生长情况，并统计幼苗存活率。实验重复3次，结果取平均值。

幼苗生长状态结果如图7所示，当温度降到-4℃后，0h取出的培养基上soar1-2、soar1-3、OE1与拟南芥野生型（Col-0生态型）幼苗生长良好，表明此时植物已经受到3h冻害，但是没有外在生理表现；2h取出的培养基上能够看到拟南芥野生型（Col-0生态型）幼苗已经受到冷胁迫，一部分幼苗白化死亡。soar1-2和soar1-3相对于拟南芥野生型（Col-0生态型），白化死亡的幼苗明显增多；而SOAR1转基因株系OE1受到的伤害则比较微弱，幼苗基本没有白化死亡。而对于实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株，各检测时间点其幼苗生长情况均与拟南芥野生型（Col-0生态型）基本一致，无统计学差异。

幼苗存活率统计结果如图8和表1所示，当温度降到-4℃后，随着低温胁迫时间的增加，soar1-2和soar1-3的存活率明显低于拟南芥野生型（Col-0生态型），而SOAR1转基因株系OE1的存活率则明显的高于拟南芥野生型（Col-0生态型）。

表1 各遗传材料幼苗存活率统计结果（单位：%）

二、电解质渗透率的测定

(1)所需材料：生长在22℃（作为对照）和4℃处理所需天数的拟南芥。

(2)将其对称叶片（第三，四对真叶）剪下放在15mL的玻璃试管中，各遗传材料各取大约10片。

(3)加10mL ddH₂O，用真空泵抽气30min，使叶片变成半透明状。

(4)置于摇床中室温摇1h，之后用电导仪测其初电导值S1。

(5)将各个玻璃样品置沸水中水浴15min。

(6)置于摇床中室温摇2h，之后用电导仪测其电导值S2。

(7)将ddH₂O处理的作为空白对照S0。

(8)电解质渗透率（%），即：

相对电导率（L）=（S1-S0）/（S2-S0），电解质渗透率（%）=相对电导率*100，

电解质渗透率是一个体现植物遭受逆境胁迫时细胞受到损伤严重与否的指标，植物受到的伤害越强烈，其植株的电解质渗透率越高。植株的电解质渗透率通过测定植物组织浸提液或外渗液的电导率的高低，来衡量和评估植株的电解质渗透率，进而植物遭受逆境胁迫时所受伤害的程度。

本发明的发明人将正常生长2周的拟南芥野生型（Col-0生态型）、SOAR1基因表达降低的两个T-DNA插入突变体soar1-2和soar1-3、实施例1得到的单拷贝插入的T3代纯合体SOAR1转基因株系OE1，以及实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株，分别在22℃与4℃培养0h、1h、2h，测量这些植株的电解质渗透率。实验重复3次，结果取平均值。

结果如图9所示，随着4℃处理时间的增长，soar1-2和soar1-3的电解质渗透率明显高于拟南芥野生型（Col-0生态型），而SOAR1转基因株系OE1的电解质渗透率明显低于拟南芥野生型（Col-0生态型）。而对于实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株，各检测时间点其电解质渗透率均与拟南芥野生型（Col-0生态型）基本一致，无统计学差异。

综合本实施例的实验结果，可见实施例1得到的单拷贝插入的T3代纯合体SOAR1转基因株系OE1、OE3和OE6表现出较高的抗低温性。

Claims (7)

1.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质在如下a1)或a2)中的应用：

a1)调控拟南芥抗逆性；

a2)选育抗逆性提高的拟南芥品种；

所述抗逆性为如下中的至少一种：抗盐性、抗旱性和抗低温性。

2.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因在如下a1)或a2)中的应用：

a1)调控拟南芥抗逆性；

a2)选育抗逆性提高的拟南芥植物品种；

所述抗逆性为如下中的至少一种：抗盐性、抗旱性和抗低温性。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：

1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第89至1897位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)序列表中序列1所示的DNA分子。

4.培育抗逆性提高的转基因拟南芥的方法，包括如下步骤：

a)向目的拟南芥中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因拟南芥；

b)从步骤a)所得转基因拟南芥中得到与所述目的拟南芥相比，抗逆性提高的转基因拟南芥；

所述抗逆性为如下中的至少一种：抗盐性、抗旱性和抗低温性。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：

1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第89至1897位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)序列表中序列1所示的DNA分子。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的拟南芥中的。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述编码基因转录的启动子为35S启动子。