CN105189759A - 调节植物种子和蜜腺内含物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及增加植物的发育种子中的至少一种糖的水平的方法，其中这些方法包括在植物细胞中插入编码至少一种糖转运体蛋白(SWEET蛋白)的外源核酸以产生转基因植物细胞，并且使该转基因植物细胞经受促进在种子发育过程中表达该至少一种SWEET蛋白的条件。这些方法导致转基因植物种子、以及产生种子的转基因植物，其中如与来自在相同条件下生长的相同物种的非转基因植物的种子相比，至少一种糖的水平是增加的。

Description

调节植物种子和蜜腺内含物的方法

关于联邦资助的研究或研发的声明

研发本发明期间进行的部分工作利用了在能源部项目编号DE-FG02-04ER15542和美国国家科学基金会项目编号0820730下的美国政府基金。美国政府对本发明有某些权利。

序列表信息

一种计算机可读文本文件，题为“056100-5093-WO-SequenceListing(序列表).txt，”在2014年3月12日当天或当天左右创建，其中约923kb的文件大小包含用于本申请的序列表并且借此将其通过引用以其全文结合。

发明背景

发明领域

本发明涉及增加植物的发育种子中的至少一种糖的水平的方法，其中这些方法包括在植物细胞中插入编码至少一种糖转运体蛋白(SWEET蛋白)的外源核酸以产生转基因植物细胞，并且使该转基因植物细胞经受促进在种子发育过程中表达该至少一种SWEET蛋白的条件。这些方法导致转基因植物种子、以及产生种子的转基因植物，其中如与来自在相同条件下生长的相同物种的非转基因植物的种子相比，至少一种糖的水平是增加的。

发明背景

通过植物拦截光、将光束缚为化学能、并且最终在收获器官中制造贮存产物的效率来确定产量潜力。糖类是这些转换中的主导通货，然而，从蔗糖到达终端韧皮部末端(进入发育的种子中)以及随后导致种子填充的转移和转化步骤的路径，是属于能量转化链中最少了解的部分。

在大多数植物中，蔗糖是从来源易位至库组织的碳水化合物的主要形式。蔗糖是主要在叶细胞中经由一对酶(蔗糖磷酸合酶和蔗糖磷酸磷酸酶)合成的，并且然后是通过SWEET家族的蔗糖转运体输出到质外体(apoplasm)中，并且随后在SUT家族的蔗糖/H⁺共转运体的帮助下，输入脉管系统中。假定在韧皮部中对蔗糖易位的驱动力是由蔗糖进入脉管的主动输入产生并由此产生渗透梯度和压力驱动流，并且SWEET供给SUT。碳分配的至少了解的领域之一是韧皮部卸载，并且确切地是糖类从母体韧皮部向发育的胚和胚乳转移。在豆类中，假定韧皮部卸载后是经由胞间连丝共质体地发生的，随后蔗糖从种皮经由难以捉摸的流出转运机构从种皮流出。在SUT家族的蔗糖/H⁺共转运体的帮助下，发育的豆类胚摄取蔗糖。在豌豆的发育的胚中的SUT1过表达导致增加的蔗糖流入，表明在大型种子双子叶植物中，通过增加进入胚的主动流入，是存在增加产量的潜力的。通过经由转化酶和蔗糖合酶蔗糖至己糖和活化己糖的酶法转化，连同通过合成淀粉和其他储存化合物来消耗这些产物，进一步驱动在胚中碳水化合物的的积累。

在基底胚乳转移层(BETL)中的蔗糖-代谢酶(例如细胞壁转化酶(Mn1))以及在胚乳中的蔗糖合酶(SuSy)还在碳转移中起到关键作用。这一两步降解是表示在转化为淀粉之前，胚乳中的蔗糖的重新合成。然而迄今为止，并且尽管在决定产量中它具有关键作用，在玉蜀黍籽粒中糖转移和代谢的路径仍有些不清楚。关于在这一重要器官中，驱动糖类的积累的膜转运体，所知甚少。

在细胞的、亚细胞的、组织的、和整个生物体的水平上，代谢和转运是密切关联的。虽然在植物系统中代谢和转运网络的大多数建模已经集中在细胞水平，对于哺乳动物系统，很好地建立了在组织水平上的整合转运和代谢生产、消耗和储存的模型。脑、心脏以及肝模型已经成功整合多种转运的代谢物，这些代谢物经历了通过细胞内和细胞间的若干组织隔室中的若干个通路的关联的代谢步骤的代谢。建立的理论框架、连同现代计算硬件和软件工具，允许捕获底物和产物的组织水平转运和转化的关键特征的模型的数值解和测试。

若干公开的植物研究已经至不同程度整合了转运、代谢和/或储存。空间的和发展的生长素转运和信号转导的详细建模已经很好地阐明了分生组织生长的激素调节。在甘蔗中蔗糖转运、代谢和储存的公开模型导致控制点的鉴定，并且通过转基因操作，鉴定并且经实验证实了用于增加至蔗糖的流的靶标。

发明概述

本发明涉及增加植物的发育种子中的至少一种糖的水平的方法，其中这些方法包括在植物细胞中插入编码至少一种糖转运体蛋白(SWEET蛋白)的外源核酸以产生转基因植物细胞，并且使该转基因植物细胞经受促进在种子发育过程中表达该至少一种SWEET蛋白的条件。这些方法导致转基因植物种子、以及产生种子的转基因植物，其中如与来自在相同条件下生长的相同物种的非转基因植物的种子相比，至少一种糖的水平是增加的。

附图简要说明

图1描绘了SWEET9，即蔗糖转运体，对于花蜜分泌而言是必需的。a-b，在非洲爪蟾卵母细胞中进行：AtSWEET9、和BrSWEET9的蔗糖摄取(a)以及流出(b)活性。截短的AtSWEET9_F201*(AtSWEET9m)和BrSWEET9_L201*(BrSWEET9m)用作阴性对照。a，卵母细胞摄取测定：SWEET9和SWEET9介导¹⁴C蔗糖摄取(±SEM，n≥14)，*t显著(P<0.05)，**t显著(P<0.01)。b，卵母细胞流出测定：在非洲爪蟾卵母细胞中，用¹⁴C蔗糖注射，通过SWEET9和SWEET9的¹⁴C蔗糖流出(±SEM，n≥8)。c，依附至萼片内部的花蜜滴(野生型)。d-e，在sweet9-1和sweet9-2突变体的蜜腺中，花蜜的缺失。f，从包含额外拷贝的SWEET9-eGFP的花的蜜腺中分泌的增加的花蜜。g-h，在它的天然启动子下，从补足的atsweet9突变体的蜜腺分泌的花蜜：SWEET9(g)或SWEET9-eGFP(h)。

图2描绘了在sweet9突变体中，SWEET9和淀粉积累的细胞的和亚细胞的定位。a-d，在表达SWEET9的翻译GUS融合体的拟南芥花中的组织化学GUS分析(天然启动子)。示出SWEET9的组织特异性定位的拟南芥花的侧向(a)和中间蜜腺(b)、c-d横切面(c)以及纵断面(d)中的GUS染色。用番红-O染色细胞壁(橙色)。e，proSWEET9的eGFP荧光的共聚焦图像：SWEET9-eGFP融合体，示出在质膜和高尔基体处的亚细胞定位。f-g，在天亮后4小时用路戈尔碘溶液(Lugol’siodinesolution)染色的野生型(f)和sweet9-1突变体(g)的花：sweet9-1的花柄中的淀粉。h-i，野生型和sweet9-1的蜜腺的特写镜头。淀粉仅在野生型蜜腺的保卫细胞中以及在sweet9-1中的蜜腺薄壁组织中积累(在黑暗结束时采样)。j-k，用路戈尔碘溶液染色，在野生型和sweet9-1突变体中拟南芥蜜腺的LR白树脂切片。在sweet9-1突变体的蜜腺中(k)和在野生型蜜腺的气孔中(j，*)淀粉粒(暗红色)积累。在开花时，在野生型和sweet9突变体株系中，在花柄和蜜腺中的淀粉粒。用番红-O染色细胞壁(橙色)。

图3描绘了对于拟南芥的花蜜分泌而言，蔗糖磷酸合酶1(SPS1)和SPS2是必需的。a-b，SPS1和SPS2基因表达的人工微RNA抑制导致蜜腺分泌的丧失。箭头指示由野生型花分泌的花蜜。c-d，与野生型相比，SPS1和SPS2基因表达的微RNA抑制改变了蜜腺中的淀粉积累。淀粉在sps1f/2f突变体株系的花柄中积累(红色箭头)，并且仅在野生型蜜腺的保卫细胞中积累。e，针对蜜腺分泌机制提出的模型：在蜜腺中，通过SPS合成淀粉衍生的蔗糖，并且通过SWEET9输出淀粉衍生的蔗糖。随后，通过CWINV4水解输出的蔗糖，这产生了高渗透势以维持水流沿着渗透梯度向下。

图4描绘了对于花蜜分泌而言，芜菁中的SWEET9(BrSWEET9)和野生烟草(N.attenuata)中的SWEET9(NaSWEET9)是至关重要的。a，在野生型芜菁花的侧向蜜腺中的花蜜滴。b和c，在brsweet9-1和brsweet9-2突变体中花蜜的缺失。d，在野生烟草中NaSWEET9转录物积累。e，在野生型的、nasweet9-1的和nasweet9-2的植物中，在5am测量的花的平均花蜜体积(±SEM)。f和g，在卵母细胞中，NaSWEET9的蔗糖摄取(f)以及流出(g)活性。将NaSWEET9_L201*(NaSWEET9m)的截短形式用作对照。f，卵母细胞摄取：NaSWEET9介导¹⁴C蔗糖摄取(±SEM，n≥14)，**t显著(P<0.01)。g，在卵母细胞中，通过NaSWEET9的¹⁴C蔗糖流出(±SEM，n≥8)。h，数据收集自可获得的基因组数据库(phytozome.org，genomevolution.org，bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/)，使用SWEET9蛋白质序列作为诱铒，同时使用genomevolution.org作为参照产生树，并且然后相应地用戴维斯(Davies)等人(美国科学院院刊(ProcNatlAcadSciUSA.)2004年2月17日，101(7):1904-9)中示出的结果进行了确认。树分支是示意性表示并且它们不是由任何真实自展值(bootstrapvalue)限定。属于蔷薇类或菊类的核心真双子叶植物分支的物种分别加了橙色和黄色的下划线。

图5描绘了在拟南芥中，SWEET的种皮表达和突变体表型。(A)SWEET11-GFP。(B)在8DAF，在野生型胚中的淀粉。(C)sweet11、12、15的三突变体(8DAF)示出了迟缓的发育和降低的淀粉含量。

图6描绘了在烟草中，SWEET4a、SWEET4b、SWEET4d和SWEET11的GFP融合体定位在质膜。在农杆菌浸润的本氏烟叶子中的瞬时表达证明了在质膜处WEET4a、SWEET4b、SWEET4d和SWEET11(GFPC-末端融合体)的强定位。在农杆菌浸润3天后，使用共聚焦激光扫描显微术将荧光信号可视化。

图7描绘了(A)SWEET4a和SWEET4b(来自王蜀黍)作为己糖转运体的功能，以及(B)SWEET11(来自王蜀黍)作为蔗糖转运体的功能。通过在HEK293T细胞中与胞质FRET葡萄糖或蔗糖传感器(分别是FLIPglu600μD13V和FLIPsuc90mΔ1V)共表达，鉴定葡萄糖或蔗糖转运活性。通过CFP和维纳斯发射(Venusemission)的定量比率成像(采集间隔10s)，对单独的细胞进行分析。用培养基灌流共转染的HEK293T细胞，随后用2mM-5mM-20mM葡萄糖的脉冲或10mM蔗糖进行灌流。将仅用传感器转染的HEK293T细胞(“对照”)作为对照。SWEET4d是葡萄糖转运体，例如SWEET4a和4b。

图8描绘了在玉米中，SWEET4d的插入等位基因突变体。(A)示出了15DAP籽粒表型，其中野生型在左侧，并且突变体在右侧：该突变体示出，与野生型籽粒相比，在大小/重量方面，总体下降了约60％。(B)示出了野生型(左侧)和突变体(右侧)的籽粒的矢状切口：胚和胚乳二者都显现是严重受该sweet4d突变影响，同时该母体果皮塌陷，示出“空果皮”表型。(C)示出了对于插入等位基因而言杂合的玉米植物(左侧)以及对于插入等位基因而言的纯合植物(右侧)。(D)将插入等位基因(增变基因)携带进入最后的外显子的构建体的示意图。(E)示出了突变体(左侧)和野生型(右侧)玉米籽粒的IKI淀粉染色：在野生型条件下，淀粉是大部分积累在胚乳和进入根分生组织的少数谷粒内以维持早期发芽。在突变体中，胚乳仍然积累淀粉，但是其大小被严重影响，并且大部分的该淀粉显现是被储存进胚中。

图9描绘了在携带驱动SWEET-GFP的天然启动子的转基因拟南芥的发育的种子中，SWEET11和15各自的局部表达。

图10描绘了在8DAF(开花后天数)，野生型(对照)、单突变体(sweet15)、双突变体(sweet11、12，sweet11、15)和三突变体(sweet11、12、15)间的胚表型的比较。双突变体sweet11、12和sweet11、15的胚示出比对照略微更小。三突变体sweet11、12、15极大地延迟了胚生长

图11描绘了在8和11DAF这两种情况下，野生型(对照)，单突变体(sweet15)，三突变体(sweet11、12、15)和双突变体(sweet11、12)的胚中，淀粉积累的比较。在用路戈尔碘溶液染色长角果5min并且用水洗涤两次后，将胚切开以拍照。来自三突变体sweet11、12、15的胚积累了比sweet11、12或对照更少的淀粉，并且来自sweet11、12的胚具有比sweet11、12、15更多的淀粉，比对照更少的淀粉

图12描绘了23个玉蜀黍SWEET和来自拟南芥(At)的17个SWEET家族成员的系统发育分析。为了进一步研究玉蜀黍和拟南芥SWEET的关系，使用通过Phytozome.net非冗余蛋白数据库的BlastP检索获得的来自拟南芥的最接近的氨基酸序列，构建了进化树(MEGA5.1)。该树证明了玉蜀黍SWEET也落入了如在拟南芥中限定的SWEET4分支中。

图13描绘了玉蜀黍中的SWEET4a、4b和4d的氨基酸比对。星号表示保守的氨基酸。贯穿所有序列，都观察到非常高的同源性，但是在C-末端内急剧减少。

图14描绘了在种子发育的不同阶段，不同SWEET的表达。在这一图中，发育模式遵从拟南芥SWEET表达。缩写：A，缺失；INS，生物学复制品之间的不一致检测；M，边缘的；P，存在。阶段和组织/隔室的缩写：阶段：PGLOB-前球形期；GLOB-球形期；HRT-心形期；LCOT-线性子叶期；MG-成熟绿色期。组织：CZE-合点端胚乳；CZSC-合点端种皮；EP-胚体；GSC-普通种皮；:MCE-珠孔端胚乳；PEN-周围胚乳；S-胚柄；WS-完整种子。使用MAS5.0算法产生了信号强度(相对mRNA)和信号检测鸣叫(signaldetectioncalls)(P、A、或M)。为了比较的目的，使用MAS5.0缺省参数，对于芯片上的所有探针组，将基因芯片数据全局地缩放至500的目标强度。基于RNA样品的两个生物学重复的MAS5.0检测鸣叫，为每个探针组手动分配合意的检测鸣叫。在两个生物学重复中具有相同信号检测鸣叫的探针组被分别分配P、A、或M的合意的检测鸣叫。相比之下，对于两个生物学重复(例如P和A；P和M)，具有不同的或不整一的检测鸣叫的探针组被分配不足(INS)的合意的检测鸣叫。

图15描绘了在早期种子发育阶段中，SWEET12的翻译表达。通过共聚焦显微镜，在种皮和胚柄中观察到GFP信号。

图16描绘了在种子的不同发育阶段中，SWEET15的翻译表达。SWEET15定位至种皮的最外层的PM。在线性子叶阶段，在胚乳中，也将GFP信号可视化。

图17描绘了在卵母细胞中，SWEET11、12和15摄取蔗糖的能力。将SWEET11、12和15的cRNA注射到卵母细胞中。在2天的表达后，测量¹⁴C蔗糖摄取。

图18描绘了在SWEET11、12和15的三突变体中，被延迟的拟南芥胚发育。三突变体sweet11、12、15的胚主要是自5DAF获取。通过差示干涉差(DIC)显微镜，在不同阶段，在干净的种子中获取图像

图19描绘了SWEET11、12和15的三突变体的种子产量比在野生型拟南芥中的要低。sweet11、12突变体具有比对照更低并且比sweet11、12、15更高的种子产量。Sweet11、12、15或sweet11、12并不影响每个长角果的种子数。

图20描绘了在5天龄的幼苗中，当将蔗糖添加至生长培养基时，蔗糖部分地解救三突变体(SWEET11、12和15)的根生长的能力。

图21描绘了在拟南芥三突变体(SWEET11、12、15)中，被严重损伤的种子发育的母本对照。(A)在8DAF，杂交的两种对照植物示出正常的种子发育。(B)将母本对照与父本三突变体杂交，并且在8DAF，所得种子显现出发育正常。(C)将父本对照与母本三突变体杂交，并且在8DAF，所得种子的发育被严重损害。(D)将父本三突变体与母本三突变体杂交，并且在8DAF，所得种子的发育被严重损害。(E)示出发育的幼苗的表面区域。

图22描绘了在玉蜀黍突变体中，SWEET11的上调，其中淀粉生物合成/积累是有缺陷的。野生型；aewx-直链淀粉增加子/蜡双突变体；sh1-shruken(缩小)-1突变体。值是在对数标度上。底部图中的构建体是基因SWEET11和通过再动员内源DS易位子产生的2个插入等位基因(DS-ANT和DS-ALV)的示意性表示。

图23描绘了在玉蜀黍中，在用羊毛脂和赤霉酸(GA₃)处理3天的叶子中SWEET11的上调。用羊毛脂和GA₃的混合物涂布嫩叶(8周)持续4天。然后去除羊毛脂和GA₃，以改进RNA提取。使用18S基因作为内标，来进行qPCR。值表示通过内标归一化的SWEET11的相对表达。

图24描绘了野生型和sweet4d突变体韧皮部末端和BETL的矢状截面。将超薄(1m)切片放在饱和IKI溶液中30min进行淀粉染色。黑点是淀粉粒，并且它们优先积累在sweet4d玉蜀黍突变体的母本韧皮部末端内。

图25描绘了在SWEET4d玉蜀黍突变体中异常的基底胚乳转移层(BETL)形态学，其中没有可见的细胞壁向内生长或细胞组织。用番红将切片染色至高亮细胞壁形态学。

图26描绘了示出保守氨基酸序列的多个拟南芥SWEET的序列比对数据的网络标志(weblogo)。在网络标志中字母的大小表示不同SWEET间氨基酸序列的保守程度。

图27描绘了示出保守氨基酸序列的多个拟南芥SWEET的序列比对数据的网络标志(weblogo)。在网络标志中字母的大小表示不同SWEET间氨基酸序列的保守程度。

发明详细说明

本发明涉及增加植物的发育种子中的至少一种糖的水平的方法，其中这些方法包括在植物细胞中插入编码至少一种糖转运体蛋白(SWEET蛋白)的外源核酸以产生转基因植物细胞，并且使该转基因植物细胞经受促进在种子发育过程中表达该至少一种SWEET蛋白的条件。这些方法导致转基因植物种子、以及产生种子的转基因植物，其中如与来自在相同条件下生长的相同物种的非转基因植物的种子相比，至少一种糖的水平是增加的。

SWEET蛋白一般属于PFAM家族“MtN3_slv”(登录号PF03083)。参见pfam.sanger.ac.uk，它是通过多重序列比对和隐蔽马尔科夫模型(HMM)确定和表示的蛋白家族的数据库。在本发明的一个实施例中，在本发明的这些方法、构建体、植物和植物种子中利用的SWEET转运体蛋白是单向传递体，这是本领域熟知的术语，是指通过促进扩散来促进转运的蛋白，即随溶质梯度转运的被转运分子。通常单向传递体并不利用用于移动它们所转运的分子的能量，除了利用溶质梯度。

SWEET蛋白是本领域熟知的，并且在多个数据库中可以发现它们的一级氨基酸结构，这些数据库包括但不限于植物膜蛋白数据库(例如aramemnon.botanik.uni-koeln.de)、秀丽隐杆线虫蛋白数据库(例如www.wormbase.org)、以及甚至人转运体数据库(例如www.tcdb.org)。一般SWEET具有不同于其他糖转运体的特征分子结构。例如，SWEET具有与lac通透酶、酵母己糖转运体、人GLUT或人SGLT不同的三维结构。SWEET转运体的基本单元是由三个跨膜结构域(TM)组成的结构域。在细菌中，具有3个TM的蛋白必须形成至少一个二聚体，以产生糖转运孔。SWEET蛋白的真核生物形式包含由另外的TM结构域分开的这一亚基的重复。在家族成员中，这一另外的TM(“TM4”)结构域并不是保守的，因此对于跨越SWEET蛋白界而正确发挥功能，这一结构域的特定氨基酸序列并不是关键的。这一另外的TM4结构域用作将3个TM的两个重复单位放入一个平行配置的反向接头，这就是如何与细菌蛋白一起形成二聚体的。这一7TM结构是与所有已知的糖转运体都不同的。这些SWEET蛋白的动物形式连同来自这一相同家族的细菌蛋白都转运糖，表明这些SWEET蛋白的植物形式是糖转运体。

通过保守氨基酸序列和结构特征这二者，限定了SWEET转运体超家族的成员。例如，所有SWEET都是由在嵌入串联3TM重复单位中的两个保守MtN3/唾液基序中分开的7个TM组成，这些TM是通过更不保守的中心TM螺旋连接的，表明这一中心TM用作接头。所得结构已经被描述为3-1-3TMSWEET结构。

预测第一TM结构域平均是由23个氨基酸(但是可以在20和25之间变化)组成。在这一TM结构域内，存在至少4种高度保守的氨基酸：G、P、T和F。

预测第二TM结构域平均是由19个氨基酸(但是可以在16和23之间变化)组成。在这一TM结构域内，存在至少3种高度保守的氨基酸：P、Y和Y。

预测第三TM结构域平均是由23个氨基酸(但是可以在20和25之间变化)组成。在这一TM结构域内，存在至少3种高度保守的氨基酸：T、N和G。

预测第五TM结构域平均是由23个氨基酸(但是可以在20和25之间变化)组成。在这一TM结构域内，存在至少3种高度保守的氨基酸：G、P和L。

该第五环，将TM5和6连接在一起，具有2种高度保守的氨基酸：V和T。

预测第六TM结构域平均是由23个氨基酸(但是可以在19和25之间变化)组成。在这一TM结构域内，存在至少7种高度保守的氨基酸：S、V、M、P、L、S和Y。

该第六环，将TM6和7连接在一起，具有一种高度保守的氨基酸：D。

预测第七TM结构域平均是由23个氨基酸(但是可以在20和25之间变化)组成。在这一TM结构域内，存在至少5种高度保守的氨基酸：P、N、G、Q和Y。

对于这一蛋白超家族而言，糖转运和七TM三维结构是两个关键特征。尽管在大小或序列方面有大的可变性，并且尽管从中可以分离它们的生物体具有广大数量，还是使用已经示出糖转运功能的不同异源系统测试了所有SWEET。

在本发明的一个实施例中，在本发明的这些方法、构建体、植物和植物种子中利用的SWEET转运体蛋白是蔗糖或己糖单向传递体。顾名思义，己糖单向传递体是转运己糖(例如环己糖、己醛醣和己酮糖)的转运体蛋白。在本发明的这些方法、构建体、植物和植物种子中利用的蔗糖或己糖单向传递体的实例包括但不限于葡萄糖单向传递体和果糖单向传递体。

一般而言，基于氨基酸序列相似性，可以将来自具体植物物种的的SWEET分类为多个分支或组。在玉蜀黍中，例如基于每个分支内的序列相似性，存在四个SWEET蛋白分支。例如，在玉蜀黍中分支I包含SWEET1a、1b、2、3a和3b；分支II包含SWEET4a、4b、4d、6a和6b；分支III包含SWEET11、12a、12b、13a、13b、13c、14a、14b、15a和15b；分支IV包含SWEET16a、16b和17。使用玉蜀黍中特定SWEET蛋白的个数以反映与拟南芥SWEET的系统发育关系，例如通过序列比较，玉蜀黍中SWEET11是与拟南芥中的SWEET11最相关的，并且使用更小的字母以指示相对拟南芥的可能的基因扩增。

相应地，SWEET蛋白的编号，例如SWEET1、SWEET2等，是指基于氨基酸序列比较，如源自拟南芥的特定SWEET蛋白连同其他物种中的直向同源物的氨基酸序列。因此，虽然基因和蛋白命名法是指在拟南芥信息资源(TAIR)数据库(在www.arabidopsis.org的万维网上可得)中鉴定的基因和蛋白，但是应理解，本发明并不限于仅在拟南芥中的基因和蛋白，并且本发明涵盖了其他物种中的基因的直向同源物。例如，应理解，利用由拟南芥中的基因AtSweet1-At1G21460、AtSweet2-At3G14770、AtSweet3-At5G53190、AtSweet4-At3G28007、AtSweet5-At5G62850、AtSweet6-At1G66770、AtSweet7-At4G10850、AtSweet8-At5G40260、AtSweet9-At2G39060、AtSweet10-At5G50790、AtSweet11-At3G48740、AtSweet12-At5G23660、AtSweet13-At5G50800、AtSweet14-At4G25010、AtSweet15-At5G13170、AtSweet16-At3G16690和AtSweet17-At4G15920编码的一个或多个转运体的本发明的这些方法、构建体、植物和植物种子(登录号是按照基因名，例如“At1G21460”是指来自TAIR数据库的登录号，如以上所描述的)可以被应用至利用由另一物种中的直向同源基因编码的一个或多个转运体的方法、构建体、植物和植物种子。如在此使用，直向同源基因是执行相同或相似功能的来自不同物种的基因，并且认为它们是遗传自共同祖先基因并且因此在它们的序列中共享了某个量的氨基酸一致性。通常，由直向同源基因编码的蛋白具有彼此类似的或几乎相同的氨基酸序列一致性，并且直向同源基因自身具有类似的核苷酸序列，特别是当考虑了遗传密码的冗余度时。因此，通过举例，拟南芥中蔗糖转运体的直向同源物将成为另一植物物种中的蔗糖转运体，不管两个蛋白的氨基酸序列如何。

在特定实施例中，用于本发明的方法、构建体、植物和植物种子中的SWEET转运体蛋白是来自作物植物，例如食用作物、饲料作物或生物燃料作物的SWEET蛋白。示例性重要作物可以包括玉米、小麦、大豆、棉花和稻。作物还包括玉米、小麦、大麦、黑小麦、大豆、棉花、小米、高粱、甘蔗、甜菜、马铃薯、番茄、葡萄藤、柑橘类(橙子、柠檬、葡萄柚、等)、莴苣、苜蓿、菜豆、蚕豆和草莓、向日葵和油菜籽、木薯、芒属和柳枝稷。植物的其他实例包括但不限于非洲雏菊、非洲堇、苜蓿、扁桃、银莲花、苹果、杏、芦笋、鳄梨、杜鹃花、香蕉和大蕉、甜菜、风铃草、黑胡桃、荷包牡丹、蝴蝶花、可可、蔓越橘、卡诺拉(canola)、康乃馨、胡萝卜、木薯、疾病、鹰嘴豆、瓜叶菊、柑橘、椰子树、咖啡、菜豆、玉蜀黍、棉花、十字花科植物、葫芦、仙客来、大丽花、枣椰树、花旗松、榆树、英国胡桃、亚麻、爵床科、龙舌兰科、天南星科、五加科、南洋杉科、萝藦科、紫葳科、凤梨科、仙人掌科、鸭跖草科、大戟科、龙胆科、苦苣苔科、竹芋科、桑科、棕榈科、胡椒科、水龙骨科、荨麻科、葡萄科、倒挂金钟属、天竺葵、葡萄、榛子、大麻、蟹爪兰、蛇麻子、八仙花、凤仙花属、耶路撒冷樱桃、高凉菜属、莴苣、滨豆、洋桔梗、芒果、沟酸浆属、猴面花、薄荷、芥菜、燕麦、番木瓜、豌豆、桃和油桃、落花生、梨、珍珠粟、美洲山核桃、胡椒、紫芳草、木豆、菠萝、阿月浑子、荷包花、一品红、马铃薯、报春花、红三叶草、杜鹃花属、稻、玫瑰、黑麦、红花、蓝宝石花、菠菜、草莓、甘蔗、向日葵、枫香属、甘薯、美国梧桐、茶、烟草、番茄、美女樱、和野生稻。

基于在此披露的SWEET转运体的氨基酸序列的描述，技术人员可以容易地从几乎任何植物种中鉴定任何SWEET转运体。一旦鉴定，本领域普通技术人员可以使用用于从给定物种中分离鉴定SWEET蛋白的编码序列的容易获得的方法，来产生编码希望的SWEET蛋白的核酸。

在特定实施例中，用于本发明的方法、构建体、植物和植物种子的SWEET蛋白是来自玉蜀黍的SWEET蛋白。SWEET蛋白的核酸序列和/或氨基酸序列的实例包括但不限于ZmSweet1a-GRMZM2G039365、ZmSweet1b-GRMZM2G153358、ZmSweet2-GRMZM2G324903、ZmSweet3a-GRMZM2G179679、ZmSweet3b-GRMZM2G060974、ZmSweet4a-GRMZM2G000812、ZmSweet4b-GRMZM2G144581、ZmSweet4d-GRMZM2G137954、ZmSweet6a-GRMZM2G157675、ZmSweet6b-GRMZM2G416965、ZmSweet11-GRMZM2G368827、ZmSweet12a-GRMZM2G133322、ZmSweet12b-GRMZM2G099609、ZmSweet13a-GRMZM2G173669、ZmSweet13b-GRMZM2G021706、ZmSweet13c-GRMZM2G179349、ZmSweet14a-GRMZM2G094955、ZmSweet14b-GRMZM2G015976、ZmSweet15a-GRMZM2G168365、ZmSweet15b-GRMZM5G872392、ZmSweet16a-GRMZM2G106462、ZmSweet16b-GRMZM2G111926、ZmSweet17-GRMZM2G107597。基因名后的登录号，例如“GRMZM2G039365”，是指来自在如以上所描述的www.maizegdb.org处的玉蜀黍遗传学和基因组学数据库的登录号。

在特定实施例中，用于本发明的方法、构建体、植物和植物种子的SWEET蛋白是来自稻的SWEET蛋白。SWEET蛋白的核酸序列和/或氨基酸序列的实例包括但不限于OsSweet1a-Os01g65880、OsSweet1b-Os05g35140、OsSweet2a-Os01g36070、OsSweet2b-Os01g50460、OsSweet3a-Os05g12320、OsSweet3b-Os01g12130、OsSweet4-Os02g19820、OsSweet5-Os05g51090、OsSweet6a-Os01g42110、OsSweet6b-Os01g42090、OsSweet7a-Os09g08030、OsSweet7b-Os09g08440、OsSweet7c-Os12g07860、OsSweet7d-Os09g08490、OsSweet7e-Os09g08270、OsSweet11-Os08g42350、OsSweet12-Os03g22590、OsSweet13-Os12g29220、OsSweet14-Os11g31190、OsSweet15-Os02g30910、OsSweet16-Os03g22200。基因名后的登录号，例如“Os01g65880”，是指来自在如在此描述的www.greenphyl.org处的Greenphyl数据库、或在ice.plantbiology.msu.edu处的TIGR数据库的登录号。

在特定实施例中，用于本发明的方法、构建体、植物和植物种子的SWEET蛋白是来自拟南芥的SWEET蛋白。SWEET蛋白的核酸序列和/或氨基酸序列的实例包括但不限于AtSweet1-At1G21460、AtSweet2-At3G14770、AtSweet3-At5G53190、AtSweet4-At3G28007、AtSweet5-At5G62850、AtSweet6-At1G66770、AtSweet7-At4G10850、AtSweet8-At5G40260、AtSweet9-At2G39060、AtSweet10-At5G50790、AtSweet11-At3G48740、AtSweet12-At5G23660、AtSweet13-At5G50800、AtSweet14-At4G25010、AtSweet15-At5G13170、AtSweet16-At3G16690、AtSweet17-At4G15920。基因名后的登录号，例如“At5G23660”，是指来自如以上所描述的TAIR数据库的登录号。

在特定实施例中，用于本发明的方法、构建体、植物和植物种子的SWEET蛋白是来自蒺藜状苜蓿的SWEET蛋白。SWEET蛋白的核酸序列和/或氨基酸序列的实例包括但不限于MtSWEET2b-AC235677_9、MtSWEET3c-Medtr1g028460、MtSWEET1a-Medtr1g029380、MtSWEET15a-Medtr2g007890、MtSWEET6-Medtr3g080990、MtSWEET1b-Medtr3g089125、MtSWEET3a-Medtr3g090940、MtSWEET3b-Medtr3g090950、MtSWEET13-Medtr3g098910、MtSWEET11-Medtr3g098930、MtSWEET4-Medtr4g106990、MtSWEET15b-Medtr5g067530、MtSWEET9a-Medtr5g092600、MtSWEET5a-Medtr6g007610、MtSWEET5c-Medtr6g007623、MtSWEET5d-Medtr6g007633、MtSWEET5b-Medtr6g007637、MtSWEET2c-Medtr6g034600、MtSWEET9b-Medtr7g007490、MtSWEET15d-Medtr7g405710、MtSWEET15c-Medtr7g405730、MtSWEET2a-Medtr8g042490、MtSWEET14-Medtr8g096310、MtSWEET12-Medtr8g096320、MtSWEET7-Medtr8g099730、MtSWEET16-Mtr.42164.1.S1。基因名后的登录号，例如“Medtr1g028460”，是指来自在如在此描述的www.plantgrn.noble.org处的豆类基因组数据库的登录号。

在特定实施例中，用于本发明的方法、构建体、植物和植物种子的SWEET蛋白是来自大豆。SWEET蛋白的核酸序列和/或氨基酸序列的实例包括但不限于GmSWEET1a-XP003526670、GmSWEET1b-Glyma13g09140、GmSWEET1c-Glyma14g27610、GmSWEET2-XP003540515、GmSWEET3a-XP003544116、GmSWEET3b-Glyma13g08190、GmSWEET3c-ACU24301、GmSWEET3d-Glyma04g41680、GmSWEET4-Glyma17g09840、GmSWEET5a-Glyma19g01280、GmSWEET5b-Glyma19g01270、GmSWEET6a-Glyma20g16160、GmSWEET6b-Glyma13g10560.1、GmSWEET7-Glyma08g02890、GmSWEET9a-XP00355271、GmSWEET9b-XP003552719、GmSWEET9c-Glyma08g48281、GmSWEET10a-XP003532478、GmSWEET10b-Glyma05g38340、GmSWEET10c-NP001237418、GmSWEET10d-XP003523161、GmSWEET10e-Glyma06g17540、GmSWEET11a-XP003532471、GmSWEET11b-Glyma05g38351、GmSWEET12a-Glyma04g37530、GmSWEET12b-XP003526939、GmSWEET15a-Glyma08g19580、GmSWEET15b-Glyma15g05470、GmSWEET15c-XP003524088、GmSWEET15d-XP003551863、GmSWEET15e-Glyma08g47561、GmSWEET15f-Glyma18g53930、GmSWEET16a-Glyma09g04840、GmSWEET16b-Glyma15g16030、GmSWEET17-Glyma19g42040。基因名后的登录号，例如“Glyma19g42040”，是指来自在如在此描述的www.plantgrn.noble.org处的豆类基因组数据库、或在www.photozome.net处的植物基因组数据库(Phytozomedatabase)的登录号。

在其他实施例中，本发明的这些方法、构建体、植物和植物种子可以包括或包括至少一个编码SWEET蛋白或其变体的外源核酸的用途，其中该外源核酸编码包括与SEQIDNO：1-410的氨基酸序列中的任一个至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列的SWEET或其变体。在另一实施例中，本发明的这些方法、构建体、植物和植物种子可以包括或包括编码SWEET蛋白或其变体的至少一个外源核酸的用途，其中该外源核酸编码由与SEQIDNO：1-410的氨基酸序列中的任一个至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列组成的SWEET或其变体。

本发明涉及编码SWEET或其变体的分离的核酸，并且涉及包含这些核酸的构建体、宿主细胞、植物组织和植物种子。本发明的核酸可以是DNA或RNA。核酸分子可以是单链的或双链的RNA或DNA；单链的RNA或DNA可以是编码链、或有义链，或非编码链、或反义链。具体地，这些核酸可以编码任何SWEET、或其变体、连同融合蛋白。例如，本发明的核酸包括编码谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白、多组氨酸(例如His6)、多HN、聚赖氨酸、血球凝集素、HSV标记的多核苷酸序列。如果希望，分离的核酸的核苷酸序列可以包括另外的非编码序列，例如非编码3’和5’序列(例如包括调节序列)。

本发明的核酸分子可以是“分离的”。如在此使用的，“分离的”核酸分子或核苷酸序列意思是指侧翼不是正常插入基因或核苷酸序列的侧翼的核苷酸序列的(如在基因组序列中)和/或已经完全地或部分地从其天然环境(例如细胞、组织)去除的核酸分子或核苷酸序列。例如，已经从细胞去除或纯化的核酸分子被认为是分离的。在一些实例中，分离的材料将形成组合物的一部分，例如包含其他物质、缓冲系统或试剂混合物的粗提物。在其他情况下，可以将该材料纯化至接近均质，例如，如通过PAGE或柱色谱法(例如HPLC)确定。因此，分离的核酸分子或核苷酸序列可以包括使用重组DNA技术或使用任何其他适合的方法化学合成的核酸分子或核苷酸序列。为了清楚，包含在载体中的核酸将被包括在如在此使用的“分离的”的定义中。而且分离的核苷酸序列包括异源生物体中的重组核酸分子，例如DNA、RNA，连同溶液中部分地或基本上纯化的核酸。另一方面，“纯化的”是本领域中很好理解的并且一般是指核酸分子基本上不含细胞材料、细胞组分、化学前体或可能是缓冲液或溶剂之外的其他化学品。“基本上不含”意思是指新颖的核酸分子之外的其他组分是不可检测的。本发明的核酸分子可以是分离的或纯化的。在体内和在体外，“分离的”核苷酸序列还涵盖本发明的DNA分子的RNA转录物。

本发明还涵盖了本发明的核苷酸序列的变化，例如，如在此描述的多肽的那些编码功能片段或变体。此类变体可以是天然存在的、或非天然存在的，例如通过不同诱变剂和诱变程序诱导的那些。有意的变化包括但不限于可以导致保守的或非保守的氨基酸改变(包括添加和缺失)的一个或多个核苷酸的添加、缺失和取代。

在此描述的本发明还涉及在此描述的分离的核酸分子的片段。术语“片段”意思是涵盖形成至少约20个连续核苷酸到至少约50个连续核苷酸或更长长度的在此描述的核苷酸序列的一部分。此类片段可以用作探针和引物。具体地，引物和探针可以选择性地与编码在此描述的多肽的核酸分子杂交。例如，如以下描述，编码保留活性的多肽的片段是特别有用的。

本发明还提供了在高严谨度杂交条件下(例如用于选择性杂交)与在此描述的核苷酸序列杂交的核酸分子(例如与编码在此描述的多肽的核苷酸序列特异性杂交并且编码修饰的生长因子isooherin的核酸分子)。杂交探针包括以碱基特异性方式与核酸的互补链结合的合成寡核苷酸。适合的探针包括如在尼尔森(Nielsen)等人，科学(Science)，254:1497-1500(1991)中描述的多肽核酸。

可以通过特异性杂交，例如在高严谨度条件下，检测和/或分离此类核酸分子。对于杂交而言，“严谨度条件”是本领域的术语，是指允许具体核酸与第二核酸杂交的孵育和洗涤条件，例如温度条件和缓冲液浓度；第一核酸可以是与第二核酸完全互补，即100％，或者第一核酸和第二核酸可以共享一定程度的互补性，该互补性是低于完全的，例如60％、75％、85％、95％或更多。例如，某些高严谨度条件可以用来区别完全互补的核酸与具有更差互补性的那些。

在现代分子生物学实验指南(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，约翰威立父子出版公司JohnWiley&Sons)，(1988)中解释了用于核酸杂交的“高严谨度条件”、“中严谨度条件”和“低严谨度条件”，通过引用将其结合。决定杂交的严谨度的额外条件不仅取决于离子强度(例如洗涤缓冲液的0.2XSSC、0.1XSSC)，温度(例如室温、42℃、68℃、等)，以及去稳定剂(例如甲酰胺)或变性剂(例如SDS)的浓度，而是还取决于多种因素，例如核酸序列的长度、碱基组成、杂交序列之间的错配百分比以及其他非一致序列内的该序列的子集的出现频率。因此，可以按照经验确定高、中或低严谨度条件。

通过从不发生杂交的严谨度水平至初次观察到杂交的水平改变杂交条件，可以确定将允许给定序列与样品中的最类似序列杂交的条件。

在克劳斯(Krause，M.H.)和阿伦森(S.A.Aaronson)，酶学方法(MethodsinEnzymology)，200:546-556(1991)中描述了示例性条件，通过引用将其结合。洗涤是其中通常设置条件为以便确定杂交的互补性的最低水平的步骤。一般，从仅发生同源杂交的最低温度开始，最终洗涤温度降低每一度(℃)，同时保持SSC浓度恒定，允许在杂交的序列间错配的最大程度上增加1％。一般，SSC浓度加倍导致Tm增加。使用这些准则，可以取决于寻找的错配水平，针对高、中或低严谨度按照经验确定洗涤温度。示例性高严谨度条件包括但不限于在50％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中在37℃下杂交，并且在0.1XSSC在60℃下洗涤。渐进地更高严谨度条件的实例包括在杂交后，在约室温下，用0.2XSSC和0.1％SDS洗涤(低严谨度条件)；在约42℃下，用0.2XSSC、和0.1％SDS洗涤(中严谨度条件)；以及在约68℃下，用0.1XSSC洗涤(高严谨度条件)。可以使用这些条件中的仅一种，例如高严谨度条件，来进行洗涤，洗涤可以涵盖按增加的严谨度的顺序的严谨度条件中的两个或更多个。取决于涉及的具体杂交反应，最佳条件将改变，并且可以按照经验确定。

如本领域已知，可以通过改变作为实例而给定的参数中的一个或多个来确定等价条件，同时维持靶标核酸分子和使用的引物或探针之间的一致性或相似性的类似程度。例如，可杂交核苷酸序列可以用作用于鉴定包含本发明的核酸的生物体和/或用来分离本发明的核酸的探针和引物。在此使用术语“引物”是如其在本领域中，并且是指在适当的缓冲液中和适合的温度下的适当条件下，充当模板指导的DNA合成的起始点的单链寡核苷酸。引物的适当长度取决于引物的预期用途，而典型地范围是从约15至约30个核苷酸。短引物分子一般要求更冷的温度，以形成与模板的充分稳定的杂交复合物。引物不需要反映模板的精确序列，但是必须足够互补以与模板杂交。术语“引物位点”是指与引物杂交的靶标DNA的区域。术语“引物对”是指一组引物，该组引物包括与待扩增的DNA序列的5’端杂交的5’(上游)引物，和与待扩增的序列的3’端的互补物杂交的3’(下游)引物。

可以通过本领域已知的方法来扩增在此描述的核酸。例如，可以通过聚合酶链式反应(PCR)来完成扩增。参见PCR技术：用于DNA扩增的原理和应用(PCRTechnology：PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification)(埃尔利赫(H.A.Erlich)编辑，自由人出版社(FreemanPress)，纽约，纽约州，1992)；PCR实验方案：对方法和应用的指南(PCRProtocols：AGuidetoMethodsandApplications)(英尼斯(Innis)等人编辑，学术出版社，圣迭戈，加利福尼亚州，1990)；埃克特(Eckert)等人，PCR方法和应用(PCRMethodsandApplications)1:17(1991)；PCR(麦克弗森(McPherson)等人编辑，(Wararchuk等；Lawson等)，IRL出版社，牛津)；以及美国专利号4,683,202，将以上所有文献通过引用结合在此。其他适合的扩增方法包括连接酶链式反应(LCR)(参见吴(Wu)和华莱士(Wallace)，基因组学(Genomics)，4:560(1989)，兰德格伦(Landegren)等人，科学(Science)，241:1077(1988)，将这两篇文献都通过引用结合在此)，转录扩增(郭(Kwoh)等人，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，86:1173(1989)将其通过引用结合在此)，以及自持序列复制(瓜特利(Guatelli)等人，美国科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)，87:1874(1990)将其通过引用结合在此)，以及基于核酸序列的扩增(NASBA)。

本发明还涉及包括本发明的核酸分子的载体，用本发明的载体基因工程化的宿主细胞，以及通过重组技术来产生SWEET或其变体。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白”在此被可互换地使用。如在此使用，“分离的多肽”意思是指已经完全地或部分地从其天然环境去除的多肽。例如，已经从细胞去除或纯化的多肽被认为是分离的。此外，出于本发明的目的，包含在宿主细胞中的重组产生的多肽分子被认为是分离的。此外，出于本发明的目的，在其中它不是正常表达或发现的细胞、组织或基质中发现的肽也被认为是“分离的”。类似地，已经合成的多肽被认为是分离的多肽。另一方面，“纯化的”是本领域中很好理解的并且一般是指肽基本上不含细胞材料、细胞组分、化学前体或可能是缓冲液或溶剂之外的其他化学品。“基本上不含”意思是指肽或其变体之外的其他组分是不可检测的。

在特定实施例中，用于本发明的方法、构建体、植物和植物种子的SWEET蛋白可以包括或包括具有SEQIDNO：1-410中任意一个或多个的氨基酸序列的蛋白或肽的用途。

在其他实施例中，本发明的这些方法、构建体、植物和植物种子可以包括或包括SWEET蛋白的变体的用途。在一个实施例中，SWEET变体包括与SEQIDNO：1-410的氨基酸序列中的任一个至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。在另一实施例中，SWEET变体是由具有与SEQIDNO：1-410的氨基酸序列中的任一个至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列的肽组成。

表II–SEQID表

在另外的实施例中，在此描述的这些肽变体是功能性的并且当在本发明的这些方法、构建体、植物和植物种子中使用时能够转运至少一种糖。在一些实施例中，相比于野生型SWEET，本发明的这些SWEET变体具有增强的用以转运至少一种糖的能力。

一种具有与参考氨基酸序列(例如，SEQIDNO：1)至少例如约95％“一致”的氨基酸序列的多肽应理解为是指该多肽的氨基酸序列与该参考序列一致，除了该氨基酸序列对于该参考氨基酸序列的每100氨基酸可以包括高达约五个修饰。换言之，为了获得具有与参考氨基酸序列至少约95％一致的氨基酸序列的肽，该参考序列高达约5％的氨基酸残基可以缺失或被另一种氨基酸取代，或者，该参考序列中高达约5％总氨基酸的许多氨基酸可以被插入该参考序列中。该参考序列的这些修饰可以发生在该参考氨基酸序列的N-末端或C-末端位置或那些末端位置之间的任何位置，在该参考序列的氨基酸之间单独地散布或者在该参考序列内呈一个或多个连续群体。

如在此所使用，“一致性”是对核苷酸序列或氨基酸序列相比于参考核苷酸或氨基酸序列的一致性的衡量。一般，对这些序列进行比对，这样就获得了最高级别的匹配。“一致性”本身具有本领域公认的含义并且可以使用熟知的技术进行计算。虽然存在若干种用以测量两个多核苷酸或多肽序列之间一致性的方法，术语“一致性”是熟练的业内人士所熟知的(卡里略(Carillo)(1988)应用数学杂志(J.AppliedMath)48，1073)。用来确定两个序列之间的一致性和相似性的计算机程序方法的实例包括但不限于，GCG程序包(德弗罗(Devereux)(1984)，核酸研究(NucleicAcidsResearch)12，387)、BLASTP、ExPASy、BLASTN、FASTA(阿特休尔(Atschul)(1990)，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215，403)和FASTDB。用来确定一致性和相似性的方法的实例在麦考斯(Michaels)(2011)，蛋白科学实验指南(CurrentProtocolsinProteinScience)，第1卷(约翰威立父子出版公司(JohnWiley&Sons))中讨论。

在本发明的一个实施例中，用于确定一致性两个或更多个多肽之间的一致性的算法是BLASTP。在本发明的另一个实施例中，用于确定两个或更多个多肽之间的一致性的算法是FASTDB，其是基于布鲁特拉格(Brutlag)(1990)生物科学的计算机应用(Comp.App.Biosci.)6，237-245)的算法。在FASTDB序列比对中，这些查询和参考序列是氨基序列。序列比对的结果呈百分比一致性。在一个实施例中，可以用于氨基酸序列的FASTDB比对以计算百分比一致性的参数包括但不限于：矩阵＝PAM、k-元组＝2、错配罚分＝1、连接罚分＝20、随机化组长度＝0、截止分＝1、空位罚分＝5、空位尺寸罚分0.05、窗口大小＝500或该受试氨基序列的长度，取较短的一个。

如果因为N-末端或C-末端添加或缺失而不是因为内部添加或缺失，该参考序列比该查询序列更短或更长，可以进行人工校正，因为在计算百分比一致性时该FASTDB程序不会对该参考序列N-末端和C-末端截短或添加作出说明。对于在N-或C-末端处相对于该参考序列截短的查询序列，通过计算该查询序列的在该参考序列的N-和C-末端不匹配/对齐的残基数目作为该查询序列总碱基的百分数，来校正该百分比一致性。FASTDB序列比对的结果确定匹配/比对。然后，将该比对百分比从该百分比一致性中减掉，使用这些特定参数通过以上FASTDB程序计算，以获得最终百分比一致性评分。这种校正的评分可以用于确定如何将比对彼此“对应”以及百分比一致性的目的。延伸越过该查询序列N-或C-末端的参考序列的残基可以被认为是用于人工调节该百分比一致性评分的目的。也就是说，当人工调节该百分比一致性评分或比对编号时，可以计数与比较序列的N-或C-末端不匹配/对齐的残基。

例如，将90个氨基酸残基的查询序列与100个残基的参考序列进行比对来确定百分比一致性。该缺失发生在该查询序列的N-末端处，并且因此，该FASTDB比对并未显示出在N-末端处最初10个残基的匹配/对齐。这10个不成对的残基代表该参考序列的10％(在N-和C-末端处不匹配的残基数目/该参考序列中残基的总数)，因此从通过该FASTDB程序计算的百分比一致性评分中减掉10％。如果剩余的90个残基是完全匹配(100％对齐)的，最终的百分比一致性为90％(100％对齐-10％不匹配的突出)。在另一个实例中，90残基的查询序列与100的参考序列相比，除了这些缺失为内部缺失。在这种情况下，通过FASTDB计算的百分比一致性不是人工校正的，因为该受试序列的N-或C-末端处没有残基与该查询不匹配/对齐。在再另一个实例中，将110个氨基酸的查询序列与100个残基的参考序列进行比对来确定百分比一致性。该查询中的添加发生在该查询序列的N-末端处，并且因此，该FASTDB比对可以不显示在N-末端处最初10个残基的匹配/对齐。如果该查询序列剩余的100个氨基酸残基与该参考序列的整个长度具有95％的一致性，该查询的N-末端添加将被忽略并且该查询与该参考序的百分比一致性为95％。

如在此所使用，术语“对应于”和“相对应”，因为它们涉及序列比对，意思是指该参考蛋白(例如，野生型SWEET4d)内所枚举的位置以及在该变体或直向同源物SWEET4d中与该参考蛋白的位置对齐的那些位置。因此，当将受试SWEET的氨基酸序列与参考SWEET的氨基酸序列比对时，该受试序列中“对应于”该参考序列某些枚举的位置的氨基酸是与该参考序列(例如，SEQIDNO：2)的这些位置对齐的那些，但是不一定是在该参考序列的这些精确的数字位置中。在此描述了用于比对序列以确定序列之间对应氨基酸的方法。

还考虑到了通过将编码SWEET的多核苷酸插入表达载体系统中产生的变体。例如，变体(通常插入)可产生于当SWEET的氨基末端和/或羧基末端融合到另一种多肽时。

在另一个方面，本发明提供了缺失变体，其中SWEET中的一个或多个氨基酸残基被去除。可以在该SWEET的一个或者两个末端处、或通过除去该SWEET的一个或多个非末端氨基酸残基实现缺失。因此，缺失变体包括特定SWEET的所有功能片段。

在所披露的百分比一致性的限定范围内，本发明还涉及本发明所披露的多肽的取代变体。取代变体包括那些其中SWEET的一个或多个氨基酸残基被去除并且被替代性残基替换的多肽。在一个方面，这些取代本质上是保守的；然而，本发明包含还是非保守性的取代。用于此目的的保守取代可以被定义为如在下表中所列出的。可以根据物理特性以及对二级和三级蛋白结构的贡献将氨基酸分类。保守取代在本领域中公认为是一个氨基酸对另一个具有相似特性的氨基酸的取代。示例性的保守取代在下文列出。

表III：保守取代

可替代地，保守氨基酸可以如描述于洛伊宁格尔(Lehninger)(1975)生物化学(Biochemistry)(第二版；沃茨出版社(WorthPublishers)，第71-77页)中分组，如在下文列出。

表IV：保守取代

并且再其他可替代的示例性保守取代在下文列出。

表V：保守取代

应该理解的是，本发明的这些肽或多肽的定义旨在包括具有除插入、缺失或氨基酸残基的取代之外的修饰的多肽。通过举例，这些修饰本质上可以是共价的，并且包括例如，与聚合物、脂质、其他有机和无机部分的化学键合。这类衍生物可以被制备用于改进细胞内加工、该多肽针对所希望的细胞或组织等的靶标能力等。类似地，本发明进一步包括多种SWEET或其变体，它们已经被共价地修饰为包括一个或多个水溶性聚合物附着点，例如聚乙二醇、聚氧乙烯二醇或聚丙二醇。

在本发明的方法、构建体、植物和植物种子中使用的一种或多种植物细胞可以是来自一种植物的任何部分或组织，包括但不限于根、茎、叶、种子、种皮、花、果实、花药、蜜腺、子房、花瓣、绒毡层、木质部、或韧皮部。如果该基因修饰的植物细胞被包括在全株内，该整个植物不需要含有或表达该遗传修饰。

如在此所述，该基因修饰的植物和/或植物细胞和/或植物种子可以是一种植物或来自一种为双子叶植物或单子叶植物或裸子植物的植物。该植物可以是作物，例如食物作物、饲料作物或生物燃料作物。示例性重要作物可以包括玉米、小麦、大豆、棉花和稻。作物还包括玉米、小麦、大麦、黑小麦、大豆、棉花、小米、高粱、甘蔗、甜菜、马铃薯、番茄、葡萄藤、柑橘类(橙子、柠檬、葡萄柚、等)、莴苣、苜蓿、菜豆、蚕豆和草莓、向日葵和油菜籽、木薯、芒属和柳枝稷。植物的其他实例包括但不限于非洲雏菊、非洲堇、苜蓿、扁桃、银莲花、苹果、杏、芦笋、鳄梨、杜鹃花、香蕉和大蕉、甜菜、风铃草、黑胡桃、荷包牡丹、蝴蝶花、可可、蔓越橘、卡诺拉(canola)、康乃馨、胡萝卜、木薯、疾病、鹰嘴豆、瓜叶菊、柑橘、椰子树、咖啡、菜豆、玉蜀黍、棉花、十字花科植物、葫芦、仙客来、大丽花、枣椰树、花旗松、榆树、英国胡桃、亚麻、爵床科、龙舌兰科、天南星科、五加科、南洋杉科、萝藦科、紫葳科、凤梨科、仙人掌科、鸭跖草科、大戟科、龙胆科、苦苣苔科、竹芋科、桑科、棕榈科、胡椒科、水龙骨科、荨麻科、葡萄科、倒挂金钟属、天竺葵、葡萄、榛子、大麻、蟹爪兰、蛇麻子、八仙花、凤仙花属、耶路撒冷樱桃、高凉菜属、莴苣、滨豆、洋桔梗、芒果、沟酸浆属、猴面花、薄荷、芥菜、燕麦、番木瓜、豌豆、桃和油桃、落花生、梨、珍珠粟、美洲山核桃、胡椒、紫芳草、木豆、菠萝、阿月浑子、荷包花、一品红、马铃薯、报春花、红三叶草、杜鹃花属、稻、玫瑰、黑麦、红花、蓝宝石花、菠菜、草莓、甘蔗、向日葵、枫香属、甘薯、美国梧桐、茶、烟草、番茄、美女樱、和野生稻。

本发明的这些方法、构建体、植物和植物种子涉及发育种子中提高的糖水平。术语“糖”在本领域中是熟知的并且用于指单糖、二糖、三糖、四糖或多糖。所测量的该糖或这些糖可以或可以不被修饰，例如被乙酰化。确切地，这些增加的糖选自下组，该组由以下各项组成：蔗糖、果糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖。这些增加的糖可以或可以不是更复杂化合物的一部分，例如，三糖(例如，棉子糖)，四糖(例如，水苏糖)或多糖，(例如，直链淀粉、支链淀粉)。本发明不限于这些在本发明的种子和植物中增加的特定糖种类。确实，本发明的这些SWEET转运体向该发育种子中主要转运己糖，例如但不限于葡萄糖、甘露糖、果糖和半乳糖，连同二糖，例如但不限于蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖。然而，一旦进入该种皮或发育种皮中，该种子可以利用这些增加的己糖和/或二糖然后形成更复杂的糖。这些该种子或发育种子中可以包含(增加)的更复杂的糖包括但不限于二糖、三糖(例如，棉子糖)、四糖(例如，水苏糖)或多糖(例如，直链淀粉、支链淀粉)。

因此，例如，“葡萄糖的增加”在此用于表示与对照相比葡萄糖水平增加了，不管该葡萄糖是否为游离葡萄糖，即，作为一种单糖存在，或者该葡萄糖亚单元是否是一种更复杂化合物例如但不限于二糖、三糖、四糖、或甚至多糖的一部分。类似地，例如，“果糖的增加”在此用于表示与对照相比果糖水平增加了，不管该果糖是否为游离果糖，即，作为一种单糖存在，或者该果糖亚单元是否是一种更复杂化合物例如但不限于二糖、三糖、四糖、或甚至多糖的一部分。类似地，例如，“蔗糖的增加”在此用于表示与对照相比蔗糖水平增加了，不管该蔗糖是否为游离蔗糖，即，作为一种二糖存在，或者该果糖是否是一种更复杂化合物例如但不限于三糖、四糖、或甚至多糖的一部分。鉴于二-、三-、四-和多糖的这些结构单元是熟知的，并且已很好地建立了用于分析种子中含糖量的方法，例如，赫斯特(Hirst)，E.L.，等人，生物化学杂志(Biochem.J.)，95:453-458(1965)，斯特德曼(Steadman)，K.，等人，植物学年鉴(Ann.Botany)，77:667-674(1996)，巴克里奇(Buckeridge)，M.S.，植物生理学(PlantPhysiol.)，154(3):1017-1023(2010)，将以上所有文献通过引用结合在此，本领域中的技术人员可以容易地确定，与对照种子或对照发育种子相比，种子或发育种子中的糖水平是否有增加。在所选实施例中，评估或测量种子中糖和/或淀粉含量水平的方法包括但不限于HPLC、NMR和质谱分析法。

如在此所使用，短语“至少一种糖水平的增加”或“增加至少一种糖”或其一些衍生词意指，与对照种子或对照发育种子相比，该种子或发育种子中所测量的至少一种特定糖的水平增加，即使该种子或发育种子中另一种糖的水平可能降低或保持不变。当然，与对照种子或对照发育种子相比，所测量的多于一种特定糖可以增加。在特定实施例中，短语“至少一种糖水平的增加”意指在该种子或发育种子中至少葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖或纤维二糖中的至少一种的增加。在其他特定实施例中，短语“至少一种糖水平的增加”意指在该种子或发育种子中葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖或纤维二糖中的至少两种的增加。在其他特定实施例中，短语“至少一种糖水平的增加”意指在该种子或发育种子中葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖或纤维二糖中的至少三种的增加。在其他特定实施例中，短语“至少一种糖水平的增加”意指在该种子或发育种子中葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖或纤维二糖中的至少四种的增加。在其他特定实施例中，短语“至少一种糖水平的增加”意指在该种子或发育种子中葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖或纤维二糖中的至少五种的增加。在其他特定实施例中，短语“至少一种糖水平的增加”意指在该种子或发育种子中葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖或纤维二糖中的至少六种的增加。在其他特定实施例中，短语“至少一种糖水平的增加”意指在该种子或发育种子中葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖或纤维二糖中的至少七种的增加。在其他特定实施例中，短语“至少一种糖水平的增加”意指在该种子或发育种子中葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖或纤维二糖中的至少八种的增加。在其他特定实施例中，短语“至少一种糖水平的增加”意指在该种子或发育种子中葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖和纤维二糖的增加。

如在此所使用，术语“种子”如其在本领域中所使用，即，包含在种皮中的胚植物体，并且在受精之后产生并且在母体植株内进行至少一些生长。“发育种子”是在母体植株内还未完成其生长的胚植物体，或它可以是种皮还未围绕其完全形成的胚植物体。出于如涉及在此所述的本发明时测量种子或发育种子中的糖的目的，这些种子或发育种子可以或可以不被包含在该母体植株内。例如，这些种子可以被包含在该植物的果实之内或之上，并且在收获时该果实可以或可以不脱离该母体植株。分离这些种子或发育种子的位置和方法无关于本发明的目的。

本发明的这些方法、构建体、植物和植物种子涉及将外源核酸插入植物细胞中，其中该核酸编码至少一种在此所述的SWEET转运体蛋白。如在此所使用，短语“外源核酸”用于指通常不存在于或出现于该植物细胞的基因组中的核酸。例如，编码野生型SWEET转运体的核酸的至少一个额外拷贝是外源核酸。当然，编码突变型SWEET转运体的核酸的拷贝也被认为是外源核酸。

在一个实施例中，编码至少一种SWEET转运体蛋白的外源核酸源自于该外源核酸有待插入其中的相同物种(其包括来自该相同物种中相同或不同的亚种)。例如，编码至少一种SWEET转运体蛋白的核酸是编码玉蜀黍SWEET转运体蛋白的核酸，并且该外源核酸被插入到玉蜀黍植物细胞中。在另一个实施例中，编码至少一种SWEET转运体蛋白的该外源核酸源自于该外源核酸有待插入其中的不同物种。例如，编码至少一种SWEET转运体蛋白的核酸是编码拟南芥SWEET转运体蛋白的核酸，并且该外源核酸被插入到玉蜀黍植物细胞中。在又另一个实施例中，编码至少一种SWEET转运体蛋白的该外源核酸源自于该外源核酸有待插入其中的不同属。例如，编码至少一种SWEET转运体蛋白的核酸是编码四倍体多年生玉米(Zeaperennis)SWEET转运体蛋白的核酸，并且该外源核酸被插入到玉蜀黍植物细胞中。

用于将核酸分子引入或插入到植物和植物细胞中的方法的是本领域熟知的。例如，可以使用农杆菌介导的基因转移、显微注射、电穿孔或基因枪法进行植物转化，如它在例如拍特里库斯(Potrykus)和斯潘根贝格(Spangenberg)(编辑)，基因转移至植物(GeneTransfertoPlants.)，施普林格出版社(SpringerVerlag)，柏林，纽约，1995中所描述的。其中，并且在许多其他的本领域技术人员可获得的参考文献中，描述了有用的植物转化载体、选择转化细胞和组织的方法连同再生技术，并且可以将它们应用于本发明的方法中。

通过将该外源核酸插入到植物细胞中，由此产生转基因植物。这些方法通常涉及将外源核酸插入植物细胞中。该插入可以是瞬时的使得所插入的核酸不必遗传至后代。在替代方案中，该插入可以是稳定或整合的使得所插入的核酸遗传至后代。此外，这些核酸所插入的植物细胞可以处于培养物中或者它可以是全株的一部分。例如，转染核酸进入植物细胞，如在此理解的，包括将核酸引入植物原生质体中并允许这些原生质体发育为愈伤组织，然后允许其生长成为成熟植物。如在此所使用，短语“使这一转基因植物细胞生长成成熟植物”用于指使用允许该或这些经转染的植物细胞发育为全株的培养物或非培养物生长条件，该全株将包含编码至少一种SWEET转运体蛋白的核酸的至少一个拷贝。在其他实施例中，“使这一转基因植物细胞生长成成熟植物”包括将该核酸引入植物的一部分中，例如叶、胚或其部分，并且随后从该叶、胚或其部分再生全株(T₀代)。这些T₀代植物可以随后与其他植物交配或杂交以产生T₁、T₂、T₃等代的植物。与这些T₀代植物杂交用于产生转基因植物(对于在此所述的SWEET转运体是转基因的)后代的这些其他“交配植物”可以或可以不是野生型植物。在另一个实施例中，与这些T₀代植物杂交用于产生转基因植物后代的这些交配植物本身可以或可以不是转基因植物，包括但不限于另一种对于在此所披露的至少一种SWEET转运体是转基因的T₀代植物)。当然，如果这些用于使这些转基因植物细胞生长成成熟转基因植物的交配植物本身是转基因的，这些交配植物可以对于该蛋白或核酸或不同的蛋白或核酸是转基因的。当在此使用短语“使这些转基因植物细胞生长成成熟转基因植物”时，包括和考虑了这些T₀代植物随后杂交或交配产生后代，例如，T₁、T₂、T₃等。

一旦产生了这些转基因植物细胞，使用在此披露以及在本领域中良好确立的方法，然后这种或这些转基因植物细胞可以生长成含有转基因种子的植物。然后，通过这些含有转基因种子的植物产生的种子与相同物种的非转基因植物相比能够产生具有增加的含糖量的种子。如在此所使用的，“非转基因植物”指示该植物不具有编码SWEET蛋白作为在此提供的转基因植物的相同外源核酸(如通过序列一致性确定的)。因此，非转基因植物，如在此使用的，可以是野生型植物或它可以是对于不同的核酸、蛋白、突变等是转基因的。

如在此所使用的，短语“增加的糖水平”或“水平增加”用于指当相比于对照时，如在此所定义的至少一种特定的糖得以增加。

一旦测量或评估了至少一种糖的水平(直接或间接地)，这些测量的水平然后可以与该至少一种糖的对照水平相对比。一种或多种糖的对照水平被认为是来自与该转基因植物相同的物种并且生长于相似(如果不相同)条件中的非转基因植物(如在此所定义)的种子中糖的水平。为了建立非转基因(“正常”)植物的测量糖水平，可以对非转基因植物个体或非转基因植物群组进行分析以确定该植物或这些植物典型产生的种子中特定糖的水平。本发明的这些方法、构建体、植物和植物种子不一定需要本领域的技术人员进行实际分析以确定该至少一种糖在植物中的对照水平，因为这类数据可以容易地在文献中获得或这类数据可以被提供。

当然，正常测量的糖水平的测量可落入一个数值范围内，并且未落入这个“正常范围”内的值被称为在该正常范围之外。相比于在该“正常范围”内的测量，这些测量可以或可以不被转化为值、数字、因数或分数。例如，取决于所设计的评分系统，高于该正常范围的特定测量值可以被指定一个值或+1、+2、+3等。测量的糖水平与控制水平的对比是来确定相比于生长于相似(如果不相同)条件中的非转基因植物中相同糖的对照水平，这些植物种子是否具有升高水平的糖。

对照和转基因种子两者中的糖水平可以在种子或发育种子中进行评估。在一个实施例中，当这些种子或发育种子处于大致相同发育阶段时，对来自转基因和非转基因植物的种子或发育种子的糖水平进行测量。例如，在一个实施例中，在种子发育的合子期、在种子发育的前球形期、在种子发育的球形期、在种子发育的过渡期、在种子发育的心形期、在种子发育的鱼雷期、在种子发育的线性子叶期、在种子发育的弯曲子叶期、或在种子发育的成熟绿色期，对来自转基因和非转基因植物的种子或发育种子中的糖水平进行测量。在另一个实施例中，在至少两个选自以下的时期中对来自转基因和非转基因植物的种子或发育种子中的糖水平进行测量：在种子发育的合子期、在种子发育的前球形期、在种子发育的球形期、在种子发育的过渡期、在种子发育的心形期、在种子发育的鱼雷期、在种子发育的线性子叶期、在种子发育的弯曲子叶期、或在种子发育的成熟绿色期。在另一个实施例中，在至少三个选自以下的时期中对来自转基因和非转基因植物的种子或发育种子中的糖水平进行测量：在种子发育的合子期、在种子发育的前球形期、在种子发育的球形期、在种子发育的过渡期、在种子发育的心形期、在种子发育的鱼雷期、在种子发育的线性子叶期、在种子发育的弯曲子叶期、或在种子发育的成熟绿色期。在另一个实施例中，在至少四个选自以下的时期中对来自转基因和非转基因植物的种子或发育种子中的糖水平进行测量：在种子发育的合子期、在种子发育的前球形期、在种子发育的球形期、在种子发育的过渡期、在种子发育的心形期、在种子发育的鱼雷期、在种子发育的线性子叶期、在种子发育的弯曲子叶期、或在种子发育的成熟绿色期。在另一个实施例中，在至少五个选自以下的时期中对来自转基因和非转基因植物的种子或发育种子中的糖水平进行测量：在种子发育的合子期、在种子发育的前球形期、在种子发育的球形期、在种子发育的过渡期、在种子发育的心形期、在种子发育的鱼雷期、在种子发育的线性子叶期、在种子发育的弯曲子叶期、或在种子发育的成熟绿色期。在另一个实施例中，在至少六个选自以下的时期中对来自转基因和非转基因植物的种子或发育种子中的糖水平进行测量：在种子发育的合子期、在种子发育的前球形期、在种子发育的球形期、在种子发育的过渡期、在种子发育的心形期、在种子发育的鱼雷期、在种子发育的线性子叶期、在种子发育的弯曲子叶期、或在种子发育的成熟绿色期。在另一个实施例中，在至少七个选自以下的时期中对来自转基因和非转基因植物的种子或发育种子中的糖水平进行测量：在种子发育的合子期、在种子发育的前球形期、在种子发育的球形期、在种子发育的过渡期、在种子发育的心形期、在种子发育的鱼雷期、在种子发育的线性子叶期、在种子发育的弯曲子叶期、或在种子发育的成熟绿色期。在另一个实施例中，在至少八个选自以下的时期中对来自转基因和非转基因植物的种子或发育种子中的糖水平进行测量：在种子发育的合子期、在种子发育的前球形期、在种子发育的球形期、在种子发育的过渡期、在种子发育的心形期、在种子发育的鱼雷期、在种子发育的线性子叶期、在种子发育的弯曲子叶期、或在种子发育的成熟绿色期。在另一个实施例中，在种子发育的合子期、在种子发育的前球形期、在种子发育的球形期、在种子发育的过渡期、在种子发育的心形期、在种子发育的鱼雷期、在种子发育的线性子叶期、在种子发育的弯曲子叶期、或在种子发育的成熟绿色期，对来自转基因和非转基因植物的种子或发育种子中的糖水平进行测量。如在此所理解，相比于来自非转基因植物的种子中的糖水平，如果这些种子发育阶段中的至少一个中的水平较高，来自转基因植物的种子中的糖水平则被认为是“增加的”。

如在此使用的，使一种转基因植物细胞或一种转基因植物经受促进至少一种SWEET转运体表达的条件应理解为是指该植物或这些植物细胞生长在允许该外源核酸表达的条件下。在许多情况下，这类使一种植物或植物细胞经受允许至少一种SWEET转运体蛋白表达的条件的方法包括正常生长(温室、田地等)条件。此类情况包括用于驱动编码该SWEET转运体蛋白的核酸表达的启动子不是诱导型启动子(例如，组成型或组织特异性启动子)的情况。在其他实施例中，这些使植物或植物细胞经受允许至少一种SWEET转运体蛋白表达的条件的方法包括向该转基因植物或这些植物细胞提供刺激物以诱导该启动子的表达，该启动子可操作地连接至编码至少一种SWEET转运体蛋白的核酸。本领域的普通技术人员将能够容易地识别对诱导所选诱导型启动子以驱动核酸表达所必需的条件或刺激物。

可以分离编码至少一种SWEET转运体的核酸。如在此使用，术语分离的是指将分子与存在于大分子的天然来源中的其他细胞/组织成分(例如DNA或RNA)分离。术语分离的还可以指当通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料、病毒材料和培养基，或者当用化学方法合成时基本上不含化学前体或其他化学品的核酸或肽。此外，分离的核酸可以包括不以片段天然地存在并且不会以天然状态被发现的核酸片段。

有待插入植物细胞中的核酸可以作为表达载体的一部分。表达载体是可以通过限制和连接将希望的核酸序列插入其中，这样使得它被可操作地结合或可操作地连接至调节序列上并且可以被表达为RNA转录物的载体。表达是指内源基因、转基因或编码区在细胞中的转录和/或翻译。

当将编码序列和调节序列以将编码序列的表达或转录置于调节序列的影响或控制之下的这样一种方式共价连接时，它们被可操作地连接。如果希望将编码序列翻译成功能蛋白，据说如果5’调节序列中的启动子的诱导导致编码序列的转录并且如果两个DNA序列之间的键连的性质不会(1)导致引入移码突变，(2)干扰启动子区指导编码序列的转录的能力或(3)干扰对应的RNA转录物被翻译成蛋白质的能力，则两个DNA序列可以被可操作地连接。因此，如果启动子区能够影响DNA序列的转录，这样使得所得转录物可以被翻译成希望的蛋白质或多肽，则该启动子区将被可操作地连接至该编码序列上。

载体可以进一步包含一个或多个启动子序列。启动子可以包括通常位于编码区的上游的非翻译核酸序列，它包含用于启动核酸的转录的位点。启动子区还可以包括充当基因表达的调节物的其他元件。在本发明的另外的实施例中，表达载体包含有助于选择已经整合表达载体的细胞的另外的区域。启动子序列通常在其3'末端由转录起始位点界定(包括端点)并且向上游(5'方向)延伸以包括启动在背景之上可检测水平的转录所必需的最低数目的碱基或元件。在启动子序列内将会发现转录起始位点以及负责结合RNA聚合酶的蛋白质结合结构域。真核启动子将通常但不总是包含“TATA”盒和“CAT”盒。启动子还任选地包括远端增强子或抑制子元件，这些元件可以位于离转录起始位点多达几千个碱基对远的地方。

启动子的激活对于某些细胞或组织而言可以是特异性的，例如通过仅表达于某些组织中的转录因子，或者启动子可以是遍在的并且能够表达于大多数细胞或组织中。

组成型启动子是在大多数环境和发育条件下有活性的启动子。诱导型启动子是在某些或特殊环境或发育调节下有活性的启动子。可以使用任何诱导型启动子，参见例如，瓦尔德(Ward)等人植物分子生物学(PlantMol.Biol.)22:361-366，1993。示例性诱导型启动子包括但不限于以下各项：来自ACEI系统(响应于铜)的启动子(麦福特(Meft)等人美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90:4567-4571，1993)，来自玉蜀黍的In2基因(响应于苯磺酰胺除草剂安全剂)(赫尔歇(Hershey)等人分子遗传学与普通遗传学(Mol.Gen.Genetics)227:229-237，1991，和加茨(Gatz)等人分子遗传学与普通遗传学(Mol.Gen.Genetics)243:32-38，1994)或来自Tn10的Tet抑制子(加茨(Gatz)等人分子遗传学与普通遗传学(Mol.Gen.Genetics)227:229-237，1991)。诱导型启动子可以响应于对宿主细胞而言异源的试剂，参见例如，斯凯纳(Schena)等人美国科学院院刊(PNAS)88:10421-10425，1991。其他启动子包括但不限于在淀粉胚乳组织中有活性的waxy1(“wx1”)启动子，BETL1启动子，Esr6a和6b启动子以及Miniature1(Mn1)启动子。

可以将编码至少一种SWEET转运体的插入的外源核酸表达于细胞中的任何位置，包括细胞质、细胞表面或亚细胞器(例如细胞核、囊泡、ER、液泡等)。用于将蛋白质的表达靶向至不同细胞区室的方法和载体组分在本领域是熟知的，其中选择取决于表达转运体的具体细胞或生物体。参见例如，奥本(Okumoto)等人美国科学院院刊(PNAS)102:8740-8745，2005，费尔(Fehr)等人荧光杂志(J.Fluoresc.)14:603-609，2005。可以借助将编码信号序列的核苷酸序列可操作地连接至编码转运体的基因的5’和/或3’区上而将蛋白质转运到亚细胞区室(例如叶绿体、液泡、过氧化物酶体、乙醛酸循环体、细胞壁或线粒体)中或用于分泌进质外体中。可以在编码的蛋白质被最终区室化的蛋白质合成和加工过程中确定结构基因的5'和/或3'端处的靶向序列。

信号序列的存在将多肽指向细胞内的细胞器或亚细胞区室或用于分泌至质外体。术语靶向信号序列是指以下氨基酸序列，其在表达的蛋白质中的存在或其被附加至表达的蛋白质上将它靶向特定的亚细胞定位。例如，对应的靶向信号可以使得例如从细菌宿主中分泌表达的SWEET转运体，以便简化其纯化。在一个实施例中，转运体的靶向可以用于影响至少一种糖在具体亚细胞区室或细胞外区室中的浓度。可用于不同生物体群组的适当的靶向信号序列是本领域的普通技术人员已知的并且可以从文献或序列数据库中检索到。

如果希望靶向于植物细胞的质体，则可以使用靶向信号肽。靶向信号肽的实例包括但不限于以下各项：拟南芥质体RNA聚合酶(AtRpoT3)的氨基酸残基1至124(植物杂志(PlantJournal)17:557-561，1999)；菠菜的质体铁氧还蛋白：NADP+氧化还原酶(FNR)的靶向信号肽(詹森(Jansen)等人当代遗传学(CurrentGenetics)13:517-522，1988)；由本文披露的cDNA序列的核苷酸-171至165编码的氨基酸序列；包括或不含成熟蜡质蛋白(waxyprotein)的前34个氨基酸残基的玉蜀黍的蜡质蛋白的转运肽(克洛斯根(Klosgen)等人分子遗传学与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)217:155-161，1989)；二磷酸核酮糖羧化酶小亚基的信号肽(沃尔特(Wolter)等人美国科学院院刊(PNAS)85:846-850，1988；纳乌拉斯(Nawrath)等人美国科学院院刊(PNAS)91:12760-12764，1994)；NADP苹果酸脱氢酶的信号肽(加拉多(Gallardo)等人植物学(Planta)197:324-332，1995)；谷胱苷肽还原酶的信号肽(克雷森(Creissen)等人植物杂志(PlantJ.)8:167-175，1995)或R1蛋白的信号肽(洛伯斯(Lorberth)等人自然生物技术(NatureBiotechnology)16:473-477，1998)。

可以通过使用靶向信号肽(例如但不限于拟南芥线粒体RNA聚合酶(AtRpoT1)的氨基酸残基1至131(植物杂志(PlantJournal)17:557-561，1999)或由布劳恩(Braun)(欧洲分子生物学学会杂志(EMBOJ.)11:3219-3227，1992)描述的转运肽)实现靶向于植物细胞的线粒体。

可以通过使用靶向信号肽(例如但不限于马铃薯贮藏蛋白的N-末端序列(146个氨基酸)(松内瓦尔德(Sonnewald)等人植物杂志(PlantJ.)1:95-106，1991)，由松冈(Matsuoka)和诺伊豪斯(Neuhaus)(实验植物学杂志(JournalofExp.Botany)50:165-174，1999)、克里斯皮尔(Chrispeels)和赖克赫尔(Raikhel)(细胞(Cell)68:613-616，1992)、松冈(Matsuoka)和中村(Nakamura)(美国科学院院刊(PNAS)88:834-838，1991)、贝德纳雷克(Bednarek)和赖克赫尔(Raikhel)(植物细胞(PlantCell)3:1195-1206，1991)和/或中村(Nakamura)和松冈(Matsuoka)(植物生理学(PlantPhys.)101:1-5，1993)描述的信号序列)实现靶向于植物细胞中的液泡。

可以通过使用例如与C-末端延伸HDEL相关联的ER靶向肽HKTMLPLPLIPSLLLSLSSAEF(霍索夫(Haselhoff)，美国科学院院刊(PNAS)94:2122-2127，1997)实现靶向于植物细胞中的ER。可以通过使用例如烟草C2多肽QPSLKRMKIQPSSQP(SEQIDNO：411)的核定位信号(NLS)实现靶向于植物细胞中的细胞核。

可以通过使用转运肽(例如但不限于以下各项的信号序列：蛋白酶抑制剂II-基因(凯尔(Keil)等人核酸研究(NucleicAcidRes.)14:5641-5650，1986，冯斯查文(vonSchaewen)等人欧洲分子生物学学会杂志(EMBOJ.)9:30-33，1990)；来自解淀粉欧文氏菌(Erwiniaamylovora)的果聚糖蔗糖酶基因(盖尔(Geier)和盖德尔(Geider)，生理学与分子植物病理学(Phys.Mol.PlantPathol.)42:387-404，1993)；来自马铃薯的编码前33个氨基酸的马铃薯贮藏蛋白基因B33的片段(罗莎赫尔(Rosahl)等人分子遗传学与普通遗传学(MolGen.Genet.)203:214-220，1986)或由大岛(Oshima)等人(核酸研究(NucleicAcidsRes.)18:181，1990)描述的信号序列)实现靶向于细胞外间隙。

可以通过融合至不同的转运体，优选融合至蔗糖转运体SUT1(里斯迈耶(Riesmeier)，欧洲分子生物学学会杂志(EMBOJ.)11:4705-4713，1992)而实现另外靶向于植物细胞的质膜。可以通过融合至以下各项而实现靶向于不同的胞内膜：存在于特定区室(例如液泡水通道)中的膜蛋白(γTIP)(卡尔松(Karlsson)，植物杂志(PlantJ.)21:83-90，2000)；线粒体中的MCF蛋白(库安(Kuan)，生物化学与分子生物学评论性综述(Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.)28:209-233，1993)；质体的内包膜中的磷酸丙糖转运体(傅吉(Flugge)，欧洲分子生物学学会杂志(EMBOJ.)8:39-46，1989)以及类囊体中的光合系统。

使用C-末端识别序列K(X)KXX(其中“X”是任何氨基酸)(加拉贝特(Garabet)，酶学方法(MethodsEnzymol.)332:77-87，2001)实现靶向于高尔基体。使用过氧化物酶体靶向序列PTSI或PTSII(加拉贝特(Garabet)，酶学方法(MethodsEnzymol.)332:77-87，2001)来进行靶向于过氧化物酶体。

种子填充中牵涉的SWEET

尽管在胚中尚未发现牵涉SWEET，但是已经显示其他糖转运体(例如液泡膜单糖转运体(TMT1))在组成型花椰菜花叶病毒35S启动子的控制之下的过表达增加了拟南芥属种子的生物质。参见温根特那，K.(Wingenter，K.)等人，植物生理学(PlantPhysiol.)，154(2):665-677(2010年10月)，将其通过引用而结合。具体而言，温根特那(Wingenter)等人显示，增加的TMT1转运体表达增加了拟南芥属种子中的脂质和蛋白质含量。确切地，过表达TMT1的拟南芥属在土壤中以及在含高葡萄糖(Glc)的液体培养基中比野生型植物长得快。土壤中生长的TMT1过表达突变体产生更大的种子和更大的总种子产量，这与增加的脂质和蛋白质含量相关。种子特性的这些变化与略微下降的夜间CO₂释放和来自离脱叶源的增加的糖输出率有关。因此，拟南芥属中的TMT活性增加诱导修饰的亚细胞糖区室化、改变的细胞糖感测、受影响的同化物分配、拟南芥属种子的增加的生物质以及加速的早期植物发育。

在其他背景下，罗西，G.(Rossi，G.)等人(微生物细胞工厂(MicrobialCellFactories)，9:15(2010年3月)(doi:10.1186/1475-2859-9-15))也报道了被工程化为过表达己糖转运体HXT1或HXT7的酵母细胞使得细胞中的葡萄糖摄取增加。在再其他背景下，王(Wang)等人(2008)报道了在早期谷粒填充过程中碳分配需要编码细胞壁转化酶的稻GIF1(谷粒不完全填充1)基因。用35S或稻蜡质(Waxy)启动子异位表达栽培的GIF1基因导致谷粒较小，而通过其天然启动子驱动而过表达GIF1增加了谷粒产生。这些发现连同通过比较栽培稻与野生稻之间的GIF1基因座的核苷酸多样性而鉴定的驯化特征强烈表明GIF1是一种潜在的驯化基因并且这样的一种驯化选择的基因可以用于进一步改善作物。

发育种子中的细胞特异性表达的分析与若干SWEET在将糖输入发育种子中的作用一致。公共数据库的分析以及现有出版物指示在种子成熟过程中拟南芥属SWEET1、4、5、7和8(分支I和II己糖转运体)被表达于种子中：SWEET1和7被表达于种皮中，SWEET8被表达于胚乳中并且SWEET5被表达于胚中。参见陈(Chen)，L.Q.，等人，自然(Nature)，468:527-532(2010)，将其通过引用结合。此外，在成熟过程中SWEET10、11、12和15(分支III蔗糖转运体)被表达于种子中，确切地SWEET11、12和15被表达于种皮中，SWEET10被表达于合点端种皮中并且SWEET11和15被表达于胚乳中。参见陈，L.Q.(Chen，L.Q.)等人，科学(Science)，335:207-211(2012年1月)。

在此提供的分析证实SWEET11、12和15的GFP-融合体被表达于种皮中(图5A)。此外，sweet11，sweet12，sweet15三突变体显示出发育迟缓和淀粉含量减少(图5B，C)。SUT/SUC质子蔗糖共转运体家族的成员也被表达于种皮中。确切地，在种子成熟过程中表达SUC2、3、4和5，其中确切地在‘成熟绿色期’过程中表达SUC2，并且在线性子叶期过程中表达SUC5。

与SWEET牵涉在拟南芥属的种子填充中的这些初步数据一致，22种SWEET中的12种被高表达于玉蜀黍籽粒中(参见bar.utoronto.ca/efp_maize/cgi-bin/efpWeb.cgi的玉蜀黍eFP和qteller.com的QTELLER)。四种分支I/II己糖转运体SWEET被高表达于种子中。确切地，SWEET4b和SWEET4d被发现于胚和胚乳两者中，并且SWEET4a和SWEET2贯穿整个种子被表达。此外，8种蔗糖转运分支IIISWEET也在种子成熟过程中被表达。确切地，SWEET11、SWEET13b、SWEET13c和SWEET15b贯穿整个种子被表达，SWEET14a、SWEET14b、SWEET15a和SWEET15b被主要表达于胚乳中。具体而言，BETL中的三种己糖转运体4a、b和d(图7)在胚乳填充中似乎发挥关键作用。类似地，获得自UniformMu来源的ZmSWEET4d中的插入显示出突出的EMP(空果皮)籽粒表型(图8A，B)。

在W22背景中，颖果塌陷，胚乳被大大减少并且胚尺寸看起来更小。这种较小的表型让人想起文献中记录的mn1表型。鉴于ZmSWEET4d在BETL中的高表达，这种较小的表型的可能原因是糖摄取进入BETL中被阻断，从而影响下游的籽粒填充。当前模型牵涉了最低数目的转运步骤，然而，在拟南芥属和玉蜀黍种子两者中鉴定了多种SWEET和SUT旁系同源物，指示种子填充的复杂度更大以及另外的转运步骤的可能性。

使光谱数据的提取、策展和约简自动化已经大大加速了¹³C-标记数据的分析。可以使用来自单一籽粒的胚乳组织的单一¹³C-标记样品分析在来自同代的非转基因玉蜀黍系的四个单独的同胞植物之间区分。使这些植物和培养的籽粒一起生长并且种子重量和组成(淀粉、蛋白、油或细胞壁含量以及主要的可溶性代谢物水平)在来自每个植物的种子之间并不是显著不同的。通过¹³C-标记图谱揭示的小代谢通量差异是由于非转基因遗传背景的分离。已经注意到具有相同生长和组成的4个转基因系之间的通量曲线的差异。使用稳态通量图的计算机模拟也能够预测在核心代谢中伴有适度变化的标记图谱。TCA循环通量变化10％导致总碳分配变化约1％并且与独特的标记表型相关，它可以与野生型和其他改变的代谢通量图谱区别开来，它们各自产生其自身的标记特征或指纹图谱。

花蜜产生中牵涉的SWEET

植物具有进化的解剖学和生理学特征来吸引动物以促进授粉。作为一种物种形成机制的生殖隔离被认为相对于花粉的风转移在动物授粉的物种中是增强的。花性状(包括动物授粉、花蜜距、两侧对称和雌雄异株性系统)可以改变进化枝内的随后的物种丰度。当加斯东·德沙巴达(GastondeSaporta)、约瑟夫·胡克(JosephHooker)、奥斯瓦尔德·希尔(OswaldHeer)和查尔斯·达尔文(CharlesDarwin)讨论‘恼人之谜’-白垩纪中期的被子植物和昆虫的显而易见的快速辐射(theapparentrapidradiationofangiospermsandinsectsinthemid-Cretaceous)时，德沙巴达(deSaporta)提出通过授粉者与开花植物的共同进化而发展并完善昆虫协助的授粉对于授粉者和被子植物多样化而言可能是关键的。然而，花蜜分泌的分子机制仍难以捉摸。

开花植物已经进化出了复杂方法来保证有效地与授粉者相互作用，并且由此通过异花授粉而成功地繁殖并具有遗传多样性。这个过程的核心是花蜜，它包含高量的糖和吸引并回报授粉者的挥发性化合物以及击退不想要的访花者和迫使授粉者屈服的毒素以优化异交率。花蜜组成在物种之间在数量和质量上差别很大，推测是因为它被产生用于回报不同的动物家族。取决于物种，8％至80％(w/w)的花蜜包含糖，其中最普遍的是蔗糖、葡萄糖和果糖。花蜜与韧皮汁液在组成上不同，韧皮汁液将糖输送到蜜腺并且以二糖蔗糖和三糖棉子糖为主。被子植物花蜜通过称为蜜腺的专门器官合成和分泌。植物投入显著量的能量用于形成花、产生蜜腺和分泌含糖花蜜。例如，野生烟草(Nicotianaattenuata)(一种可自交的天蛾授粉和蜂鸟授粉的菊类植物)产生包含蔗糖、己糖和许多次级代谢产物(包括尼古丁)的花蜜。芜菁(包含可自交和不可自交品种)产生己糖占优势的糖。拟南芥(一种自交亲和的自交者(self-fertilizer))也产生功能性蜜腺，这些功能性蜜腺产生挥发物并分泌富含己糖的花蜜。自交植物中的花蜜产生是否代表进化残迹或是否可以起作用来保证较低的异交率仍不清楚。因此，理解花蜜分泌的系统发生和生物化学可以有助于阐明这些潜藏于被子植物的多样性之下的过程。

尽管花蜜具有重要意义，但是其分泌过程仍然是见仁见智的问题，因为关于转运机制几乎没有功能数据。为了鉴定负责花蜜分泌的转运体，在候选糖转运体数据库中搜索那些特异性地表达于蜜腺中具有与细胞糖流出相容的特征的转运体。最近鉴定的SWEET糖转运体家族的成员作为花蜜分泌中的作用的最好候选物而出现。已知SWEET11和12蔗糖转运体负责对于韧皮部装载而言关键的细胞流出，并且因此负责将蔗糖从光合组织移位到异养组织(例如根、花和种子)。先前研究已经描述了一种特异性地表达于蜜腺中的矮牵牛中的SWEET9同系物PhNEC1，并且PhNEC1表达的发育时间先前已与花蜜淀粉含量呈负相关，使得这种转运体成为在花蜜分泌中具有一定作用的最好候选物。SWEET9(NEC1近亲)被高表达于拟南芥属蜜腺中。

先前研究已经鉴定出一个作为新颖类别的蔗糖流出转运体的SWEET亚家族，这些转运体负责将蔗糖从韧皮部薄壁组织(装载蔗糖的第一步)移动进韧皮部的维管中。微阵列和RT-PCR分析显示与SWEET11和12享有约50％序列一致性的SWEET9被特异性地表达于拟南芥属蜜腺中。SWEET9是仅有的被高表达于蜜腺中的SWEET，因此可以想到SWEET9介导蔗糖或己糖转运以用于花蜜产生。转运研究显示SWEET9介导蔗糖的摄取和流出，如在非洲爪蟾卵母细胞中所测定的。通过在人胚肾细胞中共表达SWEET9与荧光共振能量转移(FRET)蔗糖传感蛋白进一步确认了SWEET9的蔗糖转运活性。这些结果一起显示SWEET9可以介导蔗糖的摄取和流出两者，与蔗糖单向传递体的促进扩散机制一致。已经显示一些SWEET同系物转运蔗糖和葡萄糖两者，并且尽管诸位发明人尚不能获得排除SWEET9还转运己糖的可能性的确凿数据，但SWEET9还可以在己糖流出中起作用。

为了直接确定在从蜜腺分泌糖中是否牵涉SWEET9，在三个独立的T-DNA插入突变系中检查花蜜分泌：[atsweet9-1，sk225(在起始密码子之前在位置-308中携带T-DNA插入并且具有不可检测的转录物水平)；atsweet9-2，SALK_060256(在起始密码子之前在位置-940中携带T-DNA插入并且具有降低的转录物水平)；atsweet9-3，SALK_202913C(在外显子4中起始密码子之后的位置779中或在cDNA中远离起始密码子的位置+345中携带T-DNA插入，敲除系)。如果SWEET9在将糖摄取进蜜腺中或从蜜腺流出中发挥一定作用，则可以在突变体中预期特定表型(例如但不限于糖含量降低)，或者，如果糖流出产生用于花蜜分泌的渗透驱动力，则是流体分泌损失。在拟南芥属中，在由围绕野生型花的侧向蜜腺的萼片形成的萼杯中积累花蜜滴。sweet9突变体都不产生可检测的花蜜滴(图1c-1e)。另外，不能将这些突变体与野生型区别开来。如通过扫描电子显微术(SEM)所判断的，突变体蜜腺具有与野生型蜜腺类似的形态学，指示花蜜分泌的损失并非由蜜腺的物理缺陷引起而是由糖流出活性的损失引起。

为了测试SWEET9活性是否限制花蜜分泌，在野生型背景中在处于其天然启动子的控制之下表达SWEET9-GFP融合体的转基因系中分析花蜜分泌。SWEET9在野生型背景中的额外拷贝显示出增加的花蜜体积，如通过滴尺寸量化所判断的(图1f)。在sweet9突变体中通过SWEET9或SWEET9-GFP重建花蜜分泌进一步支持SWEET9在花蜜分泌中的作用(图1g和1h)。

不被理论所束缚，可能的是SWEET9可以在至少三种方式的至少一种中起作用，取决于其定位。首先，SWEET9可以在靠近蜜腺的韧皮束处促进蔗糖流出，它可以促进糖摄取进入蜜腺薄壁组织中，和/或它可以促进糖从蜜腺薄壁组织流出，从而将糖输送至花蜜质外体。处于SWEET9启动子的控制之下的具有GUS和eGFP的翻译融合体特异性地表达于花蜜腺中(图2)。在蜜腺薄壁组织的下半部分中观察到最高表达，但是在保卫细胞和韧皮部中没有观察到(图2c-d)。SWEET9-eGFP的荧光强度在成熟过程中增加，并且当开花时和当出现最高花蜜分泌时是最高的。与来自蜜腺细胞的细胞流出(在蜜腺中积累，由于无法输出糖)相比，如果SWEET9被牵涉于摄取进入蜜腺薄壁组织中(在蜜腺中没有淀粉积累)，则淀粉在sweet9突变体的蜜腺中的淀粉积累模式可能不同。在野生型植物中，淀粉在开花之前积累在蜜腺薄壁组织细胞的叶绿体内并且在开花时被降解，从而作为糖分泌源。

为了评估sweet9-1中的淀粉积累，将淀粉在固定切片中用路戈尔碘溶液染色(图2f-2k)。在这些突变体中，淀粉积累在花薄壁组织的所有细胞中，指示SWEET9负责细胞糖流出。野生型植物的蜜腺保卫细胞在开花时包含淀粉颗粒，但是在sweet9突变体中不包含。淀粉在野生型蜜腺的保卫细胞中的积累可能是由花蜜的再吸收引起。一并考虑，将SWEET9功能性表征为蔗糖流出转运、在蜜腺薄壁组织中存在该蛋白以及淀粉在不能分泌花蜜的sweet9突变体中的积累模式证明SWEET9是一种负责糖的细胞输出的关键转运体。糖在蜜腺薄壁组织中的高胞质水平以及由细胞壁转化酶产生的蔗糖的细胞外水解因此将经由这种促进扩散载体而促进用于花蜜分泌的驱动力。的确，先前发现用于蔗糖生物合成的途径中的多种基因在成熟的分泌型蜜腺中是上调的。另外，拟南芥属花蜜的己糖:蔗糖比率为33:1。

由于SWEET11和12是质膜定位的蔗糖流出转运体，我们分析了SWEET9-启动子驱动的SWEET9-eGFP融合体的亚细胞定位。SWEET9-eGFP融合体既定位于质膜又定位于高尔基体样区室(图2e)。SWEET9因此可以通过胞吐作用而运行或指导质膜介导的流出。为了探索SWEET9的质膜定位对分泌的任何作用，测试质膜定位的旁系同源物SWEET11和12在stweet9突变体中恢复花蜜分泌的能力。当在SWEET9启动子的控制之下进行表达时，两种质膜转运体都能恢复花蜜分泌。这些数据一起指示sweet9突变体的花蜜分泌能力受损主要是由于跨质膜的糖转运减少。然而，SWEET9还可以在囊泡分泌中发挥一定作用。除了质膜定位之外，SWEET9-eGFP蛋白还积累在流动性很强的粒子中，这些粒子可以是高尔基体或反式高尔基体网路胞器的组分(图2e)。高尔基体和高尔基体样区室中的积累的蛋白显现为充当储备物。因此，可能的是SWEET9在囊泡分泌之前还将糖输入高尔基体中。

来自拟南芥属蜜腺中的基因表达的先前研究的生物信息学分析表明在蔗糖生物合成中牵涉的基因在蜜腺中是上调的，从而指示由淀粉再合成蔗糖经由SWEET9驱动糖流出。先前的数据表明两种蔗糖磷酸合酶(SPS)基因(两者均编码用于蔗糖生物合成的关键酶)在成熟中的蜜腺中被诱导至高水平。的确，SPS1F和SPS2F基因被高表达于蜜腺中。两种SPS基因的表达的人工微RNA抑制使得花蜜分泌受到损失并且淀粉积累被改变，这模拟了sweet9突变体的表型(图3)。sweet9突变体和SPS-miRNA系的表型还类似于先前已经公开的蜜腺细胞壁转化酶突变体cwinv4-1的表型。这些数据一起证明在蜜腺中合成的淀粉衍生的蔗糖通过SWEET9输出，并且通过CWINV4水解蔗糖为产生足以维持水分泌的渗透梯度所必需(图3e)。

为了探索SWEET9是否也是糖从其他十字花科的蜜腺中流出所需的，在芜菁花(芜菁)中鉴定SWEET9的直向同源物。图1a和1b显示BrSWEET9也转运蔗糖。BrSWEET9先前已经被鉴定为蜜腺表达的基因。然而，BrSWEET9也是糖流出和花蜜分泌所需的(图1a-b和4a-c)。芜菁在蔷薇类分支内与拟南芥属属于相同的目，并且可以将品种归类为自交不亲和的异交者(outcrosser)或归类为自交亲和的自交者。来自蔷薇类拟南芥和芜菁的花蜜主要由己糖组成，这与细胞壁转化酶在分泌后蔗糖水解中的作用一致。

为了测试菊类是否也使用SWEET9直向同源物用于花蜜分泌，在野生烟草中鉴定SWEET9。NaSWEET9被最高表达于蜜腺中，并且发现表达在蜜腺成熟过程中增加(图4d)。当表达于卵母细胞中时，SWEET9在野生烟草中介导蔗糖摄取和流出(图4f-g)。类似于十字花科中的SWEET9，野生烟草中的SWEET9也是花蜜分泌所需的，如在两个独立的RNAi系中所显示的(图4e)。总之，因此SWEET9还在蜜腺薄壁组织的质膜处作为糖流出转运体并且为核心真双子叶植物中的花蜜分泌所必需。

系统发生分析试验性地将SWEET9的起源追踪至真双子叶植物的分离之前的点(菊类和蔷薇类；图4h)，约120mya。分析的所有基因组(包括草、卷柏属和小立碗藓属(Physcomitrella))都包含多种SWEET旁系同源物。SWEET9的进化可能发生在当核心真双子叶植物进化的时候。花蜜腺的存在也与SWEET9的存在相关。风授粉的稻和玉蜀黍(单子叶植物)、祖先被子植物(例如无油樟属(Amborella))和基本真双子叶植物(例如耧斗菜属(Aquilegia))未显现具有SWEET9直向同源物。可能的是，在一个种群内，将SWEET分支III的成员区别为SWEET9的植物在从附近的筛分管子劫取韧皮汁液以产生分泌方面具有选择性优势，该分泌将吸引授粉者并且因此实现最大的繁殖率和远交率。

花蜜分泌机制的模型示于图3e中。可以将淀粉在突变体的花柄中的积累看做以下指示，即韧皮部来源的蔗糖经由共质体(symplasmically)被输入蜜腺中。然后蔗糖被水解并以己糖的形式或以淀粉的形式存储在液泡中。在蜜腺成熟过程中，经由蔗糖磷酸合酶再合成蔗糖，并且SWEET9开始将蔗糖沿向下的浓度梯度输出，从而使得蔗糖在质外体中积累。由于SWEET9显现作为单向传递体起作用，并且由于胞质包含影响渗透势的其他溶质，单向传递体驱动的流出不大可能完全足以用于渗透驱动的水分泌。因此，然后质外体中的蔗糖被细胞壁转化酶水解而产生葡萄糖和果糖，从而潜在地使渗透驱动力加倍并且允许分泌水。最终，高浓度的含糖花蜜通过开放气孔被分泌。总之，在此呈现的结果显示SWEET9在蜜腺薄壁组织的质膜处充当糖流出转运体并且为核心真双子叶植物中的花蜜分泌所必需。

微阵列数据显示若干质子偶联的糖转运体(包括己糖转运STP)也表达于蜜腺中(与SWEET9相比，表达相对较低)，指示这些质子偶联的糖转运体可以发挥选择性再摄取活性。细胞壁转化酶的相对活性结合选择性再摄取活性可以确定蔗糖、果糖和葡萄糖的最终比率(图3e)。

淀粉在花基部积累于突变体茎中的观察现象不仅强调在花蜜产生中牵涉显著的能量投入，并且还强调缺乏对蔗糖输送或移位至花的其他部分的反馈调节，即使在自花授粉植物(例如拟南芥属)中。大体上自花授粉的拟南芥属保留了花蜜产生并且产生挥发物并分泌含糖花蜜以吸引和回报潜在的授粉者，表明了即使以较低的比率保护异交子代的重要性。这种异交在共同进化中发挥一定作用并且限制近交衰退。然而，对于没有近交衰退的高度自花授粉的物种而言，sweet9或cwinv4的花茎中的花蜜糖积累和糖积累可以吸引病原体并为减少的花蜜产生提供强有力选择。

在此，已经通过以下方式显示了SWEET9在花蜜分泌中的关键作用：确认其在蜜腺中的表达，证明了其蔗糖转运作用，并且显示出既定位于质膜又定位于具有类似于高尔基体的特征的细胞内区室处。SWEET9或蜜腺表达的蔗糖磷酸合酶基因的突变使得完全失去花蜜分泌。出人意料地，输送至缺陷蜜腺中的糖在花基部积累在茎中，指示对韧皮部输送缺乏负反馈并且不能有效地重新定位蔗糖。通过阻断SWEET9在拟南芥、芜菁和野生烟草中的表达，SWEET9在花蜜分泌中的功能在蔷薇类和菊类(核心真双子叶植物物种的两个主要分枝)中是保守的。

在此提供的实例意在说明本发明的所选实施例的目的，并不旨在以任何方式限制本发明的范围。

实例

实例1-用于检测在花蜜产生中牵涉的SWEET9的方法

如本领域中已经确立的，在HEK293T细胞和非洲爪蟾卵母细胞中异源表达来自三个物种的SWEET9。通过PCR和qPCR验证插入位点和降低的转录物水平。BrSWEET9TILLING突变体经由筛选先前描述的突变体群体而获得自RevGenUK(英国诺威奇的约翰英纳斯中心(JohnInnesCentre)；revgenuk.jic.ac.uk/)。通过根瘤农杆菌(菌株LBA4404)转化野生型野生烟草系以沉默野生烟草sweet9(nasweet9)。经由靶向于两个基因的mRNA的单一amiRNA共沉默SPS1F和SPS2F，并且使用复式显微镜(LeicaMZ6)通过眼睛评价花蜜分泌，并通过摄像术进行记录。使用碘化钾对淀粉染色。通过碘-碘化钾(IKI)染色检查花(阶段14-15，在开花期)的淀粉积累(延森(Jensen)，1962)。遵循在胡尔曼(Ruhlmann)等人，2009中提及的方案进行测定，将该文献通过引用而结合。

实例2-糖转运体SWEET9的过表达使得花蜜分泌增加

拟南芥属SWEET9基因编码蜜腺特异性糖转运体。评价AtSWEET9过表达系(由其天然启动子驱动)与野生型的总花蜜葡萄糖含量比率和花蜜滴尺寸。评价每个系中的花蜜葡萄糖含量并且显示出相对于野生型花蜜较高的葡萄糖含量(高2.04-2.66倍)。在相同的过表达系中，还评价了花蜜滴的体积，显示出与野生型滴相比平均大31％的花蜜体积。

实例3-

为了研究种子BETL内的SWEET4d糖转运活性是否可以是糖在玉蜀黍胚乳中积累的限制因素，产生转基因A188植物以表达(i)处于稻肌动蛋白启动子的控制之下的基因GRMZM2G137954_T01的全长cDNA(SWEET4d)以及(ii)使用ATG的上游的5’UTR的天然2kb作为启动子的基因GRMZM2G137954_T01的全长gDNA(SWEET4d)两者。

用于产生包含来自上文的构建体(i)(使用cDNA的SWEET4d过表达子)的植物的质粒包含载体pSB11的骨架(石田(Ishida)等人，1996)、靠近右边界的Basta抗性盒(稻肌动蛋白启动子和内含子、Bar基因和Nos终止子)以及与荧光蛋白GFP融合的处于靠近左边界的稻肌动蛋白启动子的控制之下的SWEET4d编码序列(缺少终止密码子)。用于产生包含上文的构建体(ii)(使用基因组DNA的SWEET4d过表达子)的植物的质粒包含载体pSB11的骨架(石田(Ishida)等人，1996)、靠近右边界的Basta抗性盒(稻肌动蛋白启动子和内含子、Bar基因和Nos终止子)以及与荧光蛋白GFP融合处于靠近左边界的SWEET4d天然启动子(2kb)的控制之下的SWEET4d全长gDNA序列(缺少终止密码子)。

玉蜀黍近交系A188的农杆菌介导的转化是基于一种公开的方案(石田(Ishida)等人，2007)。对于每个转化事件，通过qRT-PCR评价T-DNA插入的数目，并且通过PCR验证转基因的完整性。

参考文献-全部通过引用而结合。

凯，K.M.(Kay，K.M.)等人,花性状与物种多样性(Floralcharactersandspeciesdiversification).(牛津大学出版社(OxfordUniversityPress)，2006)。

哈尔德，L.D.(Harder，L.D.)&巴雷特，S.C.H.(Barrett，S.C.H.),花的生态学与进化(Ecologyandevolutionofflowers).(牛津大学出版社(OxfordUniversityPress)，2006)。

多德，M.E.(Dodd，M.E.)，锡尔弗顿，J.(Silvertown，J.)&蔡斯，M.W.(Chase，M.W.),被子植物家庭之间的性状进化和物种多样性变化的系统发育分析(Phylogeneticanalysisoftraitevolutionandspeciesdiversityvariationamongangiospermfamilies).进化(Evolution)53，732-744(1999)。

埃尔布斯，J.C.(Heilbuth，J.C.),雌雄异株分支中的低级物种丰富性(Lowerspeciesrichnessindioeciousclades).美国博物学家(Am.Nat.)156，221-241(2000)。

萨金特，R.D.(Sargent，R.D.),花对称性影响被子植物的物种形成速率(Floralsymmetryaffectsspeciationratesinangiosperms).生物科学论文集(Proc.Biol.Sci.)271，603-608(2004)。

弗里德曼，W.E.(Friedman，W.E.),达尔文的“恼人之谜”的含义(ThemeaningofDarwin's'abominablemystery').美国植物学杂志(Am.J.Bot.)96，5-21(2009)。

德拉·巴雷拉，E.(DelaBarrera，E.)&诺贝尔，P.S.(Nobel，P.S.),花蜜：特性，花方面以及起源猜测(Nectar：properties，floralaspects，andspeculationsonorigin).植物科学发展趋势(TrendsPlantSci.)9，65-69(2004)。

凯斯勒，D.(Kessler，D.)，加泽，K.(Gase，K.)&鲍德温，I.T.(Baldwin，I.T.),用转化植物进行的田间试验揭示了花香的意义(Fieldexperimentswithtransformedplantsrevealthesenseoffloralscents).科学(Science)321，1200-1202(2008)。

凯斯勒，D.(Kessler，D.)等人,花蜜尼古丁的不可预测性在野生烟草中促进通过蜂鸟进行的异交(UnpredictabilityofnectarnicotinepromotesoutcrossingbyhummingbirdsinNicotianaattenuata).植物杂志(PlantJ.)71，529-538(2012)。

耐皮，M.(Nepi，M.)&帕齐尼，E.(Pacini，E.),蜜腺与花蜜(Nectariesandnectar).(斯普林格(Springer)，2007)。

德肯，R.(Deeken，R.)等人,AKT2/3钾通道的损失影响糖装载到拟南芥属的韧皮部中(LossoftheAKT2/3potassiumchannelaffectssugarloadingintothephloemofArabidopsis).植物学(Planta)216，334-344(2002)。

森那，K.R.(Sime，K.R.)&鲍德温，I.T.(Baldwin，I.T.),一种主要为自肥天然烟草的野生烟草(茄科)中的机会性异交(Opportunisticout-crossinginNicotianaattenuata(Solanaceae)，apredominantlyself-fertilizingnativetobacco).BMC生态学(BMCEcol.)3，6(2003)。

矶川，S.(Isokawa，S.)等人,分离自日本大宗种群的新颖的可自交芜菁系(Novelself-compatiblelinesofBrassicarapaL.isolatedfromtheJapanesebulk-populations).基因与遗传系统(GenesGenet.Syst.)85，87-96(2010)。

戴维斯，A.R.(Davis，A.R.)，比拉图伊克，J.D.(Pylatuik，J.D.)，帕拉迪斯，J.C.(Paradis，J.C.)&洛，N.H.(Low，N.H.),花蜜碳水化合物产生和组成相对于若干十字花科物种的蜜腺解剖学和单独的花朵内的定位而异(Nectar-carbohydrateproductionandcompositionvaryinrelationtonectaryanatomyandlocationwithinindividualflowersofseveralspeciesofBrassicaceae).植物学(Planta)205，305-318(1998)。

黄，M.(Huang，M.)等人,从拟南芥花发出的主要的挥发性有机化合物倍半萜烯(E)-β-石竹烯防御细菌性病原体(ThemajorvolatileorganiccompoundemittedfromArabidopsisthalianaflowers，thesesquiterpene(E)-β-caryophyllene，isadefenseagainstabacterialpathogen).新植物学家(NewPhytol.)193，997-1008(2012)。

克拉姆，B.W.(Kram，B.W.)&卡特，C.J.(Carter，C.J.),作为功能性蜜腺分析模型的拟南芥(Arabidopsisthalianaasamodelforfunctionalnectaryanalysis).有性植物繁殖(Sex.PlantReprod.)22，235-246(2009)。

霍夫曼，M.H.(Hoffmann，M.H.)等人,拟南芥的自然种群中的访花者(FlowervisitorsinanaturalpopulationofArabidopsisthaliana).植物生物学(PlantBiol.)5，491-494(2003)。

博姆布莱斯，K.(Bomblies，K.)等人,拟南芥的自然群丛中的遗传变异、异交和空间结构的局部尺度格局(Local-scalepatternsofgeneticvariability，outcrossing，andspatialstructureinnaturalstandsofArabidopsisthaliana).PLoS遗传学(PLoSGenet.)6，e1000890(2010)。

尼科尔森，S.W.(Nicolson，S.W.)，耐皮，M.(Nepi，M.)&帕齐尼，E.(Pacini，E.),蜜腺与花蜜(Nectariesandnectar).(斯普林格(Springer)，2007)。

陈，L.Q.(Chen，L.Q.)等人,用于病原体的细胞间交换与营养的糖转运体(Sugartransportersforintercellularexchangeandnutritionofpathogens).自然(Nature)468，527-532(2010)。

陈，L.Q.(Chen，L.Q.)等人,由SWEET蛋白介导的蔗糖流出作为韧皮部转运的关键步骤(SucroseeffluxmediatedbySWEETproteinsasakeystepforphloemtransport).科学(Science)335，207-211(2012)。

葛，Y.X.(Ge，Y.X.)等人,一种高表达于矮牵牛的蜜腺组织中的新颖基因NEC1(NEC1，anovelgene，highlyexpressedinnectarytissueofPetuniahybrida).植物杂志(PlantJ.)24，725-734(2000)。

克拉姆，B.W.(Kram，B.W.)，许，W.W.(Xu，W.W.)&卡特，C.J.(Carter，C.J.),揭露拟南芥蜜腺转录组：花产蜜组织中的差异基因表达的研究(UncoveringtheArabidopsisthaliananectarytranscriptome：investigationofdifferentialgeneexpressioninfloralnectariferoustissues).BMC植物生物学(BMCPlantBiol.)9，92(2009)。

任，G.(Ren，G.)等人,观赏性烟草花蜜腺中的瞬时淀粉代谢调控花蜜组成和释放(Transientstarchmetabolisminornamentaltobaccofloralnectariesregulatesnectarcompositionandrelease).植物科学(PlantSci.)173，277-290(2007)。

朗恩伯格，M.W.(Langenberger，M.W.)&戴维斯，A.R.(Davis，A.R.),与一年生葛缕子的雌雄异熟相关的花蜜产生、重吸收和组成的随时间的变化(Temporalchangesinfloralnectarproduction，reabsorption，andcompositionassociatedwithdichogamyinannualcaraway)(葛缕子(Carumcarvi)；伞形科).美国植物学杂志(Am.J.Bot.)89，1588-1598(2002)。

法恩，A.(Fahn，A.),分泌细胞的结构与功能(Structureandfunctionofsecretorycells).植物研究进展(Adv.Bot.Res.)31，37-75(2000)。

古铁雷斯，R.(Gutierrez，R.)，林德博姆，J.J.(Lindeboom，J.J.)，帕尔德兹，A.R.(Paredez，A.R.)，埃蒙斯，A.M.(Emons，A.M.)&埃尔哈特，D.W.(Ehrhardt，D.W.),拟南芥皮质微管将纤维素合酶输送定位至质膜并且与纤维素合酶交易区室相互作用(Arabidopsiscorticalmicrotubulespositioncellulosesynthasedeliverytotheplasmamembraneandinteractwithcellulosesynthasetraffickingcompartments).自然细胞生物学(NatureCellBiol.)11，797-806(2009)。

胡尔曼，J.M.(Ruhlmann，J.M.),克拉姆，B.W.(Kram，B.W.)&卡特，C.J.(Carter，C.J.),细胞壁转化酶为在拟南芥属中产生花蜜所需(CELLWALLINVERTASE4isrequiredfornectarproductioninArabidopsis).实验植物学杂志(J.Exp.Bot.)61，395-404(2010)。

汉普顿，M.(Hampton，M.)等人,通过表达序列标签分析鉴定芜菁蜜腺中的差异基因表达(IdentificationofdifferentialgeneexpressioninBrassicarapanectariesthroughexpressedsequencetaganalysis).PLoSONE5，e8782(2010)。

戴维斯，T.J.(Davies，T.J.)等人,达尔文的恼人之谜：来自被子植物的超级树的启示(Darwin'sabominablemystery：Insightsfromasupertreeoftheangiosperms).美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)101，1904-1909(2004)。

费耶，S.(Fior，S.)等人,通过快速进化的cpDNA区域的下一代测序时空重建耧斗菜快速辐射(SpatiotemporalreconstructionoftheAquilegiarapidradiationthroughnext-generationsequencingofrapidlyevolvingcpDNAregions).新植物学家(NewPhytol.)198，579-592(2013)。

惠特尔，J.B.(Whittall，J.B.)&霍奇斯，S.A.(Hodges，S.A.),授粉者移动在耧斗菜花中驱动越来越长的花蜜距(Pollinatorshiftsdriveincreasinglylongnectarspursincolumbineflowers).自然(Nature)447，706-709(2007)。

石田，Y(IshidaY)等人,农杆菌介导的玉蜀黍转化(Agrobacterium-mediatedtransformationofmaize).自然实验手册(NatureProtocols)2，1614-1621(2007)

石田，Y(IshidaY)等人,由根瘤农杆菌介导的玉蜀黍(玉米)的高效率转化(Highefficiencytransformationofmaize(ZeamaysL.)mediatedbyAgrobacteriumtumefaciens).自然生物技术(NatureBiotechnology)14，745-750(1996)。

王(Wang)等人,通过具有潜在的驯化特征的基因控制稻谷粒填充和产量(Controlofricegrain-fillingandyieldbyagenewithapotentialsignatureofdomestication).自然遗传学(NatGenet.)11月，40(11):1370-4.(2008)。

温根特那K.(WingenterK.)等人,液泡单糖转运体TMT1的活性增加改变拟南芥属中的细胞糖分区、糖信号转导以及种子产量(IncreasedactivityofthevacuolarmonosaccharidetransporterTMT1alterscellularsugarpartitioning，sugarsignaling，andseedyieldinArabidopsis).植物生理学(PlantPhysiol.)10月，154(2):665-77(2010)。

Claims (16)

1.一种增加植物的发育种子中的至少一种糖的水平的方法，该方法包括

a)在植物细胞中插入外源核酸以产生转基因植物细胞，其中该外源核酸包括编码至少一种糖转运体蛋白(SWEET蛋白)的多核苷酸序列，并且

b)使该转基因植物细胞经受促进在种子发育过程中表达该至少一种SWEET蛋白的条件，

其中与生长在与这些转基因植物相同的条件下的相同物种的非转基因植物中的种子相比，该转基因植物的发育种子中的至少一种糖的水平是增加的。

2.如权利要求1所述的方法，其中该外源核酸包括至少一种选自下组的启动子，该组由以下各项组成：可操作地连接至该至少一种SWEET蛋白的组成型启动子，可操作地连接至该至少一种SWEET蛋白的组织特异性启动子，可操作地连接至该至少一种SWEET蛋白的诱导型启动子。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中该至少一种SWEET蛋白选自下组，该组由以下各项组成：SWEET1、SWEET2、SWEET4、SWEET5、SWEET7、SWEET8、SWEET9、SWEET10、SWEET11、SWEET12、SWEET15。

4.如权利要求1或2所述的方法，其中该至少一种SWEET蛋白选自下组，该组由以下各项组成：SWEET2、SWEET4a、SWEET4b、SWEET4d、SWEET13b、SWEET13c、SWEET14a、SWEET14b、SWEET15a、SWEET15b。

5.如权利要求3或4所述的方法，其中该SWEET蛋白是来自与该转基因植物相同属或相同物种的植物。

6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中该糖转运体是蔗糖单向传递体并且该至少一种糖是蔗糖，其中该糖转运体是葡萄糖单向传递体并且该至少一种糖是葡萄糖，或其中该糖转运体是果糖单向传递体并且该至少一种糖是果糖。

7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中该植物细胞被包含在成熟植物内。

8.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中使该转基因植物细胞经受促进在种子发育过程中表达该至少一种SWEET蛋白的条件发生在该植物细胞发育成成熟植物的过程中或之后。

9.通过如权利要求1至8中任一项所述的方法产生的与相同物种的非转基因植物种子相比具有增加水平的至少一种糖的转基因植物种子。

10.一种制备以下转基因植物的方法，该转基因植物产生与生长在相同条件下的相同物种的非转基因植物相比具有增加水平的至少一种包含在其中的糖的种子，该方法包括

a)在植物细胞中插入外源核酸以产生转基因植物细胞，其中该外源核酸包括编码至少一种糖转运体蛋白(SWEET蛋白)的多核苷酸序列，并且

b)使该转基因植物细胞在促进在种子发育过程中表达该至少一种SWEET蛋白的条件下生长成成熟的转基因植物，

其中与来自生长在与这些转基因植物相同的条件下的相同物种的非转基因植物的种子相比，该转基因植物的发育种子中的该至少一种糖的水平是增加的。

11.如权利要求9所述的方法，其中该外源核酸包括至少一种选自下组的启动子，该组由以下各项组成：可操作地连接至该至少一种SWEET蛋白的组成型启动子，可操作地连接至该至少一种SWEET蛋白的组织特异性启动子，可操作地连接至该至少一种SWEET蛋白的诱导型启动子。

12.如权利要求10或11所述的方法，其中该至少一种SWEET蛋白选自下组，该组由以下各项组成：SWEET1、SWEET2、SWEET4、SWEET5、SWEET7、SWEET8、SWEET9、SWEET10、SWEET11、SWEET12、SWEET15。

13.如权利要求10或11所述的方法，其中该至少一种SWEET蛋白选自下组，该组由以下各项组成：SWEET2、SWEET4a、SWEET4b、SWEET4d、SWEET11、SWEET13b、SWEET13c、SWEET14a、SWEET14b、SWEET15a、SWEET15b。

14.如权利要求12或13所述的方法，其中该SWEET蛋白是来自与该转基因植物相同属或相同物种的植物。

15.如权利要求9至14中任一项所述的方法，其中该糖转运体是蔗糖单向传递体并且该至少一种糖是蔗糖，其中该糖转运体是葡萄糖单向传递体并且该至少一种糖是葡萄糖，或其中该糖转运体是果糖单向传递体并且该至少一种糖是果糖。

16.一种通过收获由如权利要求9至15中任一项的权利要求所述的方法产生的转基因植物中产生的种子而产生的转基因植物种子。