CN111808181B

CN111808181B - 马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因的应用

Info

Publication number: CN111808181B
Application number: CN202010708958.1A
Authority: CN
Inventors: 巩檑; 聂峰杰; 陈虞超; 张海雯; 宋玉霞; 甘晓燕; 张丽; 刘璇; 杨文静; 张国辉
Original assignee: Agricultural Biotechnology Research Center Of Ningxia Academy Of Agriculture And Forestry Sciences (ningxia Key Laboratory Of Agricultural Biotechnology)
Current assignee: Agricultural Biotechnology Research Center Of Ningxia Academy Of Agriculture And Forestry Sciences (ningxia Key Laboratory Of Agricultural Biotechnology)
Priority date: 2020-07-22
Filing date: 2020-07-22
Publication date: 2021-02-26
Anticipated expiration: 2040-07-22
Also published as: CN112745377A; CN112724211A; CN112745377B; CN112724211B; CN111808181A

Abstract

本发明涉及马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因的应用，属于植物基因工程技术领域。本发明提供了马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因或蛋白或含所述基因的重组载体、表达盒或重组菌在提高植物产量、糖含量、光合速率、叶绿素含量、糖代谢相关基因表达等方面中的应用。本发明所述应用对提升农作物糖含量、产量以及筛选种质材料和定向育种等均具有重要的生产意义。

Description

马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因的应用。

背景技术

马铃薯(Solanum tuberosum L.)是全球第三大粮食作物，粮菜兼用，营养价值高、产业链长。中国是世界上马铃薯种植面积最大的国家，但单产与美国、荷兰、日本等国家有一定差距。块茎是马铃薯产量的唯一形式，块茎中的淀粉来源于叶片光合作用合成的单糖和蔗糖，从源器官经长距离运输至块茎中储存，或部分分解为单糖，为块茎发育等提供能源。

糖在植物中由源器官运输到库器官，主要由介导糖在韧皮部的长距离运输的糖转运蛋白完成。光合作用产生的糖大约80％都是通过叶片的微管系统运输到植物的其他部位，对作物产量的形成起关键作用。在拟南芥中至少有69个糖转运蛋白，它们属于8个亚家族，分别为：蔗糖转运蛋白(sucrose transporter，SUC/SUT)，己糖转运蛋白(hexosetransporter，STP/HXT)，多元醇转运蛋白(polyol transporter，PLT)，肌醇转运蛋白(myo-inositol transporter，ITR/MIT)，质体转运蛋白(plastidic glucose transporter，pGlcT)，单糖转运蛋白(putative monosaccharide sensing protein，AZT/MSSP)。已有的研究显示，StSUT1负责筛管中糖分的转运，介导糖从韧皮部向其他组织、器官的运输；在土豆中反义抑制SUT后，造成蔗糖上载受阻，使得叶片中的蔗糖含量大幅度上升。反义抑制植株的叶片边缘卷曲并黄化，块茎显著减小。

单糖转运蛋白是糖转运蛋白的重要组成，对单糖的转运、吸收、利用和积累均起作用。已有研究表明，马铃薯基因组中有54个糖转运蛋白，其中20个为单糖转运蛋白，但尚未见有关解析单糖转运蛋白尤其液泡膜定位的单糖转运蛋白功能方面的研究报道。鉴定马铃薯中的液泡膜单糖转运蛋白，深入剖析其功能，不仅有助于了解其对植物生长发育的作用，还可以分析对产量及农产品品质的影响，进而为育种提供参考。

发明内容

本发明的目的在于提供马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因的应用。本发明所述应用对提升农作物糖含量、产量以及筛选种质材料和定向育种等均具有重要的生产意义。

本发明提供了马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因或蛋白或含所述基因的重组载体、表达盒或重组菌在提高植物产量中的应用，所述马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的是，所述植物包括马铃薯和拟南芥。

优选的是，所述植物产量包括马铃薯植株单株鲜重和结薯重量；或包括拟南芥植株单株鲜重和角果重量。

本发明还提供了马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因或蛋白或含所述基因的重组载体、表达盒或重组菌在提高植物糖含量中的应用，所述马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的是，所述植物包括马铃薯和拟南芥。

优选的是，所述糖含量包括马铃薯叶片糖含量和块茎糖含量，或包括拟南芥的叶片糖含量。

本发明还提供了马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因或蛋白或含所述基因的重组载体、表达盒或重组菌在提高植物光合速率中的应用，所述马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的是，所述植物包括马铃薯。

本发明还提供了马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因或蛋白或含所述基因的重组载体、表达盒或重组菌在提高植物叶片叶绿素含量中的应用，所述马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的是，所述植物包括马铃薯。

本发明还提供了马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因或蛋白或含所述基因的重组载体、表达盒或重组菌在提高植物糖代谢相关基因表达量中的应用，所述马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的是，所述植物包括马铃薯和拟南芥。

优选的是，所述植物糖代谢相关基因包括马铃薯StAGPase、StGBSS和StSPS基因和拟南芥AtAGPase和AtGBSS基因。

本发明提供了马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因的应用。本发明首次分离克隆了马铃薯StTMT2基因，并首次在马铃薯中同源过表达了StTMT2基因以及在拟南芥中异源过表达了该基因。实验结果表明，与对照相比，阳性转基因马铃薯株系在T0和T1代均表现块茎增大，叶片和块茎糖类含量增加，叶片叶绿素含量及光合速率增加等优良性状；阳性转基因拟南芥叶片中的糖类含量增加提高。马铃薯中同源过表达StTMT2显著提高了StAGPase、StGBSS和StSPS基因相对表达量；AtAGPase和AtGBSS在3个阳性转基因拟南芥株系中的相对表达量极显著高于野生型受体。本发明所述应用对农作物产量提升、育种及生产应用具有重要的生产意义。

附图说明

图1为本发明提供的马铃薯StTMT2蛋白与其它植物TMT2蛋白系统进化树分析图；

图2为本发明提供的重组植物表达载体pCAMBIA1302-StTMT2双酶切鉴定图；

图3为本发明提供的阳性转基因马铃薯株系PCR检测结果图；

图4为本发明提供的盆栽90天后受体与T0代阳性转基因单株叶表型和单株结薯情况对比图；

图5为本发明提供的盆栽60天后受体与T1代阳性转基因植株地上部分长势情况对比图；

图6为本发明提供的盆栽90天后受体和阳性转基因株系叶片中的糖含量；

图7为本发明提供的盆栽90天后受体和阳性转基因株系块茎中的糖含量；

图8为本发明提供的盆栽90天后受体和转基因植株叶片的光合速率和叶绿素含量；

图9为本发明提供的阳性转基因拟南芥株系PCR检测结果图；

图10为本发明提供的移栽30天后野生型与阳性转基因拟南芥表型对比图；

图11为本发明提供的移栽30天后野生型和阳性转基因拟南芥株系叶片中糖含量测定图；

图12为本发明提供的StTMT2的亚细胞定位分析图；

图13为本发明提供的阳性转基因马铃薯中3个糖代谢相关基因的荧光定量PCR结果；

图14为本发明提供的阳性转基因拟南芥中2个糖代谢相关基因的荧光定量PCR结果。

具体实施方式

本发明提供了马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因或蛋白或含所述基因的重组载体、表达盒或重组菌在提高植物产量中的应用，所述马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述基因源自Genbank登录号为MT454112的序列，该序列为发明人自主克隆并上传至Genbank。本发明通过RT-PCR方法克隆得到了所述的马铃薯液泡膜单糖转运蛋白基因完整的编码区序列，被命名为StTMT2。本发明所述基因含有1个外显子，不含内含子，含有一个全长为2214bp的开放阅读框(OpenReading Frame，ORF)，该基因编码一个由737个氨基酸残基构成，分子量为79.14kD，理论等电点为4.91的蛋白。在本发明中，所述马铃薯液泡膜单糖转运蛋白的氨基酸序列如SEQ INNO.2所示。在本发明中，所述植物包括马铃薯和拟南芥。在本发明中，所述植物产量包括马铃薯植株单株鲜重和结薯重量；或包括拟南芥植株单株鲜重和角果重量。本发明优选通过在植物中过表达马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因实现植物产量的提升。本发明对所述过表达的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员公知的常规基因在植物中的过表达方法即可。如将马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因转入马铃薯或拟南芥中。具体的，本发明优选通过RT-PCR方法扩增马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因，将该基因的开放阅读框序列构建到植物表达载体pCAMBIA1302中，然后将该重组表达载体转化农杆菌，利用农杆菌介导法转化到植物中，提高马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因的表达。在本发明中，构建得到的植物表达载体优选为pCAMBIA1302-35S-StTMT2。

本发明还提供了马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因或蛋白或含所述基因的重组载体、表达盒或重组菌在提高植物糖含量中的应用，所述马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。在本发明中，所述植物包括马铃薯和拟南芥。在本发明中，所述糖含量包括马铃薯叶片和块茎中葡萄糖、果糖、蔗糖和总糖含量，或包括拟南芥的叶片葡萄糖、果糖、蔗糖和总糖含量。本发明优选通过在植物中过表达马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因实现植物糖含量的提升。本发明对所述过表达的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员公知的常规基因在植物中的过表达方法即可，具体操作方法优选同上。

本发明还提供了马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因或蛋白或含所述基因的重组载体、表达盒或重组菌在提高植物光合速率中的应用，所述马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。在本发明中，所述植物包括马铃薯。本发明优选通过在植物中过表达马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因实现植物光合速率的提升。本发明对所述过表达的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员公知的常规基因在植物中的过表达方法即可，具体操作方法优选同上。

本发明还提供了马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因或蛋白或含所述基因的重组载体、表达盒或重组菌在提高植物叶片叶绿素含量中的应用，所述马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。在本发明中，所述植物包括马铃薯。本发明优选通过在植物中过表达马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因实现植物叶绿素含量的提升。本发明对所述过表达的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员公知的常规基因在植物中的过表达方法即可，具体操作方法优选同上。

本发明还提供了马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因或蛋白或含所述基因的重组载体、表达盒或重组菌在提高植物糖代谢相关基因表达量中的应用，所述马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。在本发明中，所述植物包括马铃薯和拟南芥。在本发明中，所述植物糖代谢相关基因包括马铃薯StAGPase、StGBSS和StSPS基因和拟南芥AtAGPase和AtGBSS基因。本发明优选通过在植物中过表达马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因实现提升马铃薯StAGPase、StGBSS和StSPS基因和拟南芥AtAGPase和AtGBSS基因的表达量。。本发明对所述过表达的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员公知的常规基因在植物中的过表达方法即可，具体操作方法优选同上。

具体的，本发明用于克隆马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因的PCR引物的核苷酸序列优选分别如SEQ ID NO.3～6所示：

TMTF:5’-GACTTGTGTGCTACTAGTACTGG-3’(SEQ ID NO.3)

TMTR:5’-CGTAGTAAATCCGACAGAAGATACC-3’(SEQ ID NO.4)

TF:5’-GAAGATCTTCATGAATGGTGCTGTG-3’(SEQ ID NO.5)

TR:5’-GGACTAGTCCTCATGCTTCGCGATA-3’(SEQ ID NO.6)

其中下划线处为酶切位点，上游引物的酶切位点为BglII，下游引物的酶切位点为SpeI。

本发明克隆的基因被命名为StTMT2，可以通过农杆菌介导的遗传转化方法或其他转基因方法把基因转入植物中，通过筛选鉴定获得的转基因植株或株系。本发明通过在马铃薯体内过量表达该基因可以增加糖类含量、提高马铃薯产量及光合速率、叶绿素含量方面的应用和在拟南芥体内异源表达该基因可以增加糖类含量方面的应用均属于本发明保护的范围。

下面结合具体实施例对本发明所述的马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因克隆和表达载体构建

本发明利用RT-PCR技术从马铃薯栽培品种‘大西洋’叶片中克隆得到了马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因cDNA序列，构建了pCAMBIA1302-35S-StTMT2重组植物表达载体，用于遗传转化。

扩增方法为：首先使用Plant Total RNA Isolation试剂盒(购自诺唯赞公司公司)提取马铃薯叶片总RNA，其次使用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis试剂盒(购自诺唯赞公司)反转录为总cDNA(具体过程参见说明书)，再以此cDNA为模板分别用TMTF和TMTR(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)为引物进行PCR扩增，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测为单一条带后，用胶回收试剂盒(购自天根公司)回收目标条带，将回收得到的目的基因片段与克隆载体pCE2-TA/Blunt-Zero vector(购自诺唯赞公司)置于25℃反应5min进行连接，取5μL连接产物热激转化大肠杆菌Fast-T1感受态细胞，涂布于新配置的含有氨苄青霉素(Amp)的LB固体平板上，37℃培养过夜，次日挑选白斑若干，于含有Amp(50mg·L^-1)的液体LB培养基中，于37℃180r/min振荡培养过夜至浑浊，用TMTF和TMTR引物进行PCR检测，检测菌液是否为阳性，送三个筛选出的阳性克隆至金唯智生物科技公司进行测序。

生物信息学分析显示，该基因序列含有一个全长为2214bp的开放阅读框，含有1个外显子，不含内含子。该基因编码一个由737个氨基酸残基构成，分子量为79.14kD，理论等电点为4.91的蛋白，含有MFS超家族保守结构域，具有12个跨膜螺旋。该基因编码蛋白与其他植物的亲缘关系见图1(马铃薯StTMT2蛋白与其它植物TMT2蛋白系统进化树分析图)，分析发现同科植物间TMT2蛋白同源性较高，而不同种属之间的蛋白同源性较低，说明该蛋白在同科植物之间保守性较高。

根据已经克隆得到的StTMT2基因序列信息，设计带有酶切位点的ORF全长特异性扩增引物TF和TR(SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，划线部分为酶切位点BglII和SpeI)，以‘大西洋’cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测后切胶纯化回收目的片段，将回收产物与克隆载体pCE2-TA/Blunt-Zero vector进行连接，然后将连接产物通过热激法转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单菌落后摇菌，经菌液PCR筛选出阳性克隆，送至生工生物工程股份有限公司测序。将含pCAMBIA1302空载体和测序无误的含目的基因的阳性菌株分别接种于液体LB培养基中37℃振荡培养过夜，采用天根质粒小提试剂分别提取两种质粒DNA。使用限制性内切酶Bgl II和Spe I对目的基因质粒和pCAMBIA1302空载体质粒于37℃双酶切10min。酶切反应结束后，经琼脂糖凝胶电泳，分别切胶回收目的条带，将目的基因片段与pCAMBIA1302载体片段以7：1的比例混合，用T4-DNA连接酶16℃连接过夜，取5μL连接产物通过热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有卡那霉素(50mg·L^-1)抗性平皿上培养，挑取单菌落后摇菌，经菌液PCR筛选出阳性菌株，并进行扩大培养后提取质粒，进行双酶切和单克隆测序鉴定，最终获得StTMT2基因的植物表达载体。结果见图2(重组植物表达载体pCAMBIA1302-StTMT2双酶切鉴定图)，其中M为Marker，1为pCAMBIA1302-StTMT2，2为pCAMBIA1302-StTMT2双酶切结果，由图2可见符合酶切预期片段大小。

对获得的重组质粒利用热激转化法转化农杆菌GV3101，用含有卡那(Kan)50mg/L的LB固体抗性平皿筛选转化阳性菌落，挑取若干个阳性斑于含卡那(Kan)50mg·L^-1的LB液体培养基中28℃，180r/min培养过夜，取1μL做模板进行重组质粒的PCR检测，确认为阳性的菌株保存用于后续的遗传转化。

实施例2

马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因的遗传转化马铃薯

取已保存的阳性农杆菌菌液接种于50mL LB液体培养基(含50mg·L^-1 Kan)中，28℃摇床中，180rpm振荡培养24h，取出后离心弃上清，收集菌体，用MS液体培养基重悬菌体，测菌体OD值于0.6～0.8左右，用于侵染转化。在超净工作台内取出试管薯，切成约1～2mm的薄片放入无菌三角瓶中，倒入上述重悬农杆菌菌液，浸染12min(期间不断轻摇三角瓶)，倒掉菌液并用无菌滤纸吸除残留在薯片表面的菌液，将薯片转移至铺有2层滤纸的共培养培养基(MS 4.42g·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂4.5g·L^-1、NAA 0.05mg·L^-1)中，25℃环境下暗培养48h。在超净工作台中，用无菌镊子夹取暗培养48h后的薯片至无菌三角瓶内，用头孢溶液(500mg·L^-1)清洗薯片4次，每次8min(期间不断轻摇三角瓶)，以充分清洗。再经无菌水清洗4次，每次1min。取出薯片平铺在无菌滤纸上以吸除薯片表面残留的液体。将其移至筛选培养基(MS 4.42g·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂4.5g·L^-1、ZT 1.0mg·L^-1、6-BA 0.5mg·L^-1、IAA1.0mg·L^-1、GA 0.2mg·L^-1、Cef 500mg·L^-1、Kan 50mg·L^-1)中培养，温度为(24±2)℃、光照周期为光16h/暗8h、光照度为2000Lx，培养约10天后薯片开始变绿长出抗性芽，待其抗性芽生长至3～4cm时转入含有头孢(500mg·L^-1)的生根培养基中，获得马铃薯转化植株。提取受体植株和转化植株基因组DNA，设计跨载体引物，以DNA为模板，以菌液DNA为阳性对照，以未转化的马铃薯总DNA为阴性对照，进行PCR扩增，鉴定出阳性转基因株系。结果见图3(阳性转基因马铃薯株系PCR检测结果图)，其中M为Marker，1为受体，2为阳性质粒，3～5为3个阳性株系，由图3可见转基因阳性植株扩增出与重组质粒片段一样大小的条带(片段大小)，而未转化受体并未扩增出相应的特异性条带。

将筛选出的T0代阳性株系和对照株系(WT)在无菌培养瓶中继代培养，选取生长状况一致的阳性转基因苗和未转化受体苗，于控制条件下盆栽试验，在相同环境下生长约90天，于移栽生长90天后测定光合效率参数，并取样测定叶绿素含量、糖类含量，收取地上植株和每株所结块茎，迅速称取植株单株鲜重与单株结薯重量。结果发现，如表1所示转基因阳性株系OE-1、OE-2、OE-3表现出植株单株鲜重均显著高于未转化受体的植株单株鲜重，且3个阳性转基因株系单株结薯重量显著大于受体。其中，如图4(盆栽90天后受体与T0代阳性转基因单株叶表型和单株结薯情况对比图)和图5(盆栽60天后受体与T1代阳性转基因植株地上部分长势情况对比图)所示，对照(WT)和OE-1、OE-2、OE-3盆栽培养90天后对比图片，可知阳性转基因株系植株生长健壮，叶片生长更加充分，OE-1和OE-2的单株结薯数量多于受体植株；采用4种糖含量试剂盒(购于苏州科铭公司)测定盆栽90天后受体植株及3个阳性转基因植株叶片和块茎中的果糖、葡萄糖、蔗糖和总糖含量，如图6(盆栽90天后受体和阳性转基因株系叶片中的糖含量，其中，A为受体(WT)植株与3个阳性转基因株系(OE-1，OE-2和OE-3)叶片中果糖含量对比图，B为受体(WT)植株与3个阳性转基因株系(OE-1，OE-2和OE-3)叶片中葡萄糖含量对比图，C为受体(WT)植株与3个阳性转基因株系(OE-1，OE-2和OE-3)叶片中蔗糖含量对比图，D为受体(WT)植株与3个阳性转基因株系(OE-1，OE-2和OE-3)叶片中总糖含量对比图)和图7(盆栽90天后受体和阳性转基因株系块茎中的糖含量，其中，A为受体(WT)植株与3个阳性转基因株系(OE-1，OE-2和OE-3)叶片中果糖含量对比图，B为受体(WT)植株与3个阳性转基因株系(OE-1，OE-2和OE-3)叶片中葡萄糖含量对比图，C为受体(WT)植株与3个阳性转基因株系(OE-1，OE-2和OE-3)叶片中蔗糖含量对比图，D为受体(WT)植株与3个阳性转基因株系(OE-1，OE-2和OE-3)叶片中总糖含量对比图)所示，叶片中，3个阳性转基因株系(OE-1，OE-2，OE-3)的4种糖类含量较受体植株均有不同程度增加，统计学上存在显著(*P<0.05)或极显著(**P<0.01，***P<0.001)差异；块茎中，3个阳性转基因株系的4种糖类含量也显著(*P<0.05)或极显著(**P<0.01，***P<0.001)高于受体植株。利用GFS-3000光合仪和叶绿素含量试剂盒(购于苏州科铭公司)测定受体植株和转基因阳性植株叶片的光合速率和叶绿素含量。如图8(盆栽90天后受体和转基因植株叶片的光合速率和叶绿素含量，其中，A为受体(WT)植株与3个阳性转基因株系(OE-1，OE-2和OE-3)叶光合速率对比图，B为受体(WT)植株与3个阳性转基因株系(OE-1，OE-2和OE-3)叶片中叶绿素含量对比图)所示，3个阳性转基因株系植株的光合速率较受体植株均有增加，总叶绿素含量较受体植株均有增加。

对T1代阳性株系和对照株系(WT)于控制条件下盆栽试验，每盆填土量一致，常规浇水管理，每盆种1株，营养生长期(种植60天后)发现(图5，盆栽60天后受体与T1代阳性转基因植株地上部分长势情况对比图)，3个过表达株系OE-1，OE-2和OE-3的株高和地上部分长势均显著优于受体(WT)。在相同环境下生长90天，收取每株所结块茎，称取单株结薯重量。结果发现，如表2所示转基因阳性株系OE-1、OE-2、OE-3均表现出单株结薯重量显著大于受体。

表1盆栽受体与T0代阳性转基因株系单株植株鲜重和单株结薯重量(每个株系3个生物学重复，**P<0.01)

表2盆栽受体与T1代阳性转基因株系单株结薯重量(每个株系3个生物学重复，**P<0.01)

株系	单株结薯重量(g)
		WT	45.2
OE-1	107.4**
		OE-2	128.8**
OE-3	158.3**

实施例3

马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因的遗传转化拟南芥

拟南芥的种植：向离心管中装入适量拟南芥种子，在超净工作台内加入75％的酒精消毒2min，再加入1mL(10％NaCLO+0.01％Triton)消毒10min，用灭菌的蒸馏水清洗4次，每次1min。最后将种子均匀播种到MS固体培养基上，将平板置于4℃春化2～3天后，放置到人工培养箱中16h光照/8h黑暗，22℃条件下培养10天左右，待拟南芥长出四片真叶即可移栽。按6:3:1的比例混合营养土、蛭石和珍珠岩，高温灭菌后装至营养钵中，浇透营养液。选取生长健壮的小苗移栽到营养钵中，覆盖保鲜膜保湿培养2～3天，再正常光照培养。拟南芥生长至抽薹状态，剪掉已经结荚的角果，留下待开放的花蕾，进行农杆菌侵染实验。

取1mL农杆菌菌液，接种于50mL含有卡那霉素(50mg·L^-1)的LB液体培养基，28℃，180rpm过夜培养。取出菌液，3500rpm离心10min，弃上清，收集菌体。用转化渗透液重悬菌体，测菌体OD值于0.8～1左右，用于侵染转化。侵染前去掉已经形成的果荚，将拟南芥花序浸泡到侵染液中，侵染1min，侵染完成后将拟南芥覆膜，浇水保湿，黑暗培养24h，随后放在光照培养箱中正常培养。根据植株长势6～7天侵染一次，侵染2～3次后不再侵染，成熟后收种子。将收集的种子37℃烘干后，置于4℃春化3天左右，种子消毒后平铺在含50mg·L^-1潮霉素的MS平板上，4℃暗培养3天后，放置到人工培养箱在22℃，16h光照/8h黑暗光周期培养两周左右，以筛选出在抗生素平板上生长良好的转基因植株。将保存的重组植物表达载体pCAMBIA1302-35S-StTMT2质粒瞬时转化拟南芥原生质体并在激光共聚焦显微镜下进行亚细胞定位分析。

T1代种子播种于含有潮霉素的MS平板上，筛选抗性T2代小苗并移栽。提取转基因拟南芥和野生型拟南芥的总DNA，使用跨载体特异引物进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测发现(图9，阳性转基因拟南芥株系PCR检测结果图，其中，1号泳道代表重组植物表达载体pCAMBIA1302-35S-StTMT2阳性质粒电泳后条带大小，2-7号泳道代表拟南芥中转StTMT2基因株系目标条带大小；4-6为扩增并电泳检测到与阳性质粒分子量大小一致的条带)，图中5个转基因株系中有3个株系扩增出与阳性质粒片段一样大小的条带(图9中4-6号泳道代表的株系)，而非转基因对照植株并未扩增出相应的特异性条带。收取T2代种子，继续筛选T3代幼苗并移栽，在16h光照/8h黑暗的长日照环境下生长3周，进行拟南芥表型鉴定。结果发现(图10，野生型与阳性转基因拟南芥表型对比图)，与对照受体(图10中WT)相比，3个转基因拟南芥株系(图10中Line-1，Line-2和Line-3)出现幼苗生长健壮，叶片生长更加充分，并加强了莲座叶的生长。为了证实转基因后是否增加了糖的积累，分别测定了移栽3周后野生型及转基因拟南芥株系叶片中的果糖、葡萄糖、蔗糖和总糖含量。结果显示(图11，移栽3周后野生型和阳性转基因拟南芥株系叶片中糖含量测定图，其中，A为受体(WT)植株与3个阳性转基因株系(Line-1，Line-2和Line-3)叶片中果糖含量对比图，B为受体植株与3个阳性转基因株系(Line-1，Line-2和Line-3)叶片中葡萄糖含量对比图，C为受体植株与3个阳性转基因株系(Line-1，Line-2和Line-3)叶片中蔗糖含量对比图，D为受体植株与3个阳性转基因株系(Line-1，Line-2和Line-3)叶片中总糖含量对比图，3个阳性转基因株系中4种糖类的含量均显著(*P<0.05)或极显著(**P<0.01，***P<0.001)高于野生型。初步说明StTMT2的表达提高了糖分在叶片中的积累。

StTMT2的亚细胞定位分析显示(图12，StTMT2的亚细胞定位分析图，其中，A为空载体35S-GFP在激光共聚焦显微镜下的荧光信号，B为受体植株中叶绿体的荧光信号，C为明场下原生质体荧光信号，D为同视野下A，B，C图合并后的荧光信号；E为StTMT1-GFP融合蛋白的荧光信号，F为marker蛋白的荧光信号，G为明场下转基因植株叶原生质体荧光信号，H为为同视野下E，F，G图合并后的荧光信号)，在拟南芥叶肉细胞原生质体中，空载体对照(35S-GFP)中绿色荧光充满整个原生质体，在细胞膜、细胞质和细胞核等部位中均有表达，而35S-StTMT2-GFP融合蛋白仅在液泡膜上有表达，说明StTMT2可能主要在液泡膜上发挥生物学功能。

实施例4

转StTMT2马铃薯和拟南芥阳性株系中糖代谢相关基因表达量分析以实施例2中获得的3个T1代阳性转基因株系为研究对象，叶片为材料，采用试剂盒方法(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)提取组织总RNA，试剂盒方法反转录为cDNA(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)。以均一化后的cDNA为模板，以ef1α为内参基因(Qef1αF:5'CAAGGATGACCCAGCCAAG，SEQ ID NO.7；Qef1αR:5'TTCCTTACCTGAACGCCTGT，SEQ ID NO.8)，用StTMT2基因定量引物QStTMT2(QStTMT2F:5'AAGGACTTGTTGTTGCGATGT，SEQ ID NO.9；QStTMT2R:5'ATAGGGCGACGACCAATACT，SEQ ID NO.10)与3个糖代谢相关基因(AGPase，GBSS和SPS，引物序列依次是QStAGPase F:5'GCAAAGACGTGATGTTAAACCT，SEQ ID NO.11；QStAGPase R:5'TAAAAGCTAAAATCTGGCACCG，SEQ ID NO.12；QStGBSS F:5'CTTTCACTGCTATAAACGTGGG，SEQ ID NO.13；QStGBSS R:5'GACACAACAAGCTGAACCTAAG，SEQ IDNO.14；QStSPS F:5'GTTCCATTGGATTTATCCTGGC，SEQ ID NO.15；QStSPS R:5'CAAAGTCTTTCTCAACCCTTCG，SEQ ID NO.16)的定量引物进行荧光定量PCR，分析转基因株系中糖代谢通路相关基因的表达情况，荧光定量PCR在伯乐CFX96仪器上完成。

转基因马铃薯中的荧光定量PCR结果显示(图13，阳性转基因马铃薯中3个糖代谢相关基因的荧光定量PCR结果)，StAGPase基因在3个阳性转基因株系中的表达量都显著高于受体株系(图13中的A，**P<0.01)，其中，在OE-1中的表达量是受体的46倍，在OE-2中的表达量是受体的90.6倍，在OE-3中的表达量是受体的31.5倍。StGBSS基因在3个阳性转基因株系中的表达量都极显著高于受体株系(图13中的B，***P<0.001)，其中，在OE-1中的表达量是受体的119倍，在OE-2中的表达量是受体的179.8倍，在OE-3中的表达量是受体的66.6倍。StSPS基因在3个阳性转基因株系中的表达量极显著高于受体株系(图13中的C，***P<0.001)，其中，在OE-1中的表达量是受体的22.9倍，在OE-2中的表达量是受体的27倍，在OE-3中的表达量是受体的19倍。糖代谢相关基因的相对表达量结果初步表明，StTMT2基因的转入影响了相关糖代谢基因的表达变化，是提高叶片和块茎中糖分含量、单株块茎产量的一个重要原因。

以实施例3中获得的3个T2代阳性转基因拟南芥株系移栽30天后植株叶片为材料，采用试剂盒方法(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)提取组织总RNA，试剂盒方法反转录为cDNA(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)。以均一化后的cDNA为模板，以Actin2为内参基因(QActin2F:5’CTCCTTTGTTGCTGTTGACTAC，SEQ ID NO.17；QActin2R:5’GCACAATGTTACCGTACAGATC，SEQ ID NO.18)，荧光定量PCR方法计算2个糖代谢相关基因(AGPase，GBSS，引物序列依次是QAtAGPase F:5’CGTCATCTTTCACGAGCTTATG，SEQ ID NO.19；QAtAGPase R:5’GACATTATGCTCCTCGAACAAC，SEQ ID NO.20；QAtGBSS F:5’AAATTAACTGGATGAAGGCTGC，SEQ ID NO.21；QAtGBSS R:5’AGAGATGAGTTCTTGAGCGTAG，SEQ IDNO.22)的相对表达量，分析转基因株系中糖代谢通路相关基因的表达情况，荧光定量PCR在伯乐CFX96仪器上完成。结果显示(图14，阳性转基因拟南芥中2个糖代谢相关基因的荧光定量PCR结果)，AtAGPase和AtGBSS在3个阳性转基因拟南芥株系中的相对表达量极显著高于野生型受体(***P<0.001)。AtAGPase(图14中的A)在Line-1中的表达量是野生型受体的15.9倍，在Line-2中的表达量是野生型受体的7.7倍，在Line-3中的表达量是野生型受体的15.5倍。AtGBSS(图14中的B)在Line-1中的表达量是野生型受体的78.5倍，在Line-2中的表达量是野生型受体的53.5倍，在Line-3中的表达量是野生型受体的103.5倍。上述结果表明拟南芥中异源表达StTMT2影响了糖代谢相关基因的表达变化。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 宁夏农林科学院农业生物技术研究中心（宁夏农业生物技术重点实验室）

<120> 马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因的应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2214

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaatggtg ctgtgttagt tgcgcttgcc gcgacaattg gaaacttttt gcagggttgg 60

gataatgcta ctattgctgg agctgttgtt tacataaaga aggagcttgc tctggatgct 120

tcagtggaag gacttgttgt tgcgatgtca ctcattggag ccacacttgt cacaacttgt 180

tctggatcca tagctgacag tattggtcgt cgccctatgc ttattatgtc atccatgctt 240

tatttcctta gtggtttaat aatgttgtgg tcccctaatg tctatgtcct gcttatagct 300

agactattag atggatttgg aatcggctta gcggttactc tggtccccct atatatatct 360

gagactgctc catcagaaat acgagggtca ctgaatactc ttccacagtt cactggttct 420

ggtggaatgt tcttggccta ctgcatgatt ttcggaatgt ccttaatgac agcgccgagt 480

tggcgattga tgttgggtgt tctttcaatt ccttctctta tctatttcgt attagttgta 540

ctttatttgc ctgagtctcc tcgatggcta gtcagtaaag gaagaatggt tgaggcaaaa 600

caagttttgc agaaattgcg tggcatagag gatgtttcag gggagatggc attgcttgtt 660

gagggtttgg cagttggcat tgaaccatca atagaagagt atatcattgg tccagctaat 720

gagcttactg acgatcagga cctggctact gacaaagatc atatcaagtt gtacggccca 780

gaggaaggcc tctcgtgggt ggccaagcca gttactggac agagtagtct agctcttgtg 840

tccaggcagg ggagcatggt gcagcagagt gtgcctctta tggatcctct tgtgactcta 900

tttggtagtg tccatgagaa tctccctgat acaggaagta tgagaagcat gctattcccc 960

aatttcggaa gcatgatcag caccatggat cctcatgtca aagatgatca ctgggatgag 1020

gagagtctgc agagagaagg tgatgattat ccttcggatg tcggtgcaga ttctgatgac 1080

aatctacaaa gtccattgat atcacgtcaa acaaccgctg tggaaaccgt agttcctcat 1140

ccccatggca gcactctgag cgtgaggcgg catagcagcc ttatgcaagg caatgctgga 1200

gagggtgtag gcagcatggg cattggtggt ggttggcagt tggcatggaa atggtctgaa 1260

agggaaggtg aagatggaac taaagaagga ggcttcaaaa ggatatattt gcatcaggag 1320

gcaggccctg gctctcgacg tggatctctc gtttcagtcc ctggtggtga tattcctgaa 1380

gatggtgaat tcatacaagc tgcggctttg gtaagtcagc ctgcacttta ctcaaaggaa 1440

cttatggatc agcatcctgt gggaccagcg atggtccatc catctgaaac tgcttcaaaa 1500

ggtccgagtt gggctgctct tcttgaacct ggagtcaagc gagcgctcat tgttggaatt 1560

ggaattcaaa tattgcaaca gttttccggt ataaatggag tcatgtacta cactcctcaa 1620

atccttgagc aggcaggtgt aggagttctt ctttctaact ttggcatcgc atcagactca 1680

gcatccttcc tcatcagtgc gttaacaaac ttcctgatgc tcccttctgt agctattgca 1740

atgcgattca tggatgtggc tggcagaagg tcgctgctgc tgtacactat tcctgttctc 1800

atactatcac tcatctgtct tgtcattggt aacactgtca acctcgggag tgtggctcat 1860

gcagtcgttt ctactatttg cgtgatcctc tacttttgct tctttgtaac gggctatgga 1920

ccaatcccaa atatcctctg ctcagaaatt ttcccaacaa gggttcgtgg tttgtgcatc 1980

gccatctgtg ccctcgtctt ctggatatgt gatgtcattg tgacttacac actgcctgtg 2040

atgctcaact cgattggctt atctggagtt tttggtattt atgccattgt atgtgtcatt 2100

tcttggattt ttgtcttctt gagggttccc gaaaccaaag gcatgccctt agaagtcatt 2160

acagagttct tcgctgttgg tgcaagacaa gctgctatcg cgaagcatga gtag 2214

<210> 2

<211> 737

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Asn Gly Ala Val Leu Val Ala Leu Ala Ala Thr Ile Gly Asn Phe

1 5 10 15

Leu Gln Gly Trp Asp Asn Ala Thr Ile Ala Gly Ala Val Val Tyr Ile

20 25 30

Lys Lys Glu Leu Ala Leu Asp Ala Ser Val Glu Gly Leu Val Val Ala

35 40 45

Met Ser Leu Ile Gly Ala Thr Leu Val Thr Thr Cys Ser Gly Ser Ile

50 55 60

Ala Asp Ser Ile Gly Arg Arg Pro Met Leu Ile Met Ser Ser Met Leu

65 70 75 80

Tyr Phe Leu Ser Gly Leu Ile Met Leu Trp Ser Pro Asn Val Tyr Val

85 90 95

Leu Leu Ile Ala Arg Leu Leu Asp Gly Phe Gly Ile Gly Leu Ala Val

100 105 110

Thr Leu Val Pro Leu Tyr Ile Ser Glu Thr Ala Pro Ser Glu Ile Arg

115 120 125

Gly Ser Leu Asn Thr Leu Pro Gln Phe Thr Gly Ser Gly Gly Met Phe

130 135 140

Leu Ala Tyr Cys Met Ile Phe Gly Met Ser Leu Met Thr Ala Pro Ser

145 150 155 160

Trp Arg Leu Met Leu Gly Val Leu Ser Ile Pro Ser Leu Ile Tyr Phe

165 170 175

Val Leu Val Val Leu Tyr Leu Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Val Ser

180 185 190

Lys Gly Arg Met Val Glu Ala Lys Gln Val Leu Gln Lys Leu Arg Gly

195 200 205

Ile Glu Asp Val Ser Gly Glu Met Ala Leu Leu Val Glu Gly Leu Ala

210 215 220

Val Gly Ile Glu Pro Ser Ile Glu Glu Tyr Ile Ile Gly Pro Ala Asn

225 230 235 240

Glu Leu Thr Asp Asp Gln Asp Leu Ala Thr Asp Lys Asp His Ile Lys

245 250 255

Leu Tyr Gly Pro Glu Glu Gly Leu Ser Trp Val Ala Lys Pro Val Thr

260 265 270

Gly Gln Ser Ser Leu Ala Leu Val Ser Arg Gln Gly Ser Met Val Gln

275 280 285

Gln Ser Val Pro Leu Met Asp Pro Leu Val Thr Leu Phe Gly Ser Val

290 295 300

His Glu Asn Leu Pro Asp Thr Gly Ser Met Arg Ser Met Leu Phe Pro

305 310 315 320

Asn Phe Gly Ser Met Ile Ser Thr Met Asp Pro His Val Lys Asp Asp

325 330 335

His Trp Asp Glu Glu Ser Leu Gln Arg Glu Gly Asp Asp Tyr Pro Ser

340 345 350

Asp Val Gly Ala Asp Ser Asp Asp Asn Leu Gln Ser Pro Leu Ile Ser

355 360 365

Arg Gln Thr Thr Ala Val Glu Thr Val Val Pro His Pro His Gly Ser

370 375 380

Thr Leu Ser Val Arg Arg His Ser Ser Leu Met Gln Gly Asn Ala Gly

385 390 395 400

Glu Gly Val Gly Ser Met Gly Ile Gly Gly Gly Trp Gln Leu Ala Trp

405 410 415

Lys Trp Ser Glu Arg Glu Gly Glu Asp Gly Thr Lys Glu Gly Gly Phe

420 425 430

Lys Arg Ile Tyr Leu His Gln Glu Ala Gly Pro Gly Ser Arg Arg Gly

435 440 445

Ser Leu Val Ser Val Pro Gly Gly Asp Ile Pro Glu Asp Gly Glu Phe

450 455 460

Ile Gln Ala Ala Ala Leu Val Ser Gln Pro Ala Leu Tyr Ser Lys Glu

465 470 475 480

Leu Met Asp Gln His Pro Val Gly Pro Ala Met Val His Pro Ser Glu

485 490 495

Thr Ala Ser Lys Gly Pro Ser Trp Ala Ala Leu Leu Glu Pro Gly Val

500 505 510

Lys Arg Ala Leu Ile Val Gly Ile Gly Ile Gln Ile Leu Gln Gln Phe

515 520 525

Ser Gly Ile Asn Gly Val Met Tyr Tyr Thr Pro Gln Ile Leu Glu Gln

530 535 540

Ala Gly Val Gly Val Leu Leu Ser Asn Phe Gly Ile Ala Ser Asp Ser

545 550 555 560

Ala Ser Phe Leu Ile Ser Ala Leu Thr Asn Phe Leu Met Leu Pro Ser

565 570 575

Val Ala Ile Ala Met Arg Phe Met Asp Val Ala Gly Arg Arg Ser Leu

580 585 590

Leu Leu Tyr Thr Ile Pro Val Leu Ile Leu Ser Leu Ile Cys Leu Val

595 600 605

Ile Gly Asn Thr Val Asn Leu Gly Ser Val Ala His Ala Val Val Ser

610 615 620

Thr Ile Cys Val Ile Leu Tyr Phe Cys Phe Phe Val Thr Gly Tyr Gly

625 630 635 640

Pro Ile Pro Asn Ile Leu Cys Ser Glu Ile Phe Pro Thr Arg Val Arg

645 650 655

Gly Leu Cys Ile Ala Ile Cys Ala Leu Val Phe Trp Ile Cys Asp Val

660 665 670

Ile Val Thr Tyr Thr Leu Pro Val Met Leu Asn Ser Ile Gly Leu Ser

675 680 685

Gly Val Phe Gly Ile Tyr Ala Ile Val Cys Val Ile Ser Trp Ile Phe

690 695 700

Val Phe Leu Arg Val Pro Glu Thr Lys Gly Met Pro Leu Glu Val Ile

705 710 715 720

Thr Glu Phe Phe Ala Val Gly Ala Arg Gln Ala Ala Ile Ala Lys His

725 730 735

Glu

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacttgtgtg ctactagtac tgg 23

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgtagtaaat ccgacagaag atacc 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaagatcttc atgaatggtg ctgtg 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggactagtcc tcatgcttcg cgata 25

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caaggatgac ccagccaag 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttccttacct gaacgcctgt 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaggacttgt tgttgcgatg t 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atagggcgac gaccaatact 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcaaagacgt gatgttaaac ct 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

taaaagctaa aatctggcac cg 22

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctttcactgc tataaacgtg gg 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gacacaacaa gctgaaccta ag 22

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gttccattgg atttatcctg gc 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

caaagtcttt ctcaaccctt cg 22

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctcctttgtt gctgttgact ac 22

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gcacaatgtt accgtacaga tc 22

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cgtcatcttt cacgagctta tg 22

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gacattatgc tcctcgaaca ac 22

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

aaattaactg gatgaaggct gc 22

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

agagatgagt tcttgagcgt ag 22

Claims

1.马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因或蛋白或含所述基因的重组载体、表达盒或重组菌在提高植物产量中的应用，所述马铃薯液泡膜单糖转运蛋白StTMT2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述植物为马铃薯和拟南芥；所述植物产量为马铃薯植株单株鲜重和结薯重量；或所述植物产量为拟南芥植株单株鲜重和角果重量。