CN109112144A

CN109112144A - 茶树类甜蛋白基因CsTHA1在增强作物抗逆性中的应用

Info

Publication number: CN109112144A
Application number: CN201810988465.0A
Authority: CN
Inventors: 李先文; 林阳阳; 耿志娟; 衡双平; 杜芳
Original assignee: Xinyang Normal University
Current assignee: Xinyang Normal University
Priority date: 2018-08-28
Filing date: 2018-08-28
Publication date: 2019-01-01
Anticipated expiration: 2038-08-28
Also published as: CN109112144B

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及茶树类甜蛋白基因CsTHA1在增强作物抗逆性中的应用。本发明提供了一种茶树类甜蛋白基因CsTHA1在提高烟草抗逆能力中的应用，所述茶树类甜蛋白基因CsTHA1的核苷酸序列全长915 bp，所述抗逆能力为抗盐胁迫能力、抗寒能力或抗旱能力。本发明还提供了一种茶树类甜蛋白CsTHA1在抑制茶树内生真菌中的应用。

Description

茶树类甜蛋白基因CsTHA1在增强作物抗逆性中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及茶树类甜蛋白基因CsTHA1在增强作物抗逆性中的应用。

背景技术

植物的类甜蛋白（TLPs）家族是一类防御性蛋白，在植物体遭受逆境时，其基因会迅速上调表达，增强植物体的抗逆性。研究表明，TLPs在巨桉（Eucalyptusgrandis pathogenesis）、胡桃（Malus hupehensis (Pamp.)Rehd）、杨树（Populus trichocarpa）和小麦等植物中具有抗虫、抗真菌、抗冻或抗盐等生物学功能，尽管该家族的基因在多种植物中已有研究报道，但在茶树中，目前仅有一篇有关类甜蛋白基因（CsTLP，DQ444296）的文章，不过DQ444296与本发明克隆的CsTHA1编码蛋白的氨基酸序列相似度仅为64%，还少20 氨基酸残基。

发明内容

本发明提供了茶树类甜蛋白基因CsTHA1在增强作物抗逆性中的应用。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种茶树类甜蛋白基因CsTHA1在提高烟草抗逆能力中的应用，所述茶树类甜蛋白基因CsTHA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1 所示，全长915 bp。

所述抗逆能力为抗盐胁迫能力、抗寒能力或抗旱能力。

所述茶树类甜蛋白基因CsTHA1编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示。

生物信息学分析显示，A. CsTHA1基因编码的蛋白含246个氨基酸残基，相对分子质量为26,193.3 kDa，理论等电点为4.54。不稳定系数为34.94，属于稳定性较高的亲水性蛋白。B. 在CsTHA1蛋白N端有一22个氨基酸组成的信号肽，其25～226位氨基酸为一个TLPs家族的保守结构域，其中有16个保守的半胱氨酸残基。C. CsTHA1蛋白二级结构预测结果显示：随机卷曲（Random coil）结构是该蛋白的主要组成部分，α-螺旋（Alpha helix）占12.60%，伸展链（Extended strand）占 25.61%，β-折叠（Beta turn）占10.98%。根据同源建模的方法预测CsTHA1蛋白的三级结构，结果显示CsTHA1蛋白与香蕉Ban-TLP（Musaacuminata）相似度极高，主要由α-螺旋和β-折叠构成。

定位分析显示茶树CsTHA1基因的编码蛋白存在于细胞外，属于一种细胞外蛋白。

所述的应用具体操作如下：

步骤1：构建植物表达载体pBI121-CsTHA1；

步骤2：使用农杆菌介导上述植物表达载体将CsTHA1基因转化到烟草中；

步骤3：筛选培养阳性植株，并移植入土壤中生长。

利用转基因T₀烟草植株进行抗盐性分析，利用转基因T₁烟草幼苗进行抗冻性分析，利用转基因T₁烟草植株进行抗旱性分析。

结果显示，于不同浓度盐溶液中处理时，过量表达CsTHA1基因有助于减轻烟草叶盘的损伤和衰老，野生型烟草的叶绿素含量和电解质外渗率的降低幅度均大于转基因烟草。说明转CsTHA1基因烟草对高盐有更强的耐受性。

在低温和干旱胁迫时，转基因型烟草叶片中的可溶性总糖含量总是高于野生型烟草。说明CsTHA1基因在烟草中的高效表达，有助于烟草细胞内糖代谢途径中相关糖分合成与积累。转CsTHA1基因烟草的可溶性总糖和脯氨酸含量高于野生型烟草，表明在烟草中过表达CsTHA1基因能够提高转基因年烟草的抗逆性。

本发明还提供了一种茶树类甜蛋白CsTHA1在抑制茶树内生真菌中的应用，所述茶树类甜蛋白CsTHA1的氨基酸序列如SEQ IDNO:2 所示。茶树类甜蛋白CsTHA1通过原核表达途径制备，具体操作如下：

（1）构建CsTHA1基因原核表达载体pET-30a-CsTHA1；

（2）诱导表达重组质粒pET-30a-CsTHA1；

（3）纯化CsTHA1蛋白；

（4）CsTHA1蛋白对茶树内生真菌的生长抑制分析。

与现有技术相比较，本发明的有益效果在于：

1、现有的研究多是运用TLPs蛋白作用于一些作物的害虫或致病真菌，揭示出该类蛋白有有抗虫、抗真菌的作用。未见该类蛋白对植物内生真菌的作用。本发明提供一种茶树类甜蛋白基因CsTHA1在提高烟草抗逆能力中的应用，所述抗逆能力为抗盐胁迫能力、抗寒能力或抗旱能力。本发明还提供一种茶树类甜蛋白CsTHA1在抑制茶树内生真菌中的应用，所述茶树类甜蛋白CsTHA1通过原核表达途径制备。

2、茶树类甜蛋白基因CsTHA1在提高烟草抗盐胁迫能力中的应用，具体表现在：转基因烟草在盐胁迫下，细胞膜破损程度较野生烟草低。茶树类甜蛋白基因CsTHA1在提高烟草抗寒能力中的应用，具体表现在：低温处理下，野生型幼苗的存活率仅为26.7%，而转基因烟草幼苗的存活率为72.12%（Line2）和68.10%（Line6）。茶树类甜蛋白基因CsTHA1在提高烟草抗旱能力中的应用，具体表现在：在自然干旱胁迫下，转基因株系和野生型株系相比，可溶性糖和脯氨酸含量增加幅度更为明显。另外，茶树类甜蛋白CsTHA1在抑制茶树内生真菌中的应用，具体表现在：在生长有茶树的内生真菌的培养基中加入CsTHA1蛋白干粉液（培养基中CsTHA蛋白终浓度分别为0.16 ug/mL或0.41μg/mL），茶树内生菌的菌丝生长明显受到抑制。

附图说明

图1为CsTHA1基因全长序列PCR检测； M：DL2000 DNA Marker；1：CsTHA1 PCR产物。

图2为pBI121- CsTHA1重组载体构建图。

图3为转基因烟草图。A为植株再生培养，B为转基因烟草植株。

图4为转CsTHA1基因烟草的DNA检测图；WT为野生型烟草；Line1～6为转基因烟草。

图5为转CsTHA1基因烟草中目的基因的表达量分析图；A，转CsTHA1烟草的半定量PCR；B，转CsTHA1烟草的QRT-PCR（p < 0.05，n=4）。

图6为转CsTHA1基因烟草抗盐性试验结果；A，不同植株烟草叶盘于不同浓度的NaCl溶液中培养；B，提取的叶绿素；C，叶绿素含量；D，电导率 (*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；n=4)。

图7为转CsTHA1基因T₁烟草低温试验结果；A，T₁和野生型幼苗于-4℃处理；B，低温下幼苗存活率（**p<0.01，n=100）；C，T₁和野生烟草植株低温处理；D，可溶性糖含量；E，脯氨酸含量（p<0.05，n=50）。

图8为转CsTHA1基因T₁烟草干旱试验结果；A，T₁和野生型幼苗于干旱处理；B，可溶性糖含量；C，脯氨酸含量（p<0.05，n=50）。

图9为CsTHA1蛋白电泳图；1、BSA(1 µg)；2、BSA(2 µg)；3、6、7 为未诱导全蛋白、未诱导上清、未诱导沉淀； 4、8、9为15℃ 诱导16 h全蛋白、上清、沉淀；5、10、11为37℃ 诱导4h全蛋白、上清、沉淀。

图10为不同诱导条件下CsTHA1蛋白可溶性分析结果；1、2 为15 ℃ 诱导16 h上清、沉淀； 3、4为37 ℃ 诱导4 h上清、沉淀；5、6也为37 ℃ 诱导4 h上清、沉淀。

图11为纯化的CsTHA1蛋白；1、诱导后；2、纯化蛋白。

图12为茶树内生真菌培养图。

图13为CsTHA1蛋白对茶树一种内生真菌的生长抑制作用（28℃下培养5天的照片）；每个培养皿中有20mL 的LB培养基。左下，未加任何物质。左上加了500 μL无菌双蒸水。右上，加了500 μL的浓度为 6.4 μg/mL 透析去盐的CsTHA蛋白干粉液，右下加了500 μL的浓度为16.4 μg/mL透析去盐的CsTHA蛋白干粉液。图中培养皿上的20mg/mL和50mg/mL指的是未进行透析去盐时CsTHA蛋白干粉液的浓度。

具体实施方式

以下实施例是为了更好的说明本发明的技术方案，而不是以此来限制本发明的保护范围。

实施例1 CsTHA1基因的克隆

以茶树创伤应答反应转录组（登录号：SRX1223890）组装序列comp49642_c0为模板设计基因CsTHA1读码框（ORF）的特异性引物对为：CsTHA1-left：5’-GCTCTAGACACCAGCATGGCTATTTAGCA-3’（如SEQ ID NO.3所示）和CsTHA1-right：5’-CGAGCTCCAGGTTCATACACGCCTTTATTTCACA-3’ （如SEQ ID NO.4所示）。利用该引物对进行基因CsTHA1的PCR扩增，得到约900 bp长的条带，如图1所示。

然后通过凝胶回收该片段并连接到测序载体上，进行测序验证。结果证明与原登录的序列的读码框是一致的。

实施例2 pBI121- CsTHA1表达载体的构建及转化

（1）根据CsTHA1基因设计带有XbaI和SacI双酶切位点的引物：CsTHA1-3（5’-GCTCTAGACACCAGCATGGGCTATTTAGCA-3’，如SEQ ID NO.5所示）和CsTHA1-4（5’-CGAGCTCCAGGTTCATACACGCCTTTATTTCACA-3’，如SEQ ID NO.6所示）。用此引物对扩增出CsTHA1基因的ORF序列；

（2）将扩增产物和pBI121质粒分别用XbaI/SacI双酶消化；

（3）将带有目的基因的酶切产物和酶切后的pBI121进行连接；

（4）将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中，培养，挑菌，检测，测序；

（5）将重组质粒pBI121-CsTHA1加入农杆菌GV3010感受态细胞中，轻轻混匀；

（6）将混合液移至电转杯中，进行电击，然后立即加入800 µL的LB中，28℃，220 rpm培养1 h；

（7）12,000 rpm离心1 min，弃上清，将剩余的菌液混匀，涂布在LB（含Kan和Rif）平板上，28℃培养2 d。获得含有pBI121- CsTHA1表达载体（见图2）的农杆菌菌液。

实施例3 转CsTHA1基因烟草的培育

（1）将烟草（Nicotiana tabacum）种子消毒灭菌后置于1/2 MS固体培养基中，于25～26℃，14 h光照/10 h黑暗条件下萌发；

（2） 14天后，将萌发出的烟草幼苗转移至含有相同1/2 MS培养基的组织培养盒中，同样条件下继续培养4～6周；

（3）叶盘法转化：将获得含有pBI121- CsTHA1表达载体的农杆菌菌液转化到烟草叶片中；

（4）培养基上筛选培养阳性植株，挑选能长出根的烟草幼苗植入土壤生长。通过农杆菌介导的烟草叶盘转化法，获得了6株转茶树CsTHA1基因烟草植株（图3）；

（5）转基因T₀烟草植株的DNA提取及PCR检测：将野生型烟草DNA及转基因烟草DNA分别做模板，用特异性引物对CsTHA1-left 和CsTHA1-raight进行PCR扩增，电泳检测扩增产物。结果显示，上述6株烟草全部为转入目的基因（CsTHA1）的烟草植株，当以野生型烟草DNA或水为模板做对照时，均未扩出目的条带（图4）；

（6）提取上述6株转基因烟草植株的RNA，对CsTHA1基因在烟草中的表达量进行分析。结果如图5所示，半定量PCR的结果和QRT-PCR的结果相吻合。Line2和Line6这两株目的基因表达量接近且相对处于中等水平。

实施例4转基因T₀烟草高盐处理

选取转入茶树CsTHA1基因T₀烟草植株的Line2和Line6烟草植株以及野生型烟草植株作为对象。取这三种植株的生长状况相似的烟草叶片做高盐试验。具体操作如下：

（1）将叶片用打孔器打出大小一致的叶盘；

（2）将打好的叶盘分别置于0 mM，400 mM，1 M这三个不同浓度的NaCl溶液中培养，培养条件25℃，光周期16 h光照，8 h黑暗；

（3）在培养前和培养5 d这两个时间点进行叶绿素的提取及测定，电导率的测定。

结果如图6所示。培养前，不同株系的烟草叶盘区别不大。5 d后， NaCl溶液中的野生型烟草叶盘变黄，并且随着浓度的增加，白化的面积越大。转基因烟草叶盘在0.4 M 浓度的NaCl溶液中才出现了轻微的叶盘边缘发白现象，随着盐浓度的增加，部分叶盘边缘白化加深（图6-A）。这一结果可以表明转茶树CsTHA1基因的烟草具有一定的抗盐性。

在H₂O中，即空白对照组，这三株烟草叶片的叶绿素含量并没有太大的差异；而在NaCl盐溶液中，所有试验株系的烟草叶盘中叶绿素的含量都有所下降，但野生型烟草下降的幅度更大（图6-B和6-C）。

如图6-D所示，未处理的野生型和转基因型电导率差异不大，在0.4 M NaCl溶液中，野生型，Line2和Line6的电导率分别为38.46%，12.87%和11.75%；在1 M NaCl时，电导率分别为50.97%，22.87%和21.87%。这一结果说明，转基因烟草在盐胁迫下，细胞膜破损程度较野生烟草低。

通过叶绿素含量以及电导率两个参数的测定结果，说明转茶树CsTHA1基因烟草的抗盐能力确实得到了提高。

实施例5 转基因T₁烟草幼苗的低温处理

选取经过筛选的生长期为30 d的的长势相似的Line2和Line6的T₁代烟草幼苗和野生型烟草幼苗各100棵进行低温处理，即在-4℃培养箱中放置6 h后，发现大部分野生烟草幼苗出现了叶片结冻现象，而转基因只有小部分出现了上述现象，在25℃恢复生长7 d后，野生型几乎没有得到恢复，而转基因型大部分得到了恢复（图7-A）。通过对低温处理6 h之后恢复生长7 d时的烟草幼苗存活率的统计（存活率（%）=恢复生长7 d后仍存活幼苗棵数/100×100%），发现野生型幼苗的存活率仅为26.7%，而转基因烟草幼苗的存活率分别为72.12%（Line2）和68.10%（Line6）（图 7-B）。

选取生长期为60 d的长势相似的Line2和Line6的T₁代烟草幼苗和野生型烟草幼苗放入-4℃培养箱中6 h。结果如图7-C所示，野生型烟草出现了大面积的冻伤，而转基因烟草也出现了部分面积的冻伤，恢复生长7 d后，野生型和转基因型烟草都有所恢复，但野生型恢复较慢。对烟草植株进行了处理前（0 h），处理3 h，处理6 h，恢复生长7 d这四个时间点的可溶性糖含量和脯氨酸含量测定。结果如图7-D和7-E所示，在处理3 h和6 h时，野生型与转基因型的两种物质含量的变化都呈上升趋势，但野生型上升的幅度明显小于转基因型；在恢复生长7 d时，不同株系烟草中这两种物质的含量都有所下降并且趋于正常水平，试验结果表明，在低温胁迫下，转茶树CsTHA1基因烟草的抗寒性强于野生型烟草。

实施例6 转基因T₁烟草的干旱处理

选取经过筛选的生长期为60 d的的长势相似的Line2和Line6的T₁代烟草幼苗和野生型烟草幼苗进行干旱处理，即在处理前5 d，将试验材料统一浸盆30 min，保证土壤水分一致，5 d后开始进行干旱试验（期间不再浇水）。结果如图8所示。干旱处理21 d时，试验烟草植株叶片都出现了不同程度的萎蔫脱水现象，甚至黄化，并且野生型烟草情况更为严重；复水恢复生长5 d后，所有株系的烟草叶片得到恢复，但野生型恢复较慢（图8-A）。

对处理前（0 d），处理8 d，处理21 d以及复水恢复生长5 d后这四个时间点的不同株系试验烟草植株叶片的可溶性糖含量和脯氨酸含量进行了测定。在自然干旱胁迫处理期间，烟草的可溶性糖含量变化都是先上升后下降，复水后又逐渐趋于正常水平，而且在整个试验期间，转基因型烟草的可溶性糖含量都是高于野生型烟草。在处理8 d时，三个试验株系较处理前的可溶性糖含量分别增加了1.32倍（WT），1.62倍（Line2）和1.53倍（Line6）；在处理21 d时，野生型烟草可溶性糖含量比转基因型烟草分别低32.47%（Line2）和29.81%（Line6）（图8-B）。而脯氨酸含量的变化趋势在处理期间一直呈上升趋势，在复水恢复生长后下降，但转基因烟草脯氨酸增加量明显高于野生型烟草。在处理8 d时，野生型烟草脯氨酸含量增加了2.85倍，而转基因烟草分别增加了4.14倍（Line2）和3.35倍（Line6）；在处理21 d时，野生型增加了5.18倍，转基因分别增加了8.57倍（Line2）和6.63倍（Line6）（图8-C）。这些结果表明，在自然干旱胁迫下，转基因株系和野生型株系相比，可溶性糖和脯氨酸含量增加幅度更为明显，表现了较强的耐旱能力。

实施例7 茶树CsTHA1蛋白的原核表达及纯化

试验材料：大肠杆菌BL21（DE3）为本实验室保存，pET-30a-CsTHA1重组质粒由江苏南京金斯瑞生物科技有限公司构建完成，蛋白抗体购于金斯瑞公司。

一、CsTHA1基因原核表达载体的构建及转化

为了目的蛋白在大肠杆菌细胞中更高效的表达，依据大肠杆菌密码子偏爱性，在不改变氨基酸的情况下对茶树CsTHA1基因的核苷酸序列进行了修饰以及剪掉了一段由22个氨基酸残基组成的N端信号肽。pET-30a-CsTHA1重组质粒由金斯瑞公司构建完成，所用的标签为His标签。将重组质粒转入DH5α中，进行挑菌，测序，对检测正确菌株的提质粒。

将测序正确的pET-30a-CsTHA1重组质粒用热激法转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，进行下一步CsTHA1蛋白的诱导与纯化。

二、重组质粒pET-30a-CsTHA1的诱导表达

1. CsTHA1蛋白的诱导表达：

（1）取1 mL含有重组质粒的菌液于20 mL LB（含Kan）培养基中（50 mL离心管）扩大培养，37℃，220 rpm摇过夜（约10 h），至OD₆₀₀约0.6到0.8；

（2）将扩大培养的菌液离心（3,000 g，离心10min），弃掉上清，加20 mL的新鲜LB（含Kan）培养基，将菌液重悬，37℃ 220 rpm摇30 min；

（3）从步骤（2）所得的培养菌液中取1 mL作为未诱导全蛋白对照，剩余菌液分成两组。一组10 mL菌液诱导条件为诱导温度15℃，诱导时间16 h。另一组10 mL菌液诱导条件为诱导温度37℃，诱导时间4 h；

（4）往两组菌液中各加入80 µL的IPTG，使IPTG的终浓度为0.8 mmol/L，充分混匀，按照各组的诱导条件放入摇床中培养。

2、诱导蛋白的分析：

（1）培养后，分别取1mL上述步骤（4）所得菌液，在12000 r/min离心 2min，收获沉淀。用100 μL 1%SDS凝胶加样缓冲液后剧烈震荡悬浮，98℃ 10min，冷却后，12000r/min离心5min，取上清作为全蛋白样品，用于SDS-PAGE分析。

（2）细胞裂解物的制备：

①取出上一步中剩余菌液用3,000 g，4℃离心10 min，弃去上清；

②用1 mL预冷的1×PBS 重悬浮，3,000 g，4℃离心10 min，弃去上清；

③用1 mL预冷的1×PBS 重悬浮，移至2 mL的离心管中，在冰上进行短脉冲超声波破碎（工作1 s，停10 s，作用2 min）可见上层溶液澄清；

④在4℃12,000 g下离心10 min，将上清转移到一个新的1.5ml离心管中。沉淀用1mL预冷的1×PBS 重悬浮。上清中加PMSF（两者均按1:100 v/v）；

⑤将上清和沉淀各取25 μL加等量的2×SDS，（其余上清和沉淀-80℃保存）98℃ 煮沸10 min，冷却后，12,000 r/min离心5 min，取25 μL作为样品，进行SDS-PAGE分析。

如图9所示，未诱导全蛋白泳道中未出现目的蛋白；在15℃16 h和37℃4 h条件下，加入IPTG诱导剂后，泳道中都出现了符合预期大小的蛋白诱导带，说明CsTHA1融合蛋白在大肠杆菌BL21中成功诱导表达；同时，诱导条件为15℃16 h时，诱导蛋白的量多于37℃4 h，在上清中可以看到微弱的融合蛋白诱导带，该蛋白的存在形式主要以包涵体形式为主。

依据宿文辉等所述方法进行Western blot分析。具体地，收集已经超声破碎的未诱导上清和沉淀、15℃诱导16 h的上清和沉淀、37℃诱导4 h的上清和沉淀，分别加入上样缓冲液，煮沸变性。将样品蛋白经100 g/L SDS-PAGE分离并电转印到硝酸纤维素薄膜上，滴加100 g/L脱脂奶粉封闭1 h，依次滴加1:5,000抗His6抗体(4℃孵育过夜)及1:2,000 HRP标记的山羊抗小鼠IgG后，用增强型化学发光法(ECL) ，在暗室X光片下曝光5～8 min，检测目的蛋白对应的特异性条带。

如图10所示，在两种诱导条件下的上清和沉淀中都出现了与预期相符的特异性诱导带。同时，融合蛋白是以包涵体和可溶两种形式共同表达，且15℃诱导16 h时，上清中的蛋白较37℃诱导4 h的多。该结果与上一步SDS PAGE电泳分析结果一致。

三、CsTHA1蛋白纯化

CsTHA1蛋白的纯化方法为Ni柱纯化His-tag蛋白质，具体步骤如下：

1、样品准备：

准备细胞，接种，诱导表达。用优化后的诱导条件：诱导温度15℃，时间16 h，IPTG终浓度为0.8 mmol/L培养150 mL菌液后，收集细胞，置于-70℃或立即进行下列操作；

加入1/20细胞生长体积的NTA-0 Buffer（20mM Tris-HCl pH 7.9，0.5 M NaCl，10% Glycerol）和PMSF。PMSF用无水乙醇配制成200 mM储存液，-20℃或4℃保存；PMSF使用的工作浓度位1 mM；该步骤冰上操作；

将细胞悬浮起来，加入溶菌酶，混匀，冰上放置30 min，超声或匀浆破碎细胞。该步骤冰上操作；

加入10% Triton X-100, 使Triton的终浓度为0.05%，充分混匀，冰上放置15min，间或混匀）；冰上超声破碎细胞，同时降低粘稠度；

加入1 M MgCl₂，使MgCl₂的终浓度为1 mM，混匀。加入DNase, 使DNase的终浓度为10 mg/ml，混匀，室温放置10 min；

5,000 r/min（20,000 g以上），4℃离心15 min以上。取上清，置于冰上备用或-20℃保存。

2、层析：

将NTA树脂装入合适的层析柱，层析用10倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗；

将制备好的样品加到NTA层析柱中，流速控制在15 mL/h左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况；

层析用5倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗，流速控制在30 mL/h左右；

分别用5倍NTA体积的NTA-20，NTA-40，NTA-60，NTA-80，NTA-100，NTA-200，NTA-1000 Buffer洗脱，流速控制在15 mL/h左右，收集洗脱液，每管收集一个NTA体积；

确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。最为有效的方式是SDS/PAGE分析；

纯化的目的蛋白于-20℃中保存。目的蛋白的序列如SEQ ID NO.7所示。

蛋白纯化结果如图11所示，纯化后的泳道上只有在分子量为23 kDa处有一条显色带，正好与诱导后菌液诱导带对应，表明成功获得CsTHA1蛋白。

实施例8 CsTHA1蛋白对茶树内生真菌的抑制作用

（1）用实施例7的方法原核表达CsTHA1基因，表达产物(带His-tag标签)经Ni柱纯化，用含有6M尿素的PBS (pH7.4)洗脱下来后，再冷冻干燥得到的干粉。在使用前用无菌双蒸水溶解成50 mg/mL和20mg/mL的CsTHA1蛋白干粉液，并经过滤除菌。

（2）将茶树叶片和茎段经无菌处理后，培养在MS+3％蔗糖的琼脂固体培养基上，经约一周即可培养出茶树的内生真菌。如图12所示。

（3）对50 mg/mL和20mg/mL的CsTHA1蛋白干粉液进行透析去盐处理。透析去盐后，50 mg/mL 和20mg/mLCsTHA1蛋白干粉液的浓度分别变为16.4 μg/mL和6.4 μg/mL。制备LB培养基，分成四份，每份20mL，接种步骤1所得内生真菌，第一份中加500 μL无菌双蒸水，第二份中加500 μL的浓度为 6.4 μg/mL 透析去盐的CsTHA1蛋白干粉液（CsTHA1蛋白在培养基中的终浓度为0.16 μg/mL），第三份中加500 μL透析去盐的浓度为 16.4 μg/mL的CsTHA1蛋白干粉液（CsTHA1蛋白在培养基中的终浓度为0.41 μg/mL），第四份未加任何物质。

（4）28℃下培养5天。

在加有CsTHA1蛋白干粉液的培养皿中，茶树的内生真菌菌丝有生长，在加入低浓度CsTHA1蛋白干粉液（6.4 μg/mL）的培养基中菌丝生长较加水的培养基上要快一些，但比在纯LB培养基上慢；在加入高浓度CsTHA1蛋白干粉液（16.4 μg/mL）的培养基中菌丝生长明显受到抑制，如图13所示。

SEQUENCE LISTING

<110> 信阳师范学院

<120> 茶树类甜蛋白基因CsTHA1在增强作物抗逆性中的应用

<130> 无

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 915

<212> DNA

<213> Camellia sinensis

<400> 1

aagcagtggt aacgcagagt acatggggaa actcaaaaca catcatcata acttgatatt 60

atttatcatt tcaccagcat gggctattta gcaaatgccc ttcctttcct tctcctctcg 120

agcctcttca tctccactga tgcagctgtc ttcacaatca gcaacaactg cccctacacg 180

gtctgggcag ctgccacacc aggtggcggt gtccaacttg accgcggcca agcatggacc 240

ataaacgtgg ctcctggcac ggccatggcc cgcatttggg gtaggaccaa ttgcaacttc 300

gatggaagcg gtagaggtag atgcgaaacc ggtgactgtg gtggtgtcct ccaatgcacc 360

ggttggggag tcccacccaa caccctagcc gaatatgccc taaatcaatt taataacctg 420

gatttctttg acatctctct agttgatgga tttaatattc ccattcagtt tagccccacc 480

aggaacccta ttgataaatg ccatccgatt tcatgcacag ccgacattaa cgggcaatgc 540

ccggatgtgt tgagggcccc aggcggatgt aataatcctt gcacggtttt tcagacaccc 600

gaatattgtt gcaccagtgg gccgtgttcg ccaaccaatt actcaatgtt tttcaagaaa 660

aactgtccag acgcatatag ctatcctcaa gatgatgcct caagcacatt tacttgcccc 720

ggtgggacta ctgactataa tgttgtgttt tgcccaatag gttctccaca tttccctttg 780

ccaatcaatg gaagtagtaa taatgtagag tctgcttaag ttttatttaa actatgtgaa 840

ataaaggcgt gtatgaacct gtaatttaat aataactcgt ttggttcaaa aaaaaaaaaa 900

aaaaaaaaaa aaaaa 915

<210> 2

<211> 246

<212> PRT

<213> Camellia sinensis

<400> 2

Met Gly Tyr Leu Ala Asn Ala Leu Pro Phe Leu Leu Leu Ser Ser Leu

1 5 10 15

Phe Ile Ser Thr Asp Ala Ala Val Phe Thr Ile Ser Asn Asn Cys Pro

20 25 30

Tyr Thr Val Trp Ala Ala Ala Thr Pro Gly Gly Gly Val Gln Leu Asp

35 40 45

Arg Gly Gln Ala Trp Thr Ile Asn Val Ala Pro Gly Thr Ala Met Ala

50 55 60

Arg Ile Trp Gly Arg Thr Asn Cys Asn Phe Asp Gly Ser Gly Arg Gly

65 70 75 80

Arg Cys Glu Thr Gly Asp Cys Gly Gly Val Leu Gln Cys Thr Gly Trp

85 90 95

Gly Val Pro Pro Asn Thr Leu Ala Glu Tyr Ala Leu Asn Gln Phe Asn

100 105 110

Asn Leu Asp Phe Phe Asp Ile Ser Leu Val Asp Gly Phe Asn Ile Pro

115 120 125

Ile Gln Phe Ser Pro Thr Arg Asn Pro Ile Asp Lys Cys His Pro Ile

130 135 140

Ser Cys Thr Ala Asp Ile Asn Gly Gln Cys Pro Asp Val Leu Arg Ala

145 150 155 160

Pro Gly Gly Cys Asn Asn Pro Cys Thr Val Phe Gln Thr Pro Glu Tyr

165 170 175

Cys Cys Thr Ser Gly Pro Cys Ser Pro Thr Asn Tyr Ser Met Phe Phe

180 185 190

Lys Lys Asn Cys Pro Asp Ala Tyr Ser Tyr Pro Gln Asp Asp Ala Ser

195 200 205

Ser Thr Phe Thr Cys Pro Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Val Val Phe

210 215 220

Cys Pro Ile Gly Ser Pro His Phe Pro Leu Pro Ile Asn Gly Ser Ser

225 230 235 240

Asn Asn Val Glu Ser Ala

245

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctctagaca ccagcatggc tatttagca 29

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgagctccag gttcatacac gcctttattt caca 34

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctctagaca ccagcatggg ctatttagca 30

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgagctccag gttcatacac gcctttattt caca 34

<210> 7

<211> 231

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Ala Val Phe Thr Ile Ser Asn Asn Cys Pro Tyr Thr Val Trp Ala

1 5 10 15

Ala Ala Thr Pro Gly Gly Gly Val Gln Leu Asn Arg Gly Gln Ala Trp

20 25 30

Thr Ile Asn Val Ala Pro Gly Thr Ala Met Ala Arg Ile Trp Gly Arg

35 40 45

Thr Asn Cys Asn Phe Asp Gly Ser Gly Arg Gly Arg Cys Glu Thr Gly

50 55 60

Asp Cys Gly Gly Val Leu Gln Cys Thr Gly Trp Gly Val Pro Pro Asn

65 70 75 80

Thr Leu Ala Glu Tyr Ala Leu Asn Gln Phe Asn Asn Leu Asp Phe Phe

85 90 95

Asp Ile Ser Leu Val Asp Gly Phe Asn Ile Pro Ile Gln Phe Ser Pro

100 105 110

Thr Arg Asn Pro Ile Asp Lys Cys His Pro Ile Ser Cys Thr Ala Asp

115 120 125

Ile Asn Gly Gln Cys Pro Asp Val Leu Arg Ala Pro Gly Gly Cys Asn

130 135 140

Asn Pro Cys Thr Val Phe Gln Thr Pro Glu Tyr Cys Cys Thr Ser Gly

145 150 155 160

Pro Cys Ser Pro Thr Asn Tyr Ser Met Phe Phe Lys Lys Asn Cys Pro

165 170 175

Asp Ala Tyr Ser Tyr Pro Gln Asp Asp Ala Ser Ser Thr Phe Thr Cys

180 185 190

Pro Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Val Val Phe Cys Pro Ile Gly Ser

195 200 205

Pro His Phe Pro Leu Pro Ile Asn Gly Ser Ser Asn Asn Val Glu Ser

210 215 220

Ala His His His His His His

225 230

Claims

1.一种茶树类甜蛋白基因CsTHA1在提高烟草抗逆能力中的应用，其特征在于，所述茶树类甜蛋白基因CsTHA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1 所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗逆能力为抗盐胁迫能力、抗寒能力或抗旱能力。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述茶树类甜蛋白基因CsTHA1编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，具体操作如下：

步骤1：构建植物表达载体pBI121-CsTHA1；

步骤3：筛选培养阳性植株，并移植入土壤中生长。

5.一种茶树类甜蛋白CsTHA1在抑制茶树内生真菌中的应用，其特征在于，所述茶树类甜蛋白CsTHA1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示，茶树类甜蛋白CsTHA1通过原核表达途径制备。