CN113373260A - 一种鉴定棉花叶蜜腺性状的InDel标记引物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴定棉花叶蜜腺性状的InDel标记引物及其应用，所述InDel标记引物包括引物NEC1‑F和引物NEC1‑R，引物NEC1‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2，引物NEC1‑R的核苷酸序列SEQ ID NO.3所示。本发明以亚洲棉有叶蜜腺材料为父本，亚洲棉无叶蜜腺材料为母本，杂交得到F1，使F1自交得到F2，并以确定叶蜜腺性状的F1和F2群体为样本，群体基因组混池重测序分析确定与叶蜜腺关联的候选区间，并利用perl脚本在信号区间内共开发InDel标记36对，经合成之后利用聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选，结果显示有1对InDel标记在有叶蜜腺和无叶蜜腺材料中表现出多态性，对应的NEC1‑F/NEC1‑R引物在有/无叶蜜腺棉花材料中表现出了紧密连锁的关系。

Description

一种鉴定棉花叶蜜腺性状的InDel标记引物及其应用
技术领域
本发明涉及一种鉴定棉花叶蜜腺性状的InDel标记引物及其应用，属于基因工程领域。
背景技术
蜜腺是一种分泌糖液的外分泌结构，分布于植物体外表的某些特定部位。其中，生长于花部的称为花蜜腺，如油菜花托上的蜜腺；生长于茎、叶、花梗等营养体部位上的，称为花外蜜腺，如棉花叶中脉上的蜜腺。棉花由于蜜腺多，蜜期长，蜜物多，易发生虫害。因此挖掘与棉花叶蜜腺性状相关的分子标记，提供方便快捷的棉花育种方法具有重要意义。
InDel标记是指在近缘种或同一物种不同个体之间基因组同一位点的序列发生不同大小核苷酸片段的插入或缺失，是同源序列比对产生空位的现象。InDel在基因组中分布广泛、密度大、数目众多，是用于提高育种实践的效率和精确度的一种强有力的基因组工具。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种鉴定棉花叶蜜腺性状的InDel标记引物，以及该InDel标记引物在鉴定有/无棉花叶蜜腺性状上的应用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种鉴定棉花叶蜜腺性状的InDel标记引物，包括引物NEC1-F和引物NEC1-R，引物NEC1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2，引物NEC1-R的核苷酸序列SEQ ID NO.3所示。
一种InDel标记引物在棉花分子标记辅助育种中的应用。
一种InDel标记引物在选育棉花有/无叶蜜腺品种中的应用。
一种鉴定棉花叶蜜腺性状的方法，包括以下步骤：
（1）提取待测棉花的基因组DNA；
（2）以提取的DNA为模板，利用权利要求1所述引物进行PCR扩增；
（3）对PCR扩增产物进行电泳；
（4）根据电泳结果，鉴定棉花叶蜜腺性状。
PCR扩增的反应体系为：2×Gflex PCR Buffer（含Mg2+ dNTPs）25μl、10mM引物NEC1-F 2μl、10mM引物 NEC1-R 2μl、模板DNA（500ng/μl）1.5 μl、5U/μl TKS Gflex DNAPolymerase 1μl、H2O 18.5 μl。
PCR扩增的反应程序为：94℃预变性10min；98℃变性20s，52℃退火25s，68℃延伸25s，运行35个循环；最后68℃延伸10min，4℃保存。
鉴定棉花叶蜜腺性状的标准为：当PCR扩增片段为一个，且片段大小为339bp，则待测棉花为有叶蜜腺材料；当PCR扩增片段为一个，且片段大小为344bp，则待测棉花为无叶蜜腺材料；当PCR扩增片段为两个，且片段大小分别为339bp和344bp，则待测棉花为有叶蜜腺材料。
一种鉴定棉花叶蜜腺性状的试剂盒，包括上述InDel标记引物。
一种上述试剂盒在棉花分子标记辅助育种中的应用。
一种上述试剂盒在选育棉花有无叶蜜腺品种中的应用。
本发明的有益效果：
1、本发明以亚洲棉有叶蜜腺材料为父本，亚洲棉无叶蜜腺材料为母本，杂交得到F1，使F1自交得到F2，并以确定叶蜜腺性状的F1和F2群体为样本，群体基因组混池重测序分析确定与叶蜜腺关联的候选区间，并利用perl脚本在信号区间内共开发InDel标记36对，经合成之后利用聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选，结果显示有1对InDel标记在有叶蜜腺和无叶蜜腺材料中表现出多态性，对应的NEC1-F/ NEC1-R引物在有/无叶蜜腺棉花材料中表现出了紧密连锁的关系。
2、本发明提取棉花基因组DNA，以其为模板，利用NEC1-F/ NEC1-R引物其进行PCR扩增，可通过电泳结果鉴定棉花叶蜜腺性状。鉴定标准为：当PCR扩增片段为一个，且片段大小为339bp，则待测棉花为有叶蜜腺材料；当PCR扩增片段为一个，且片段大小为344bp，则待测棉花为无叶蜜腺材料；当PCR扩增片段为两个，且片段大小分别为339bp和344bp，则待测棉花为有叶蜜腺材料。由此证明，NEC1-F/ NEC1-R标记引物与叶蜜腺性状是紧密连锁的，可以用于棉花候选材料任何阶段的叶蜜腺性状的鉴定和筛选，进一步提高育种的效率和准确性。
附图说明
图1为过阈值（∆SNP-Index大于等于0.5）信号的区间。
图2为利用基因组可视化软件对有/无叶蜜腺棉花材料重测序数据分型可视化结果。
图3为父本P2、母本P1和部分F2代个体的PCR扩增产物的电泳图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1、棉花基因组DNA提取（CTAB法）
（1）称取3g新鲜的棉花叶片于研钵中，加液氮并迅速研磨成粉末。迅速转移至1个2ml的离心管，并加入800μl已预热的CTAB裂解液（65℃），混匀后置于65℃烘箱30-40min，且每隔10min缓慢颠倒混匀一次。
（2）温浴后，取出离心管，加入800μl体积比24：1的氯仿和异戊醇混合液，缓慢上下颠倒100次，至混匀不分层为止。
（3）4℃条件下12000rpm离心10min。
（4）用无尖的枪头吸取上清液应转移至另一个1.5ml离心管中。
（5）加入0.8倍体积的冰冷异戊醇（提前放-20℃冰箱），缓慢颠倒30次，直至出现絮状DNA生成，静止30min。
（6）用小枪头挑出DNA至1.5ml离心管中，加入70%（v/v）乙醇溶液洗2次，无水乙醇洗1次。
（7）过夜干燥，加ddH2O，溶解DNA，直至完全溶解，4℃保存待用。
实施例2、有叶蜜腺和无叶蜜腺亲本以及群体基因组混池重测序分析确定与叶蜜腺关联的候选区间
本发明以亚洲棉有叶蜜腺材料为父本，亚洲棉无叶蜜腺材料为母本，杂交得到F1，使F1自交得到F2，并在F2群体中进行有效研究。重测序建库材料来自双亲本以及30个显性有叶蜜腺的分离群体单株和30个隐性无蜜腺的分离群体单株的新鲜幼叶，对材料取样之后立即在液氮中冷冻处理，提取基因组DNA。分别在30个显性的分离群体单株和30个隐性的分离群体单株中提取等量的DNA，混合产生两个DNA样本池。根据建库的要求，构建测序文库，使用HiSeqX-TEN平台进行PE150bp双末端测序，测序深度为~30×（按照基因大小为1.7 Gb的标准计算）。使用BWA（v0.7.13）软件将筛选后的两个亲本和两个子代池的测序片段比对到参考基因组上。利用Samtools软件删除了PCR重复的读长。GATK3.8中的IndelRealigner和BaseRecalibrator用于重新比对INDELs周围的序列，HaplotypeCaller和CombineGVCF 用于SNP分析，所有参数为软件默认参数。在F2两个样品池中，通过计算在显性和隐性混池中统计与隐性亲本相同基因型的reads数，计算两个混池的SNP指数。∆SNP-Index=( SNPindex of 显性)-( SNP index of 隐性)。基于具有10kb步长的1000kb滑动窗口计算平均∆SNP-Index，使用在零假设（无QTL）下计算99%的置信区间的ΔSNP指数阈值。最终发现一个明显过阈值（∆SNP-Index大于等于0.5）信号的区间（图1），说明在该信号区间内有基因受到明显的选择作用。本发明利用重测序变异位点信息记录的VCF文件，结合参考基因组，利用perl语言脚本在该信号区间内首先根据真实的InDel位点（InDel的大小需大于或等于5bp）截取其上下游各200bp的序列，再利用primer3软件根据截取的序列设计引物，据此共设计开发InDel标记36对，将设计好的引物序列送往生物公司进行引物合成，经合成之后的引物利用聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选多态性，具体方法包括以下步骤：
1、PCR扩增
PCR扩增的反应体系为：2×Gflex PCR Buffer（含Mg2+ dNTPs） 25μl、10mM引物NEC1-F 2μl、10mM引物 NEC1-R 2μl、模板DNA（500ng/μl） 1.5 μl、5U/μl TKS Gflex DNAPolymerase 1μl、H2O 18.5 μl。
PCR扩增的反应程序为：94℃预变性10min；98℃变性20s，52℃退火25s，68℃延伸25s，运行35个循环；最后68℃延伸10min，4℃保存。
2、电泳
将PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，具体方法为：
（1）将制胶用玻璃板用水洗净并用酒精擦拭，保证不留水渍和污渍；
（2）分别将一块毛玻璃和一块光玻璃用夹子固定好毛面向下水平放置于桌面上；
（3）将配制好的聚丙烯酰胺凝胶缓慢倒入玻璃模具中，快速的插入梳子；
（4）室温凝固15min；
（5）将玻璃板用夹子固定在电泳槽内，加入事先配好的1×TBE电泳缓冲液；
（6）拔去梳子，并用注射器调整孔道保证孔道无弯曲现象；
（7）10μl PCR产物加入2μl 溴酚蓝上样缓冲液充分混匀后离心待用；
（8）使用排枪上样2μl，完成后接通电源220V 1.5h，进行电泳。
3、电泳产物固定、渗透以及显色
（1）电泳完成后，将玻璃磨具内的凝胶小心取出放置于固定专用槽内；
（2）向固定专用槽内加入480ml 纯水、54ml 无水乙醇和3.6ml 的冰乙酸；
（3）于摇床上缓慢固定至少8min；
（4）将固定液倒去，纯水洗涤一遍，进行下一步渗透；
（5）称取1.2g 硝酸银和量取540ml的纯水于渗透槽内；
（6）于摇床上缓慢固定至少12min；
（7）将渗透液倒去，纯水洗涤两遍，进行下一步显色；
（8）该反应过程与通风橱内进行，称取24g 氢氧化钠和量取1600ml的纯水于显色槽内混匀后加入10ml 甲醛溶液；
（9）通风橱内于摇床上缓慢显色直到有条带出现为止；
（10）显色完成后纯水至少洗涤两遍；
（11）将洗涤干净的胶片放置于胶片灯中进行拍照保存。
结果显示，有1对InDel标记在有叶蜜腺和无叶蜜腺材料中表现出多态性，对应的NEC1-F/ NEC1-R引物在有/无叶蜜腺棉花材料中表现出了紧密连锁的关系。利用基因组可视化软件对有/无叶蜜腺棉花材料重测序数据分型可视化，可以明显看到无叶蜜腺材料比有叶蜜腺材料在243个碱基位置插入了5个碱基GCCTT（图2），InDel标记的核苷酸序列为：
GAAGCCTGTTTTAGGCCCATCCATAAATTTATTTTGAAAATTTTAAAATATATATTTACATTATTTTTAATTTAAAATTTAGATTTTTTTCTCATCTATTAAAATTTTATATAAGCAACTTAACATTTTCTTAATGTTTACGTTATAGTATCATATATCATTGTAGAATTTTTTGTGTGTGATGTAATACATTACATAATATATCACAAAATAAAAAAATGGGTTAGGTTGGGTCAAGTTTGGGCCTTGAATGTTTAAGTCTGAACATAGTTCATTTTTTAAATAGACCTACCCTTTTTTGGGTAAGTAATCTAACCTTTGAACATGTCATGTCTATCTTGAAGC（SEQ ID NO.1）
其中，下划线标示为引物结合位置，灰底为无蜜腺材料基因组5个碱基的插入位置。
实施例3、利用InDel标记鉴定棉花叶蜜腺性状的方法
1、基因组DNA的提取
参考实施例1的方法提取待测棉花基因组DNA。
2、引物设计
NEC1-F：5’-GAAGCCTGTTTTAGGCCCATCC-3’（SEQ ID NO.2）
NEC1-R：5’-GCTTCAAGATAGACATGACATG-3’（SEQ ID NO.3）
3、PCR扩增
PCR扩增的反应体系为：2×Gflex PCR Buffer（含Mg2+ dNTPs） 25μl、10mM引物NEC1-F 2μl、10mM引物 NEC1-R 2μl、模板DNA（500ng/μl） 1.5 μl、5U/μl TKS Gflex DNAPolymerase 1μl、H2O 18.5 μl。
PCR扩增的反应程序为：94℃预变性10min；98℃变性20s，52℃退火25s，68℃延伸25s，运行35个循环；最后68℃延伸10min，4℃保存。
4、电泳
对PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据电泳结果鉴定棉花叶蜜腺性状。判定标准为：当PCR扩增片段为一个，且片段大小为339bp，则待测棉花为有叶蜜腺材料（基因型为AA）；当PCR扩增片段为一个，且片段大小为344bp，则待测棉花为无叶蜜腺材料（基因型为aa）；当PCR扩增片段为两个，且片段大小分别为339bp和344bp，则待测棉花为有叶蜜腺材料（基因型为Aa）。
实施例4、利用InDel标记引物鉴定棉花叶蜜腺方法的验证
1、实验材料
实验用棉花材料Ga0028（无蜜腺）与Ga0029（有蜜腺）为国家棉花种质资源中期库提供，2015年和2016年种植在河南安阳中国农业科学院棉花研究所（ICR）试验田。以有蜜腺棉花Ga0029作为父本P2，无蜜腺棉花Ga0028作为母本P1，进行杂交，获得杂交F1代，F1代自交得到F2代群体。
2、实验方法
利用实施例3的方法对有蜜腺父本P2、无蜜腺母本P1以及杂交F2代进行鉴定。
3、实验结果
结果表明，有叶蜜腺父本P2和有叶蜜腺F2群体DNA的PCR扩增产物为一个339bp的片段，或一个339bp和一个344bp的片段，无蜜腺母本P1和无蜜腺F2群体的PCR扩增产物为一个344bp的片段，部分PCR扩增产物电泳结果如图3所示。由此证明，该分子标记引物与棉花叶蜜腺性状紧密联系，在叶蜜腺性状判定方面具有很高的准确性。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院棉花研究所
<120> 一种鉴定棉花叶蜜腺性状的InDel标记引物及其应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 345
<212> DNA
<213> 棉花（Gossypium spp ）
<400> 1
gaagcctgtt ttaggcccat ccataaattt attttgaaaa ttttaaaata tatatttaca 60
ttatttttaa tttaaaattt agattttttt ctcatctatt aaaattttat ataagcaact 120
taacattttc ttaatgttta cgttatagta tcatatatca ttgtagaatt ttttgtgtgt 180
gatgtaatac attacataat atatcacaaa ataaaaaaat gggttaggtt gggtcaagtt 240
tgggccttga atgtttaagt ctgaacatag ttcatttttt aaatagacct accctttttt 300
gggtaagtaa tctaaccttt gaacatgtca tgtctatctt gaagc 345
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaagcctgtt ttaggcccat cc 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcttcaagat agacatgaca tg 22

Claims (10)

1.一种鉴定棉花叶蜜腺性状的InDel标记引物，其特征在于，所述InDel标记引物包括引物NEC1-F和引物NEC1-R，引物NEC1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2，引物NEC1-R的核苷酸序列SEQ ID NO.3所示。
2.一种如权利要求1所述的InDel标记引物在棉花分子标记辅助育种中的应用。
3.一种如权利要求1所述的InDel标记引物在选育棉花有/无叶蜜腺品种中的应用。
4.一种鉴定棉花叶蜜腺性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取待测棉花的基因组DNA；
（2）以提取的DNA为模板，利用权利要求1所述引物进行PCR扩增；
（3）对PCR扩增产物进行电泳；
（4）根据电泳结果，鉴定棉花叶蜜腺性状。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR扩增的反应体系为：2×Gflex PCRBuffer（含Mg2+ dNTPs）25μl、10mM引物NEC1-F 2μl、10mM引物 NEC1-R 2μl、模板DNA（500ng/μl）1.5 μl、5U/μl TKS Gflex DNA Polymerase 1μl、H2O 18.5 μl。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR扩增的反应程序为：94℃预变性10min；98℃变性20s，52℃退火25s，68℃延伸25s，运行35个循环；最后68℃延伸10min，4℃保存。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，鉴定棉花叶蜜腺性状的标准为：当PCR扩增片段为一个，且片段大小为339bp，则待测棉花为有叶蜜腺材料；当PCR扩增片段为一个，且片段大小为344bp，则待测棉花为无叶蜜腺材料；当PCR扩增片段为两个，且片段大小分别为339bp和344bp，则待测棉花为有叶蜜腺材料。
8.一种鉴定棉花叶蜜腺性状的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物。
9.一种如权利要求8所述试剂盒在棉花分子标记辅助育种中的应用。
10.一种如权利要求8所述试剂盒在选育棉花有无叶蜜腺品种中的应用。
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