CN110862992A - 野葡萄锚定重复蛋白VdANK1的编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了野葡萄锚定重复蛋白VdANK1的编码基因与应用，VdANK1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，开放阅读框从第108~1442位碱基，它所编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，本发明抗性提供一种增强植物对病原菌的新的基因VdANK1，通过分离克隆葡萄叶片中VdANK1基因的DNA片段，与能够超量表达该目标基因的载体连接，转化入植物细胞，通过超量表达VdANK1基因改良植物对病原菌的抗性，控制病害的发生，减少或避免植物病害所带来的损失，本发明的VdANK1基因也为植物抗病拓宽植物的抗谱，克服传统育种不能植物种间转移抗病相关基因的问题。

Description

野葡萄锚定重复蛋白VdANK1的编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体为野葡萄锚定重复蛋白VdANK1的编码基因与应用。

背景技术

葡萄是世界上最古老的经济类果树之一，在世界果树产业中占据重要地位。研究发现，葡萄和葡萄酒中富含有益于人体的矿物质、维生素和多种必需氨基酸等物质，在世界各地被广泛栽培。欧洲葡萄易感多种真菌，如葡萄白粉菌（Uncinula necator (Schw.)Burr [syn. Erysiphe necator Schw.]）、葡萄霜霉菌（Plasmopara viticola）、葡萄黑痘菌（Elsinoe ampelina (deBary) Shear）和葡萄灰霉菌（Botrytis cinerea）等，严重危害葡萄及其加工产品的产量和品质。目前，针对葡萄真菌病害的防治主要依赖化学药剂，但是化学药剂的长期使用不仅增加了生产成本，而且给环境造成了长期性破坏，中国作为葡萄的重要起源地之一，同时也是野生葡萄属植物资源最丰富的国家。中国野生葡萄（2n=38）作为欧洲葡萄的近缘野生种，不仅对白粉病的抗性好，而且两者的杂交亲和性好。

锚蛋白（ankyrin）的主要结构特征是含有锚定重复序列ARK基序（ankyrin repeatmotif, ARK），其主要作用是参与蛋白质间的相互作用。锚蛋白属于连接蛋白成员之一，可以介导整合膜蛋白的附着到肌动蛋白上，在多种细胞质中发挥作用。锚蛋白的存在比较广泛，具有多种功能，参与胞内蛋白转运、信号转导、蛋白相互作用、机体生长等。在拟南芥中发现了AKR2蛋白，其中，AKR2A和AKR2B可以作为叶绿体外膜蛋白的胞质定位因子。而叶绿体外膜蛋白参与叶绿体的功能，包括蛋白转运，叶绿体与细胞质间的信息传导。因此AKR2A介导的蛋白可以直接或者间接在叶绿体活性中发挥作用，进一步研究发现，AKR2A可以在植物细胞代谢和植株生长发育中发挥重要作用，akr2a的点突变，植株表现为矮小、叶片变窄、开花时间延迟，AKR2A在植株的生长发育中发挥着重要作用，而且具有比AKR2B的作用大。AKR2A可以与 APX3 互作，发挥着分子伴侣的功能。此外，小热激蛋白 Hsp17.8 可以作为AKR2A的辅因子在叶绿体外面蛋白的定位中发挥作用。AKR2需要同时结合磷脂酰甘油和单半乳糖甘油二酯才能在叶绿体蛋白的定位中发挥作用。在拟南芥中，AKR2A介导的叶绿体外膜蛋白的定位，是与叶绿体外膜蛋白的翻译耦合的，在叶绿体蛋白质组的进化中发挥着重要作用，目前锚蛋白基因在植物抗病反应中作用仍不是很清楚。

发明内容

本发明的目的在于提供野葡萄锚定重复蛋白VdANK1的编码基因与应用，本发明涉及的VdANK1基因是葡萄锚蛋白家族成员之一。本研究在葡萄中克隆并分析了VdANK1基因在抗病反应中的作用，通过遗传转化相关基因改良葡萄抗病性弱的品种及其他植物品种，将进一步增强植物的抗病性，对于培育植物抗病新品种具有重要意义。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：野葡萄锚定重复蛋白VdANK1的编码，VdANK1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示，长度1812bp，开放阅读框从第108~1442位碱基，它所编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该蛋白质的分子量为67.15，等电点为6.47，包含有两个Ankyrin repeat保守结构域。

野葡萄锚定重复蛋白VdANK1VdANK1的表达载体，其特征在于：表达载体含有如SEQID NO：1所示的野葡萄抗病相关锚定重复蛋白VdANK1的开放阅读框。

优选的，所述表达载体为pCAMBIA2301- VdANK1，其制备步骤如下：

（1）以葡萄cDNA为模板，P1、P2为引物，PCR扩增得到VdANK1基因的开放阅读框，将扩增片段连接到pMD19-T克隆载体上，筛选得到阳性质粒pMD19-T-VdANK1；

正向引物P1：5’-GGGAGATCT-3’，

反向引物P2：5’-GGGGGTGACC-3’；

P1下划线处为酶切位点Bgl II，P2下划线处为酶切位点BstE II；

（2）用Bgl II、BstE II分别双酶切阳性质粒pMD19-T- VdANK1和植物表达载体pCAMBIA2301，回收目标片段与线性化载体，连接、转化后筛选、验证，即得。

优选的，将植物超量表达载体pCAMBIA2301-VdANK1转化农杆菌。

优选的，所述野葡萄抗病相关锚定重复蛋白VdANK1的分离克隆方法包括：

（1）采用SDS/酚法提取葡萄叶片总RNA；

（2）纯化总RNA；

（3）以RNA为模板反转录合成cDNA第一链；

（4）以cDNA为模板进行PCR扩增；

（5）检测与回收。

野葡萄锚定重复蛋白VdANK1及其编码基因的应用，将植物超量表达载体pCAMBIA2301-VdANK1转化入植物，包括

（1）植物超量表达载体pCAMBIA2301-VdANK1转化入拟南芥；

（2）植物超量表达载体pCAMBIA2301-VdANK1转化入葡萄。

优选的，所述植物超量表达载体pCAMBIA2301-VdANK1转化入拟南芥的步骤包括：

（1）将转化植物表达载体pCAMBIA2301-VdANK1的农杆菌接种至10mL LB液体培养基中进行培养；

（2）将菌液转移至离心瓶或离心管中进行离心处理后收集菌体，并重悬于渗透缓冲液中；

（3）将去除果荚的南芥花浸入渗透缓中，浸透结束后清理掉南芥花上多余的渗透缓冲液，将南芥花放入培养箱中继续培养。

优选的，所述植物超量表达载体pCAMBIA2301-VdANK1转化入葡萄的步骤包括：

（1）将转化植物表达载体pCAMBIA2301-VdANK1的农杆菌接种至10mL LB液体培养基中进培养；

（2）将菌液转移至离心瓶或离心管中进行离心处理后收集菌体，加入相同体积的渗透缓冲液重悬；

（3）将葡萄叶片置于适量的重悬液中，置于水式真空循环泵中进行抽真空处理，将处理好的葡萄叶片取出并除去叶片表面的菌液，将葡萄叶片置于培养箱中培养。

本发明提供了野葡萄锚定重复蛋白VdANK1及其编码基因与应用，具备以下有益效果：

（1）本发明为增强植物对病原菌的抗性提供了一种新的基因VdANK1，通过分离克隆葡萄叶片中VdANK1基因的DNA片段，与能够超量表达该目标基因的载体连接，转化入植物细胞，通过超量表达VdANK1基因改良植物对病原菌的抗性，控制病害的发生，减少或避免植物病害所带来的损失。同时，本发明开发的VdANK1基因也为植物抗病拓宽了植物的抗谱，克服了传统育种不能植物种间转移抗病相关基因的问题。

（2）本发明通过克隆得到VdANK1基因的开放阅读框，并将含有VdANK1基因的植物超量表达载体转化入拟南芥和葡萄叶片，过量表达VdANK1能显著增强遗传转化的拟南芥的抗病能力和葡萄抗病相关基因的高表达，证明VdANK1基因在增强植物抗病中发挥重要作用，VdANK1基因的研究对培育抗病植物新品种具有重要的意义。

附图说明

图1为本发明的野葡萄VdANK1基因的表达特性分析；

图2为本发明的VdANK1基因转化拟南芥植株抗病性的鉴定；

图3为本发明的为VdANK1基因瞬时转化葡萄叶片后抗病性的单个克隆的病原菌孢子数鉴定；

图4为本发明的为VdANK1基因瞬时转化葡萄叶片后抗病性的PR1和PR1.2基因相对标达量鉴定；

图5为本发明的为VdANK1基因瞬时转化葡萄叶片后抗病性的鉴定。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1

野葡萄抗病相关锚定重复蛋白VdANK1的分离克隆，具体方法如下：

（1）采用SDS/酚法提取葡萄叶片总RNA，操作如下：

准备提取液：向2.0mL离心管中加入850 μL提取缓冲液（140 mM LiCl，10 mM EDTA，10mM Tris，5%(w/v) SDS，2%(w/v) PVP）与30 μL β-巯基乙醇，充分混匀，待用。

用液氮预冷研钵，取0.2 g葡萄幼嫩叶片于研钵中，加适量液氮充分研磨后，分装至含有预先准备提取液的2.0 mL离心管中，充分涡旋混匀，4℃条件下12000 rpm离心5min；吸取上清液至另一2.0 mL离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），充分涡旋混匀，4℃条件下12000 rpm离心15 min；吸取上清液至另一2.0 mL离心管中，加入1/3体积5 M的KAc（pH4.8），充分涡旋混匀，4℃条件下12000 rpm离心10 min；吸取上清液至另一2.0 mL离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），充分涡旋混匀，4℃条件下12000 rpm离心10min；吸取上清液至另一1.5 mL离心管中，加入1/3体积8 M LiCl，充分涡旋混匀，-20℃放置2 h以上，然后4℃条件下12000 rpm离心15 min；轻轻地除去上清液，用800 μL 75%乙醇洗涤沉淀两次（4℃条件下12000 rpm离心8 min）；空气中干燥10 min，待乙醇充分挥发，加入30 μL DEPC-H2O溶解沉淀，即得葡萄叶片总RNA。

（2）纯化总RNA

在1.5 mL离心管中加入：总RNA 100 μg，DNase I 10 U，10×DNase buffer 10 μL，RNasin 100 U，DEPC-H2O 补齐至100 μL，充分混匀，37℃温育30 min；加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（25:24:1），充分涡旋混匀，4℃条件下12000 rpm离心10 min；吸取上清液至另一1.5mL离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），充分涡旋混匀，4℃条件下12000rpm离心10min；吸取上清液至另一2ml离心管中，加入1/10体积3M NaAC（pH 5.2），2.5倍体积无水乙醇，-20℃放置2h以上；然后4℃条件下12000rpm离心15min；轻轻地除去上清液，用800μL75%乙醇洗涤沉淀两次（4℃条件下12000rpm离心8min）；空气中干燥10min待乙醇充分挥发，加入20μL DEPC-H2O溶解沉淀，即完成RNA纯化。

（3）以RNA为模板反转录合成cDNA第一链

在PCR管中加入：Random 6 mers（50μM）1μL，dNTP Mixture（10mM each）1μL，Total RNA2μg，RNase free dH2O补齐至10μL，充分混匀，瞬时离心使溶液至PCR管底部。在PCR仪上65℃反应5min，冰上急冷；在PCR管中加入：5×PrimeScript® Buffer 4μL，RNase Inhibitor（40U/μL）0.5μL，PrimeScript® RTase（200U/μL）1μL，RNase Free dH2O补齐至20μL。在PCR仪上进行下述反应：30℃，10min；42℃，60min；95℃，5min；4℃，保存；反转录完成后即得cDNA第一链；-40℃保存备用。

（4）以cDNA为模板进行PCR扩增

PCR克隆VdANK1基因的PCR反应体系为：cDNA模板1µL，正、反向引物P3、P4 各2µL，PCRBuffer 5µL，dNTP Mix 2.5µL，DNA Polymerase 1.0µL，PCR-Grade Water补齐至50µL，PCR反应程序为：94℃ 30sec，94℃ 30sec，56℃ 30sec，72℃ 3min，30cycles，72℃ 10min，4℃Forever；

正向引物P3：5’-TCATTCACCACTTTGCTTCGAAG-3’（SEQ ID NO.3）；

反向引物P4：5’-AGGGTGTCTAACATCATACACGT-3’（SEQ ID NO:4）。

（5）检测与回收

将PCR扩增的产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，回收目标片段，连接至pMD19-T载体，连接反应体系为：pMD19-T载体0.5 µl，Solution I 2.5µL，目标片段2.0µL，充分混匀，在16℃条件下反应2h转化，将连接产物转化感受态TOP10细胞，在附加100mg/L Amp培养基上进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆接种至LB液体培养基摇菌培养，提取质粒得阳性质粒pMD19-T-VdANK1，送公司测序检测，VdANK1基因序列如SEQ ID NO:1所示。

实施例2

野葡萄抗病相关锚定重复蛋白VdANK1超量表达载体的构建，具体方法如下：

以葡萄叶片cDNA为模板，以P1、P2为引物，P1下划线处为酶切位点Bgl II，P2下划线处为酶切位点BstE II。PCR扩增得到VdANK1基因片段，连接至pMD19-T载体；连接反应体系为：pMD19-T载体0.5µL，Solution I 2.5µL，目标片段2.0µL，充分混匀，在16℃条件下反应2h；将连接产物转化TOP10感受态细胞，在附加Amp的LB培养基上进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆接种至LB液体培养基摇菌培养，提取质粒得阳性质粒pMD19-T-VdANK1，送公司测序检测。将正确序列进行双酶切，双酶切反应体系为：质粒4µL，Bgl II内切酶0.5µL，BstE II内切酶0.5µL，ddH2O 15µL，充分混匀，37℃条件下反应2h；酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

用Bgl II、BstE II双酶切阳性质粒pMD19-T-VdANK1与植物表达载体pCAMBIA2301，回收目标片段与线性化载体进行连接；连接反应体系为：pCAMBIA2301线性化载体5µL，Solution I 10µL，目标片段5µL，充分混匀，16℃条件下反应2h；连接产物转化TOP10感受态细胞，在附加卡那霉素的LB培养基上进行筛选，挑取阳性克隆接种至LB液体培养基（含100mg/L的卡那霉素）中摇菌培养，提取质粒，送公司测序检测，序列正确的质粒命名为pCAMBIA2301-VdANK1。将正确序列进行双酶切，酶切反应体系为：质粒4µL，Bgl II内切酶0.5µL、BstE II内切酶0.5µL，ddH2O 15µL，充分混匀，在37℃条件下反应2h；酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例3

植物超量表达载体pCAMBIA2301-VdANK1转化农杆菌，具体方法如下：

电击杯置于紫外灯下处理20min；取出农杆菌GV3101感受态细胞，置于冰上融化，融化后转移至电击杯中，并加入10µL质粒，充分混匀，置于冰上5min；电击杯转移至电击仪中进行电击处理；处理后将电击杯中的转化液取出至1.5mL的离心管中，加入1mL LB培养基，28℃条件下培养1h；离心机中瞬时离心15s，去除部分上清液，悬浮后涂布在含有抗生素（60mg/L的庆大霉素，100mg/L的卡那霉素）的平板上，置于28℃培养。挑取单克隆接种至有抗生素（60mg/L的庆大霉素，100mg/L的卡那霉素）的液体LB培养基中，28℃条件下培养24h，经菌液PCR检测，得到阳性克隆。

实施例4

植物超量表达载体pCAMBIA2301-VdANK1转化入植物，包括以下操作：

1）物超量表达载体pCAMBIA2301-VdANK1转化入拟南芥

将转化植物表达载体pCAMBIA2301-VdANK1的农杆菌接种至10mL LB液体培养基（含60mg/L的庆大霉素，100mg/L的卡那霉素）中，28℃培养24h；取5mL菌液转移至50mL新鲜的LB液体培养基（含60mg/L的庆大霉素和100mg/L的卡那霉素），28℃继续培养，至菌液OD600达到0.6左右；将菌液转移至离心瓶或离心管中，室温条件下，转速为4000rpm离心10min，去除上清液，收集菌体；重悬于渗透缓冲液（0.5×MS，5%蔗糖，0.03% Silwet L-77），调OD600至0.8；将拟南芥花序上已有的果荚去掉，花序完全浸入渗透液中20s（10~30s均可，或者用移液器直接将渗透液滴在花序上），立即去掉拟南芥叶或茎秆上的渗透液，将植株平放在托盘中，用塑料薄膜覆盖托盘，24h后取下薄膜，于温室中继续培养；为提高转化效率，7天之后用同样方法再次侵染；经过转化的拟南芥植株进行正常管理，待果荚现白色时收获种子；将收获的转基因种子用0.2 %的TritonX-100浸泡10min；再用10%的次氯酸钠表面消毒12min；灭菌水洗涤五次，每次2min；少量水将种子混合均匀，用蓝色枪头（去尖）将种子铺在含除草剂（Basta，20mg/L）的MS（0.5×MS，1%蔗糖，1%琼脂，pH 5.7）平板上，4℃黑暗培养两天；然后转移至22℃，光照16h培养。经除草剂（Basta，20mg/L）筛选后仍然长势良好，真叶叶片及生长点呈深绿色且根部伸扎入培养基的幼苗即可初步确定为转基因植株，移栽至营养钵中继续培养。

2）植物超量表达载体pCAMBIA2301-VdANK1转化入葡萄

将转化植物表达载体pCAMBIA2301-VdANK1的农杆菌接种至10mL LB液体培养基（含60mg/L的庆大霉素，100mg/L的卡那霉素）中，28℃培养24h；取5mL菌液转移至50mL新鲜的LB液体培养基（含60mg/L的庆大霉素和100mg/L的卡那霉素），28℃继续培养，至菌液OD600达到0.6左右；将菌液转移至离心瓶或离心管中，室温条件下，转速为4000rpm离心10min，去除上清液收集菌体；加入相同体积的渗透缓冲液（10mM MES pH 5.6，10mM MgCl2，2%(w/v)sucrose and 150mM acetosyringone）重悬；将葡萄叶片置于适量的重悬液中，置于水式真空循环泵中进行抽真空处理，当真空泵压强指针为0.085MPa时开始计时，30min后缓慢释放气体；将处理好的葡萄叶片取出，用灭过菌的滤纸除去叶片表面的菌液，将叶片远轴面朝上置于托盘中，叶柄用脱脂棉保湿，托盘用保鲜膜覆盖，置于培养箱中培养。

试验例

1、野葡萄抗病相关锚定重复蛋白VdANK1在葡萄中的表达模式分析

为了证实VdANK1基因参与抗病反应的调控，采用荧光定量PCR（Real-time PCR）技术分析VdANK1基因在葡萄叶片接种白粉菌后的表达模式。接种方法按照Wang的方法（Wang Y等，Vitis34:159-164），SDS/酚法提取接种白粉菌后不同时间（0，12，24，36，48，60，72h）葡萄叶片的总RNA，按PrimeScript™ RT-PCR Kit说明书（购自TAKARA公司）进行反转录，7个不同时间的反转录产物作为Real-time PCR模板，检测葡萄VdANK1基因对葡萄叶片接种白粉菌后的响应。Real-time PCR采用SYBR Premix Ex TMTaq II试剂盒（购自TAKARA公司），并按照试剂盒说明书，在iCycler iQ5 Real-time PCR仪（美国Bio-Rad公司）上进行实时定量PCR反应。反应体系为：模板1μL，SYBR Mix 12.5μL，正、反向引物各1μL，灭菌蒸馏水补齐至25μL；反应程序为：95℃ 5min，95℃ 30s，68℃ 30s，72℃ 30s，30个循环，72℃ 5min，4℃10min。P5、P6为VdANK1基因扩增的正、反向引物，VvActin为内参基因，P7、P8为VvActin基因扩增的正、反向引物。

正向引物P5：5’- GACCCCCAAAAGGAACACAA-3’（SEQ ID NO:7）；

反向引物P6：5’- GAGCCAAAACGACCTGACAAT-3’（SEQ ID NO:8）。

正向引物P7：5’-TCCTGTGGACAATGGATGGA-3’（SEQ ID NO:9）；

反向引物P8：5’-CTTGCATCCCTCAGCACCTT-3’（SEQ ID NO:10）。

Thresh值按PCR仪默认为30，分别记录每个反应荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环数（threshold cycle，Ct），然后用2-△△Ct法以未接种白粉菌的叶片为对照，对不同组织、不同时间点VdANK1基因的相对表达量进行规一化。VdANK1基因在葡萄各个组织中均有表达，但表达量在不同组织之间存在差异。VdANK1在葡萄茎、果实和卷须中的表达量较低，在葡萄根、叶和花中表达量较高。VdANK1基因在接种病原菌24h后表达量急剧增加，48h时表达量达到高峰。在用外源物质SA、MeJA处理后，VdANK1基因表达量在处理12h后开始增加，36h时表达量达到高峰，48h表达量开始降低，随后呈下降趋势（如图1）。这说明VdANK1基因主要在根和叶片中表达，同时也是受白粉菌、SA、MeJA诱导表达的。

2、野葡萄抗病相关锚定重复蛋白VdANK1抗病性的鉴定

1）野葡萄抗病相关锚定重复蛋白VdANK1在拟南芥中抗病性鉴定

转化的拟南芥T3代转基因植株生长60天后进行抗病性鉴定。拟南芥白粉菌（Golovinomyces cichoracearum UCSC1）接种在pad4突变体植株上进行保存。选择生长一致的转基因植株，按照Wang的方法（Wang W等，2007，Molecular Plant-MicrobeInteractions 20:966-976）接种白粉菌。接种6天后检测转基因植株与野生型植株对白粉病的抗病性，采用Trypan blue染色法检测细胞程序性死亡，结果如图2所示，3个转基因系相对于野生型更抗病，显示较轻的感病症状；3个转基因系植株叶片产生超敏反应，野生型植株没有或者产生轻微的超敏反应。为进一步检测转基因植株与野生型植株对白粉病的抗病性，统计转基因植株与野生型植株在接种完病原菌后叶片上单个克隆的病原菌孢子数，结果显示转基因植株上的病原菌孢子数显著低于野生型植株（如图3）。进一步检测转基因植株与野生型植株在接种白粉病后体内抗病相关基因的表达量，结果显示转基因植株中水杨酸信号途径关键基因PR1、茉莉酸信号转导途径关键基因PDF1.2的表达量显著高于野生型（如图4）。以上结果说明超量表达VdANK1基因导致拟南芥植株抗病性增强。

2）野葡萄抗病相关锚定重复蛋白VdANK1在葡萄中抗病性鉴定

验证葡萄抗病相关基因VvSTS、VvPR1、VvPR10、VvNPR1在VdANK1基因转化入葡萄叶片后的表达情况。VdANK1基因瞬时转化葡萄叶片24h后，按照Wang的方法（Wang Y等，1995，Vitis34:159-164）接种白粉菌，接种完成后继续培养24h。以对葡萄叶片喷水处理作为对照，提取转化VdANK1基因组与对照组葡萄叶片总RNA，用Real-time PCR技术检测葡萄抗病相关基因VvSTS、VvPR1、VvPR10和VvNPR1的表达。以P9、P10为VvSTS基因扩增的正、反向引物，P11、P12为VvPR1基因扩增的正、反向引物，P13、P14为VvPR10基因扩增的正、反向引物，P15、P16为VvNPR1基因扩增的正、反向引物，内参VvActin基因扩增的引物与试验例1中相同。

正向引物P9：5'-GAAACGCTCAACGTGCCAAGG-3’（SEQ ID NO:11）；

反向引物P10：5'-GTAACCATAGGAATGCTATGTAGC-3'（SEQ ID NO:12）。

正向引物P11：5'-GGAGTCCATTAGCACTCCTTTG-3’（SEQ ID NO:13）；

反向引物P12：5'-CATAATTCTGGGCGTAGGCAG-3’（SEQ ID NO:14）。

正向引物P13：5'-CCAACCAATCCTCCTCCTCTTC-3’（SEQ ID NO:15）；

反向引物P14：5'-CATCTCCGTCAACCACAGTGTA-3’（SEQ ID NO:16）。

正向引物P15：5'-TCTCCGATTCCAACGACTTCAG-3’（SEQ ID NO:17）；

反向引物P16：5'-CATCATCAACGCACGCACAA-3’（SEQ ID NO:18）。

PCR反应在iCycler iQ5 Real-time PCR 仪（美国Bio-Rad 公司）上进行。以2-△△Ct法计算基因的相对表达量。结果如图3所示，在接种白粉菌后，转化的葡萄叶片中抗病相关基因VvSTS、VvPR1、VvPR10、VvNPR1相对于未转化的葡萄叶片其表达量显著增加（如图5），说明转化VdANK1基因后葡萄叶片抗病相关基因表达量的上升，增强了转化植株的抗病性。

: NO.1

AGCTAGCCAAAGCAGGGCCCATTTCAGTTAAACTTTCAGTTGTCCAGTTACAAACTCGGAGCTCAAAGCGCCGTAGCAGTTCTGAAGAACTCAAGAACATGGCTCCTCCCCAAAATCAACTCAATCTGAACAACTCTGTCCTAGCCCTCCTTGAAAGATGCATTCATCTCAATCATCTCAAGCAGCTCCAAGCCTTTCTCATCACTCTCGGCCATGCCCAGACTCATTTCTACGCCTTCAAGCTCCTCCGCTTCTGCACTCTAGCCCTCTCCAATCTCTCCTACGCTCGCTTCATCTTCGACCACGTCGAATCCCCCAATGTCTACCTCTACACTGCAATGATCACTGCTTATGCTTCTCATTCTGATCACACTTCAGCCCTTCTTTTGTACCGCAACATGGTTCGTCGCCGTCGGCCTTGGCCCAACCATTTTATCTACCCTCATGTCTTGAAGTCGTGCACCCAGGTCGTGGGGCCGGGGAGTGCGAGAATGGTGCATTGTCAGGTGCTGAGGTCGGGTTTTGAACAATACCCAGTTGTGCAAACAGCTCTTCTTGATGCCTACTTGAGGTTTTGGTCTGATGTGGAAAGTGCGCGTCTCTTGTTTGATGAAATGACTGAGAGGAATGTTGTGTCTTGGACAGCTATGATTTCTGGGTACACGAGGCTTGGACAGATTGGGAATGCTGTATTGTTGTTTGAGGAAATGCCCGAGAGGGATGTGCCGTCTTGGAACGCTTTGATTGCTGGTTACACACAGAATGGGTTGTTCATGGAGGCGTTATCACTTTTCAGGAGAATGATTGCCGTTGAGGCGGGAGCTTGGGGTCAAGGAAATAGGCCAAATCAGGTTACTGCTGTGTGCTCACTCTCAGCTTGTGGTCACACTGGTATGCTCCGGCTTGGTAAATGGATACATGGTTATGTTTACAGAAATGGGCTTGGTTTGGATTCATTTGTATCTAATGCTCTGGTGGATATGTATGGGAAATGTGGATGTTTGAAAGAGGCAAGAAGGGTTTTTGATAGGACATTGGAGAGAAGCTTGACATCATGGAATTCCATGATCAATTGTCTCGCCCTCCATGGGCAAAGTCAGAATGCAATAAGTGTGTTTGAGGAGATGATGACATGTGGAAGTGGTGTAAAACCTGATGAAGTTACATTTATTGGCTTGTTGAATGCCTGTACCCATGGGGGTTTGGTTGAAAAAGGTTGGCTTTATTTTGAGCTGATGACTCAAAATTATGGGATAGAACCTCAGATTGAGCATTATGGTTGCTTGGTAGATCTTCTTGGTCGTGCAGGTCAGTTTGAAGAAGCTATGGAGGTTGTAAGGGGAATGAGAATTGAACCTGATGAGGTTATTTGGGGCTCTTTGCTTAATGGATGTAAGATTCATGGCCACACAGATTTGGCTGAATTTTCCATTAAAAAATTGATTGATATGGATCCAAATAATGGTGGTTATGGTATAATGTTGGCAAATATATATGGGGAGCTAGGCAAGTGGGATGAGGTTCGGAAGGTTCGGAAGGTGTTGAAGGAGCAGAATGCCCACAAGACCCCTGGTTGCAGTTGGATTGAAATTGACAACCAAGTTCATCAATTCTATTCTGTTGATAAAACACATCCTAGAACGGAGGAGATATACAATACATTGGAGAGTCTGATTAGTCTGTACTAGCTTAGAGGTGCTGGGGTTTTTCCCACAATTATAAAAACGGTTTAAAAAATAAAATTTTGAGTTTACAGGAGTTCAAATTTGATTCCTAATTCTCAAACTACATGTTTCACATGCCTACAGCACTATTCTGCTTTGGAGGGTAACCCTCTCAAGTCCTTATGGAAGTGGTTGATGAGGGGCCAAGGT

SEQ: NO.2

MAPPQNQLNLNNSVLALLERCIHLNHLKQLQAFLITLGHAQTHFYAFKLLRFCTLALSNLSYARFIFDHVESPNVYLYTAMITAYASHSDHTSALLLYRNMVRRRRPWPNHFIYPHVLKSCTQVVGPGSARMVHCQVLRSGFEQYPVVQTALLDAYLRFWSDVESARLLFDEMTERNVVSWTAMISGYTRLGQIGNAVLLFEEMPERDVPSWNALIAGYTQNGLFMEALSLFRRMIAVEAGAWGQGNRPNQVTAVCSLSACGHTGMLRLGKWIHGYVYRNGLGLDSFVSNALVDMYGKCGCLKEARRVFDRTLERSLTSWNSMINCLALHGQSQNAISVFEEMMTCGSGVKPDEVTFIGLLNACTHGGLVEKGWLYFELMTQNYGIEPQIEHYGCLVDLLGRAGQFEEAMEVVRGMRIEPDEVIWGSLLNGCKIHGHTDLAEFSIKKLIDMDPNNGGYGIMLANIYGELGKWDEVRKVRKVLKEQNAHKTPGCSWIEIDNQVHQFYSVDKTHPRTEEIYNTLESLISLY

序列表

<110> 河南科技大学

<120> 野葡萄锚定重复蛋白VdANK1的编码基因与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1874

<212> DNA

<213> VdANK1

<400> 1

agctagccaa agcagggccc atttcagtta aactttcagt tgtccagtta caaactcgga 60

gctcaaagcg ccgtagcagt tctgaagaac tcaagaacat ggctcctccc caaaatcaac 120

tcaatctgaa caactctgtc ctagccctcc ttgaaagatg cattcatctc aatcatctca 180

agcagctcca agcctttctc atcactctcg gccatgccca gactcatttc tacgccttca 240

agctcctccg cttctgcact ctagccctct ccaatctctc ctacgctcgc ttcatcttcg 300

accacgtcga atcccccaat gtctacctct acactgcaat gatcactgct tatgcttctc 360

attctgatca cacttcagcc cttcttttgt accgcaacat ggttcgtcgc cgtcggcctt 420

ggcccaacca ttttatctac cctcatgtct tgaagtcgtg cacccaggtc gtggggccgg 480

ggagtgcgag aatggtgcat tgtcaggtgc tgaggtcggg ttttgaacaa tacccagttg 540

tgcaaacagc tcttcttgat gcctacttga ggttttggtc tgatgtggaa agtgcgcgtc 600

tcttgtttga tgaaatgact gagaggaatg ttgtgtcttg gacagctatg atttctgggt 660

acacgaggct tggacagatt gggaatgctg tattgttgtt tgaggaaatg cccgagaggg 720

atgtgccgtc ttggaacgct ttgattgctg gttacacaca gaatgggttg ttcatggagg 780

cgttatcact tttcaggaga atgattgccg ttgaggcggg agcttggggt caaggaaata 840

ggccaaatca ggttactgct gtgtgctcac tctcagcttg tggtcacact ggtatgctcc 900

ggcttggtaa atggatacat ggttatgttt acagaaatgg gcttggtttg gattcatttg 960

tatctaatgc tctggtggat atgtatggga aatgtggatg tttgaaagag gcaagaaggg 1020

tttttgatag gacattggag agaagcttga catcatggaa ttccatgatc aattgtctcg 1080

ccctccatgg gcaaagtcag aatgcaataa gtgtgtttga ggagatgatg acatgtggaa 1140

gtggtgtaaa acctgatgaa gttacattta ttggcttgtt gaatgcctgt acccatgggg 1200

gtttggttga aaaaggttgg ctttattttg agctgatgac tcaaaattat gggatagaac 1260

ctcagattga gcattatggt tgcttggtag atcttcttgg tcgtgcaggt cagtttgaag 1320

aagctatgga ggttgtaagg ggaatgagaa ttgaacctga tgaggttatt tggggctctt 1380

tgcttaatgg atgtaagatt catggccaca cagatttggc tgaattttcc attaaaaaat 1440

tgattgatat ggatccaaat aatggtggtt atggtataat gttggcaaat atatatgggg 1500

agctaggcaa gtgggatgag gttcggaagg ttcggaaggt gttgaaggag cagaatgccc 1560

acaagacccc tggttgcagt tggattgaaa ttgacaacca agttcatcaa ttctattctg 1620

ttgataaaac acatcctaga acggaggaga tatacaatac attggagagt ctgattagtc 1680

tgtactagct tagaggtgct ggggtttttc ccacaattat aaaaacggtt taaaaaataa 1740

aattttgagt ttacaggagt tcaaatttga ttcctaattc tcaaactaca tgtttcacat 1800

gcctacagca ctattctgct ttggagggta accctctcaa gtccttatgg aagtggttga 1860

tgaggggcca aggt 1874

<210> 2

<211> 529

<212> PRT

<213> VdANK1

<400> 2

Met Ala Pro Pro Gln Asn Gln Leu Asn Leu Asn Asn Ser Val Leu Ala

1 5 10 15

Leu Leu Glu Arg Cys Ile His Leu Asn His Leu Lys Gln Leu Gln Ala

20 25 30

Phe Leu Ile Thr Leu Gly His Ala Gln Thr His Phe Tyr Ala Phe Lys

35 40 45

Leu Leu Arg Phe Cys Thr Leu Ala Leu Ser Asn Leu Ser Tyr Ala Arg

50 55 60

Phe Ile Phe Asp His Val Glu Ser Pro Asn Val Tyr Leu Tyr Thr Ala

65 70 75 80

Met Ile Thr Ala Tyr Ala Ser His Ser Asp His Thr Ser Ala Leu Leu

85 90 95

Leu Tyr Arg Asn Met Val Arg Arg Arg Arg Pro Trp Pro Asn His Phe

100 105 110

Ile Tyr Pro His Val Leu Lys Ser Cys Thr Gln Val Val Gly Pro Gly

115 120 125

Ser Ala Arg Met Val His Cys Gln Val Leu Arg Ser Gly Phe Glu Gln

130 135 140

Tyr Pro Val Val Gln Thr Ala Leu Leu Asp Ala Tyr Leu Arg Phe Trp

145 150 155 160

Ser Asp Val Glu Ser Ala Arg Leu Leu Phe Asp Glu Met Thr Glu Arg

165 170 175

Asn Val Val Ser Trp Thr Ala Met Ile Ser Gly Tyr Thr Arg Leu Gly

180 185 190

Gln Ile Gly Asn Ala Val Leu Leu Phe Glu Glu Met Pro Glu Arg Asp

195 200 205

Val Pro Ser Trp Asn Ala Leu Ile Ala Gly Tyr Thr Gln Asn Gly Leu

210 215 220

Phe Met Glu Ala Leu Ser Leu Phe Arg Arg Met Ile Ala Val Glu Ala

225 230 235 240

Gly Ala Trp Gly Gln Gly Asn Arg Pro Asn Gln Val Thr Ala Val Cys

245 250 255

Ser Leu Ser Ala Cys Gly His Thr Gly Met Leu Arg Leu Gly Lys Trp

260 265 270

Ile His Gly Tyr Val Tyr Arg Asn Gly Leu Gly Leu Asp Ser Phe Val

275 280 285

Ser Asn Ala Leu Val Asp Met Tyr Gly Lys Cys Gly Cys Leu Lys Glu

290 295 300

Ala Arg Arg Val Phe Asp Arg Thr Leu Glu Arg Ser Leu Thr Ser Trp

305 310 315 320

Asn Ser Met Ile Asn Cys Leu Ala Leu His Gly Gln Ser Gln Asn Ala

325 330 335

Ile Ser Val Phe Glu Glu Met Met Thr Cys Gly Ser Gly Val Lys Pro

340 345 350

Asp Glu Val Thr Phe Ile Gly Leu Leu Asn Ala Cys Thr His Gly Gly

355 360 365

Leu Val Glu Lys Gly Trp Leu Tyr Phe Glu Leu Met Thr Gln Asn Tyr

370 375 380

Gly Ile Glu Pro Gln Ile Glu His Tyr Gly Cys Leu Val Asp Leu Leu

385 390 395 400

Gly Arg Ala Gly Gln Phe Glu Glu Ala Met Glu Val Val Arg Gly Met

405 410 415

Arg Ile Glu Pro Asp Glu Val Ile Trp Gly Ser Leu Leu Asn Gly Cys

420 425 430

Lys Ile His Gly His Thr Asp Leu Ala Glu Phe Ser Ile Lys Lys Leu

435 440 445

Ile Asp Met Asp Pro Asn Asn Gly Gly Tyr Gly Ile Met Leu Ala Asn

450 455 460

Ile Tyr Gly Glu Leu Gly Lys Trp Asp Glu Val Arg Lys Val Arg Lys

465 470 475 480

Val Leu Lys Glu Gln Asn Ala His Lys Thr Pro Gly Cys Ser Trp Ile

485 490 495

Glu Ile Asp Asn Gln Val His Gln Phe Tyr Ser Val Asp Lys Thr His

500 505 510

Pro Arg Thr Glu Glu Ile Tyr Asn Thr Leu Glu Ser Leu Ile Ser Leu

515 520 525

Tyr

Claims (8)

1.野葡萄锚定重复蛋白VdANK1的编码基因，其特征在于，VdANK1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示，长度1812bp，开放阅读框从第108~1442位碱基，它所编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该蛋白质的分子量为67.15，等电点为6.47，包含有两个Ankyrin repeat保守结构域。

2.根据权利要求1所述的野葡萄锚定重复蛋白VdANK1VdANK1的表达载体，其特征在于：表达载体含有如SEQ ID NO：1所示的野葡萄抗病相关锚定重复蛋白VdANK1的开放阅读框。

3.根据权利要求2所述的野葡萄锚定重复蛋白VdANK1的表达载体，其特征在于：所述表达载体为pCAMBIA2301- VdANK1，其制备步骤如下：

（1）以葡萄cDNA为模板，P1、P2为引物，PCR扩增得到VdANK1基因的开放阅读框，将扩增片段连接到pMD19-T克隆载体上，筛选得到阳性质粒pMD19-T-VdANK1；

正向引物P1：5’-GGGAGATCT-3’，

反向引物P2：5’-GGGGGTGACC-3’；

P1下划线处为酶切位点Bgl II，P2下划线处为酶切位点BstE II；

（2）用Bgl II、BstE II分别双酶切阳性质粒pMD19-T- VdANK1和植物表达载体pCAMBIA2301，回收目标片段与线性化载体，连接、转化后筛选、验证，即得。

4.根据权利要求3所述的野葡萄锚定重复蛋白VdANK1的表达载体，其特征在于：将植物超量表达载体pCAMBIA2301-VdANK1转化农杆菌。

5.根据权利要求3所述的野葡萄锚定重复蛋白VdANK1的表达载体，其特征在于：所述野葡萄抗病相关锚定重复蛋白VdANK1的分离克隆方法包括：

（1）采用SDS/酚法提取葡萄叶片总RNA；

（2）纯化总RNA；

（3）以RNA为模板反转录合成cDNA第一链；

（4）以cDNA为模板进行PCR扩增；

（5）检测与回收。

6.根据权利要求2或者3任一所述的野葡萄锚定重复蛋白VdANK1编码基因的应用，其特征在于：将植物超量表达载体pCAMBIA2301-VdANK1转化入植物，包括

（1）植物超量表达载体pCAMBIA2301-VdANK1转化入拟南芥；

（2）植物超量表达载体pCAMBIA2301-VdANK1转化入葡萄。

7.根据权利要求6任一所述的野葡萄锚定重复蛋白VdANK1编码基因的应用，其特征在于：所述植物超量表达载体pCAMBIA2301-VdANK1转化入拟南芥的步骤包括：

（1）将转化植物表达载体pCAMBIA2301-VdANK1的农杆菌接种至10mL LB液体培养基中进行培养；

（2）将菌液转移至离心瓶或离心管中进行离心处理后收集菌体，并重悬于渗透缓冲液中；

（3）将去除果荚的南芥花浸入渗透缓中，浸透结束后清理掉南芥花上多余的渗透缓冲液，将南芥花放入培养箱中继续培养。

8.根据权利要求6任一所述的野葡萄锚定重复蛋白VdANK1编码基因的应用，其特征在于：所述植物超量表达载体pCAMBIA2301-VdANK1转化入葡萄的步骤包括：

（1）将转化植物表达载体pCAMBIA2301-VdANK1的农杆菌接种至10mL LB液体培养基中进培养；

（2）将菌液转移至离心瓶或离心管中进行离心处理后收集菌体，加入相同体积的渗透缓冲液重悬；

（3）将葡萄叶片置于适量的重悬液中，置于水式真空循环泵中进行抽真空处理，将处理好的葡萄叶片取出并除去叶片表面的菌液，将葡萄叶片置于培养箱中培养。

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