CN108948162A

CN108948162A - 一种花生逆境胁迫基因AhDOG1L及其应用

Info

Publication number: CN108948162A
Application number: CN201810813142.8A
Authority: CN
Inventors: 陈娜; 程果; 王冕; 王通; 陈明娜; 潘丽娟; 迟晓元; 杨珍; 禹山林
Original assignee: Shandong Peanut Research Institute
Current assignee: Shandong Peanut Research Institute
Priority date: 2018-07-23
Filing date: 2018-07-23
Publication date: 2018-12-07
Anticipated expiration: 2038-07-23
Also published as: CN108948162B

Abstract

本发明公开了一种花生逆境胁迫基因AhDOG1L及其应用，属于植物基因工程领域。本发明花生逆境胁迫相关基因AhDOG1L序列如SEQ ID No.1所示；在低温，盐胁迫和干旱胁迫下，AhDOG1L基因的转录水平均有明显升高；其中在干旱胁迫的花生根中，该基因表达量最高上调了800多倍，这说明AhDOG1L基因在花生对非生物胁迫的适应性调控中具有重要功能。将该基因通过转基因手段导入拟南芥中，转基因植株比对照具有明显的耐冷、耐盐和抗旱特性，因此AhDOG1L基因能显著提高植物的抗逆性。

Description

一种花生逆境胁迫基因AhDOG1L及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种花生逆境胁迫基因AhDOG1L及其应用。

背景技术

花生富含油脂和蛋白，是我国重要的油料作物和经济作物。花生的产量和品质受干旱、盐碱等胁迫影响非常严重，全国每年因干旱引起的花生减产率达20％以上。但由于花生品种资源遗传基础狭窄，缺少高度抗旱、耐寒、耐盐的基因源，利用常规育种方法难以培育出高抗品种。随着分子生物学的快速发展，近年来利用转基因技术提高植物胁迫耐受能力的研究取得了显著成果，对胁迫相关基因和信号转导途径也有了更深入的了解。

DOG1转录因子是一类参与种子休眠调控的转录因子。近年来，该类转录因子被证明主要参与了种子休眠的诱导、种子成熟的调控和开花的调控。而DOG1在植物非生物胁迫方面的研究较少，初期研究认为其可能参与脱落酸信号传导途径，然而近年来的研究发现DOG1可能并不参与ABA的生物合成途径，而是与ABA信号通路平行调控种子休眠，其调控种子休眠可能是通过调控胚乳帽的弱化来实现的。

发明内容

本发明克隆了一种花生逆境胁迫相关基因AhDOG1L，并研究了其功能。该基因在花生高盐、干旱和低温胁迫下表达量增加，将其转化拟南芥能够提高其抗逆境胁迫能力。

花生AhDOG1L蛋白，具有：

1)如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或

2)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

编码AhDOG1L蛋白的基因，具有：

1)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或

2)SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或

3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

克隆AhDOG1L基因的引物对，序列为：

AhDOG1L-S：5’-ATGTCAGAGCTTCCATGTCCAA-3’；

AhDOG1L-A：5’-TCTTGAAGTTGACAAATCAT-3’。

含有上述基因的生物材料，所述生物材料为载体、宿主细胞或表达盒。

上述花生AhDOG1L蛋白或上述的基因或上述的生物材料提高生物抗逆境胁迫中的应用。

在上述方案的基础上，所述的胁迫为冷胁迫、盐胁迫或干旱胁迫。

提高生物耐冷、耐盐或抗旱特性的方法，将上述的基因序列或上述的生物材料，通过转基因手段导入生物体，并使其表达，来增强生物耐冷、耐盐或抗旱特性。

本发明技术方案的优点：

通过荧光定量PCR验证了AhDOG1L在低温，盐胁迫和干旱胁迫下的表达模式，结果表明该基因在三种非生物逆境胁迫下转录水平均有明显升高。AhDOG1L在花生根中的表达受高盐和干旱胁迫的明显诱导，表达量最高上调100倍以上。尤其在干旱胁迫的花生根中，该基因表达量最高上调了800多倍。此外在低温胁迫的花生根和叶片中，AhDOG1L的表达也有明显的上调。因此AhDOG1L基因在花生对非生物胁迫的适应性调控中具有重要功能。将该基因通过转基因手段导入拟南芥中，转基因植株比对照具有明显的耐冷、耐盐和抗旱特性，因此AhDOG1L基因能显著提高植物的抗逆性。

附图说明

图1不同胁迫条件下花生AhDOG1L基因的表达情况。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

基因的克隆

通过RT-PCR进行克隆，PCR扩增所用的聚合酶为LATaq^TM DNApolymerase(TaKaRa)，反应体系(25μL)为：2.5μL 10×PCRbuffer(含MgCl₂)；2.5μL 10mM dNTPs；1μL cDNA模板(此处cDNA模板为未经处理的花育33号花生叶片提取总RNA经反转录得到的)；0.5μLLApolymerase和17.5μL ddH₂O。

PCR反应条件为：

(a)94℃，5min；

b)94℃，45s；54℃，60s；72℃，90s；共35cycles；

(c)72℃，10min。

扩增基因全长所用引物为：

AhDOG1L-S:5’-ATGTCAGAGCTTCCATGTCCAA-3’(SEQ ID No.3)；

AhDOG1L-A:5’-TCTTGAAGTTGACAAATCAT-3’(SEQ ID No.4)。

PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳分离后用胶回收试剂盒(Omega)进行纯化，纯化产物连接pMD18-T Easy vector(Takara)并测序(Sangon,Shanghai)。

测序结果显示：

本发明的AhDOG1L基因开放阅读框为885bp，共编码295个氨基酸。

本发明的AhDOG1L基因的氨基酸序列在NCBI网站上通过Blast分析后发现该基因氨基酸序列上有DOG1保守结构域，同时该基因编码的氨基酸序列与花生野生种DOG1-like4同源性为97.64％。

本发明的AhDOG1L基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1。

本发明的AhDOG1L基因的氨基酸序列如SEQ ID No.2。

实施例2

AhDOG1L基因在花生低温、干旱和盐胁迫下的表达分析

1、材料的准备与处理

试验材料为花生花育33(Arachis hypogaea L.cultivar Huayu33)。花生种子在营养土和蛭石以2∶1混合的土中萌发，萌发后幼苗生长条件为16h光照/8h黑暗(28℃/22℃)。生长约2周处于三叶期的花生幼苗用于后续的非生物胁迫处理。

低温处理，将三叶期花生幼苗置于4℃光照培养箱中进行处理，分别于处理的0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h取花生叶片和根作为材料；

干旱胁迫，用PEG6000处理。将花生从土中取出并小心将根上的土用水冲洗干净，然后将花生根分别浸泡在重量浓度20％PEG6000溶液中，在处理时间为0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h分别取花生的叶片和根作为材料。

盐胁迫，将花生从土中取出并小心将根上的土用水冲洗干净，然后将花生根分别浸泡在200mM NaCl溶液中，在处理时间为0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h分别取花生的叶片和根作为材料。

所有材料均保存于-80℃超低温冰箱中备用。

2、RNA的提取和cDNA的合成

采用RNeasy Mini Kit(Qiagen)提取花生幼苗总RNA。采用RQ1RNase-free DNaseI将得到的RNA去除DNA污染后再进行cDNA的合成。用Takara的M-MLV反转录试剂盒进行cDNA的合成，25μL反应体系中包含2μg RNA。在42℃条件下经过60min的反转录反应后将反转录产物置于冰上放置5min，之后将反转录产物于-20℃低温冰箱中保存备用。

3、荧光定量PCR检测基因表达量

以上述胁迫处理后的花生苗的cDNA为模板，采用荧光定量Real-time RT-PCR对AhDOG1L基因进行表达分析。

荧光定量PCR所用cDNA模板稀释到8ngμL^-1，其中，聚合酶是SYBR Premix Ex Taqpolymerase(Takara)，仪器为LightCycler 2.0instrument system(Roche,Germany)，每反应体系加2μL稀释的cDNA。PCR反应程序如下：

(1)95℃，10s；

(2)95℃，5s，40cycles；

(3)60℃，30s；(4)72℃，10s。

PCR反应结束后绘制溶解曲线，温度增加梯度为每10秒增加0.5℃。actin11为实验的内参基因。

AhDOG1L荧光定量引物序列为：

QAhDOG1L-S：5’-GAATATGGCACCTCAGAGA-3’(SEQ ID No.5)；

QAhDOG1L-A：5’-TACTCATAATGCTTGACAACTC-3’(SEQ ID No.6)。

内参基因actin11引物序列为：

QACT11-S：5’-TTGGAATGGGTCAGAAGGATGC-3’(SEQ ID No.7)；

QACT11-A：5’-AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC-3’(SEQ ID No.8)。

通过荧光定量PCR验证了AhDOG1L在低温，盐胁迫和干旱胁迫下的表达模式，结果如图1所示：其中，该基因在三种非生物逆境胁迫下转录水平均有明显升高；AhDOG1L在花生根中的表达受高盐和干旱胁迫的明显诱导，表达量最高上调100倍以上(图1C，E)。尤其在干旱胁迫的花生根中，该基因表达量最高上调了800多倍(图1C)。此外在低温胁迫的花生根和叶片中，AhDOG1L的表达也有明显的上调(图1A，B)。以上结果说明AhDOG1L基因在花生对非生物胁迫的适应性调控中具有重要功能。

实施例3

植物表达载体的构建以及抗逆性检测

1、载体构建与遗传转化

将AhDOG1L构建到表达载体pCAMBIA1301上，酶切位点为KpnI和XbaI，通过测序确定所连基因序列正确后将构建好的载体转化农杆菌LBA4404中，通过农杆菌的介导将基因转入拟南芥中。拟南芥的遗传转化采用flower-dipper方法进行。用50mg/L潮霉素筛选转基因阳性植株。

载体构建所用引物如下：

AhDOG1L-S-KpnI：5’-GGTACCATGTCAGAGCTTCCATGTCCAA-3’(SEQ ID No.9)；

AhDOG1L-A-XbaI：5’-TCTAGATCTTGAAGTTGACAAATCAT-3’(SEQ ID No.10)。

2、转基因植株胁迫处理

低温处理：拟南芥种子在蛭石跟营养土1:2的混合土壤中萌发，之后在长日照条件下生长(16h light/8h dark)，生长温度为22℃。生长约20d后，将植株移到生化培养箱中，温度降至–6℃处理6h。处理后的材料随后转移到22℃的长日照条件下恢复生长并观察表型。所有处理均至少重复3次。

盐处理：将野生型拟南芥种子与AhDOG1L超表达转基因拟南芥的三个株系种子首先在4℃放置3d以打破休眠，之后一起播种到1/2MS培养基中，种子萌发3d后，将野生型拟南芥和转基因拟南芥植株幼苗分别转移到NaCl浓度分别为0、100、150和200mM的含盐1/2MS培养基中，在光照培养箱中培养5d后统计拟南芥根伸长情况，观察叶片颜色变化。所有处理均至少重复3次。

干旱处理：拟南芥种子在蛭石跟营养土1:2的混合土壤中萌发，之后在长日照条件下生长(16h light/8h dark)，生长温度为22℃。连续浇水约14d后，停止浇水2周。2周干旱处理后所有植株同时浇水，恢复生长7天后统计死亡率。

上述试验中均将野生型拟南芥种子作为对照组。

结果表明：

将AhDOG1L基因通过转基因手段导入拟南芥中，低温处理后转基因植株比对照组更快的恢复生长状态，盐胁迫对转基因植株的影响较小，干旱处理后的转基因植株存活率高于对照组；这说明转基因植株比对照组具有明显的耐冷、耐盐和抗旱特性。说明AhDOG1L基因能显著提高植物的抗逆性。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

<110> 山东省花生研究所

<120> 一种花生逆境胁迫基因AhDOG1L及其应用

<130> 2018

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 885

<212> DNA

<213> AhDOG1L(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 1

atgtcagagc ttccatgtcc aagctatgac atgtaccatt cacaaccctc tgaatatggc 60

acctcagaga gtggaagtgg aactgacagc tttcacaagt tctttgaggg atgggtggtt 120

gagcaaaacc aacacctgaa ggagctggtg gcatctgcaa caacagagct cacagatgag 180

aagcttcagg ctctgattga tggagttgtc aagcattatg agtactatta cgaggccaag 240

tcaaagtggg caaagcatga tgttctggcc atgctgtctc caacatggag aagctccttg 300

gaagatgctt ttctttggat tggtggttgg agaccaagca tggcttttca ccttctatat 360

tccaaggctg ggttgcaatt tgaggccaag ttggatgaac tccttcaggg tctaagaaca 420

tctgatttgg gtgatctatc agcaactcaa ctagctcaaa ttgatgagat tcagaagagg 480

acaatcgcag aggagaggga aatcacagat atgatggcaa cacatcaaga aacagtggca 540

gatgcatcaa tggtggaact ttctcatgct gtttctgaga tgttaagggc caatgaaact 600

gacaagggtg gaaagaaaga ggtagaggag agggttgatt cagctctgat gccaaaggag 660

gaaggattgg aggagatttt gcaaagagct gatggtttaa ggcttagaac acttcaaggt 720

attgtcaata ttctgaggcc aaaacagtgc attcacttct tgattgcagc tgcagaacta 780

cacctcaggc tgcatgagtg gggcaagaag agggatacaa gcagaaggct caatgaaggc 840

acttctagtg atgagggtac aacccatgat ttgtcaactt caaga 885

<210> 2

<211> 295

<212> PRT

<213> AhDOG1L(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 2

Met Ser Glu Leu Pro Cys Pro Ser Tyr Asp Met Tyr His Ser Gln Pro

1 5 10 15

Ser Glu Tyr Gly Thr Ser Glu Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Phe His

20 25 30

Lys Phe Phe Glu Gly Trp Val Val Glu Gln Asn Gln His Leu Lys Glu

35 40 45

Leu Val Ala Ser Ala Thr Thr Glu Leu Thr Asp Glu Lys Leu Gln Ala

50 55 60

Leu Ile Asp Gly Val Val Lys His Tyr Glu Tyr Tyr Tyr Glu Ala Lys

65 70 75 80

Ser Lys Trp Ala Lys His Asp Val Leu Ala Met Leu Ser Pro Thr Trp

85 90 95

Arg Ser Ser Leu Glu Asp Ala Phe Leu Trp Ile Gly Gly Trp Arg Pro

100 105 110

Ser Met Ala Phe His Leu Leu Tyr Ser Lys Ala Gly Leu Gln Phe Glu

115 120 125

Ala Lys Leu Asp Glu Leu Leu Gln Gly Leu Arg Thr Ser Asp Leu Gly

130 135 140

Asp Leu Ser Ala Thr Gln Leu Ala Gln Ile Asp Glu Ile Gln Lys Arg

145 150 155 160

Thr Ile Ala Glu Glu Arg Glu Ile Thr Asp Met Met Ala Thr His Gln

165 170 175

Glu Thr Val Ala Asp Ala Ser Met Val Glu Leu Ser His Ala Val Ser

180 185 190

Glu Met Leu Arg Ala Asn Glu Thr Asp Lys Gly Gly Lys Lys Glu Val

195 200 205

Glu Glu Arg Val Asp Ser Ala Leu Met Pro Lys Glu Glu Gly Leu Glu

210 215 220

Glu Ile Leu Gln Arg Ala Asp Gly Leu Arg Leu Arg Thr Leu Gln Gly

225 230 235 240

Ile Val Asn Ile Leu Arg Pro Lys Gln Cys Ile His Phe Leu Ile Ala

245 250 255

Ala Ala Glu Leu His Leu Arg Leu His Glu Trp Gly Lys Lys Arg Asp

260 265 270

Thr Ser Arg Arg Leu Asn Glu Gly Thr Ser Ser Asp Glu Gly Thr Thr

275 280 285

His Asp Leu Ser Thr Ser Arg

290 295

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 3

atgtcagagc ttccatgtcc aa 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 4

tcttgaagtt gacaaatcat 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 5

gaatatggca cctcagaga 19

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 6

tactcataat gcttgacaac tc 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 7

ttggaatggg tcagaaggat gc 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 8

agtggtgcct cagtaagaag c 21

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 9

ggtaccatgt cagagcttcc atgtccaa 28

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Arachis hypogaea Linn.)

<400> 10

tctagatctt gaagttgaca aatcat 26

Claims

1.花生AhDOG1L蛋白，其特征在于：具有：

1)如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或

2.编码权利要求1所述蛋白的基因，其特征在于：具有：

1)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或

3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

3.克隆权利要求2所述基因的引物对，其特征在于：序列为：

AhDOG1L-S：5’-ATGTCAGAGCTTCCATGTCCAA-3’；

AhDOG1L-A：5’-TCTTGAAGTTGACAAATCAT-3’。

4.含有权利要求2所述基因的生物材料，所述生物材料为载体、宿主细胞或表达盒。

5.权利要求1所述的花生AhDOG1L蛋白或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的生物材料在提高生物抗逆境胁迫中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的胁迫为冷胁迫、盐胁迫或干旱胁迫。

7.提高生物耐冷、耐盐或抗旱特性的方法，其特征在于：将权利要求2所述的基因序列或权利要求3所述的生物材料，通过转基因手段导入生物体，并使其表达，来增强生物耐冷、耐盐或抗旱特性。