CN107460254B - 一种基于猪line1转座子插入多态性研发新型分子标记的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学和生物信息学领域，具体涉及一种基于猪LINE1转座子插入多态性研发新型分子标记的方法。该方法是利用LINE1的5’端核苷酸序列或3’端核苷酸序列作为查询序列，在猪公开的基因组寻找插入位点；对寻找到的LINE1的每个插入位点，分别向上、下游延伸300‑500个核苷酸序列，然后下载每条序列；获得的序列去除冗余；根据获得的序列信息设计检测引物，再利用所得的待验证分子标记引物PCR扩增不同品种，或同一品种不同个体基因组样品，选取能清晰扩出条带且有多态性的引物组合，获得分子标记。本发明方法可以为猪的品系鉴定，育种中的标记辅助选择提供有用的分子标记。

Description

一种基于猪LINE1转座子插入多态性研发新型分子标记的 方法

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物信息学领域，具体涉及一种基于猪LINE1转座子插入多态性研发新型分子标记的方法。

背景技术

目前已有的遗传标记主要有形态标记、细胞标记、生化标记和分子标记。形态学标记基于个体形状描述，得到的结论往往不够完善，且极易受环境的影响。细胞学标记基于染色体结构变异，但群体间染色体结果差异小，可利用标记数量有限，加之染色体组型或带型分析较繁琐。生化标记通过对一系列蛋白和同工酶的检测，但是，蛋白和同工酶都是基因的表达产物，非遗传物质本身，它们的表现易受环境和发育状况的影响。与以上几种分子标记相比，分子标记具有数量多，不易受环境影响，检测相对快捷的优点。DNA分子标记是最常被使用的一类分子标记，具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。

DNA分子标记技术记过历年来的发展，主要有以下几种标记，第一代分子标记技术：限制性片段长度多态性(RFLP)标记技术，优点：RFLP标记的等位基因具有共显性的特点，结果稳定可靠，重复性好，特别适应于构建遗传连锁图。缺点：在进行RFLP分析时，需要该位点的DNA片段做探针，用放射性同位素及核酸杂交技术，既不安全又不易自动化。另外，RFLP对DNA多态性检出的灵敏度不高，RFLP连锁图上还有很多大的空间区。随机扩增多态DNA标记技术(RAPD)，优点：与RFLP相比，RAPD技术简单，DNA用量少，试验设备简单，不需DNA探针，设计引物简单，而且不需要同位素，安全性好。缺点：RAPD技术受许多因素影响，实验的稳定性和重复性差，首先是显性遗传，不能识别杂合子位点，这事的遗传分析相对复杂，在基因定位，做连锁遗传图时，会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性下降；其次，RAPD对反应条件相当敏感，包括模板浓度，Mg2+浓度，所以实验的重复性差。扩增片段长度多态技术(AFLP)，优点：它兼具RAPD与RFLP的优点，有较高的稳定性，用少量的选择性引物能在较短时间内监测到大量位点，各染色体上AFLP标记的数目与染色体长度呈正相关，通过少量效率高的引物组合，可获得覆盖整个基因组的AFLP标记。缺点：AFLP对基因组纯度和反应条件较高，容易受DNA污染，操作技术难度大。用于遗传作图时，少数的标记与图谱紧密度有出入。第二代分子标记技术，微卫星标记技术SSR，优点：具有很高的多态性,而且一般为共显性。缺点：工作量大，费用也高，实际应用少。第三代分子标记：单核苷酸多态性(SNP)优点：具有共显性，能获得的标记数量多，易于实现高通量。是基因组中最简单。最常见的多态性形式，具有很高的遗传稳定性。缺点：芯片成本高，由于DNA样品的复杂性，有些SNP不能被捡起。表达序列标签(EST)优点：成本低，操作简单。有助于人们从分子水平理解物种的多样性，并可利用其中感兴趣的序列信息。缺点：所获基因组信息不全，如不能体现出内含子，调控序列等在基因表达调控中重要的信息。

转座子在生物基因组中广泛存在，是一类在基因组上可以自由跳跃(复制或移位)的移动DNA序列，能在其寄主的基因组中复制、移动。而LINE1属于逆转录转座子，转座模式属于复制黏贴型的，即能在原位置保持不变时复制自身并插入到其他位置，因此，逆转录转座能在基因组上能产生大量插入多态性(Transposon insertion polymorphisims，TIP)。并且自身长度较长，自身携带如启动子、小RNA结合位点等多种调控相关元件，因此随着LINE1的转座，对寄主基因组的结构，对插入位置的基因的表达，对附近基因的调控都能产生显著的影响，从而对物种、品种、亚种、品系形成发挥了重要作用。通过TIP分子标记可以有效追溯哺乳动物共同祖先，重构哺乳动物系统生物学。目前发现在人类基因组中至少有8350个TIP座位，LINE1插入多态有1500个，且已经成功应用于群体遗传进化研究和疾病诊断，已经证实与疾病关联的96个TIP分子标记能够进行准确的临床诊断。同时，TIP技术也成为生物多样性、遗传进化研究和分子育种的重要工具。

猪基因组学研究目前面临的主要挑战是虽然获得了大量数量性状变异的QTL，但缺乏足够密度的分子标记，难以进行基因精细定位，无法有效开展分子标记辅助选择。而TIP具有理想分子标记的诸多优点：如多态性高、共显性、基因组分布广泛、检测手段简单快速、重复性好和开发成本低等。并且相较其他标记的来源，LINE1的插入对猪基因组结构、基因表达的影响远大于SNP，微卫星等，因此基于猪LINE1转座子插入多态研发的分子标记必将大大推动分子育种的进程和猪功能基因学的研究；同时，TIP分子标记应用于猪群体遗传学研究也将加深人类对猪生物多样性、起源进化和品种种质特性形成的理解和认识。

发明内容

本发明是针对现有分子标记的不足，基于猪LINE1转座子在猪基因组上具有含量丰富，分布广泛，并且在不同的个体间存在插入多态性的特点提供一种研发分子标记的方法。

本发明通过以下技术方案实现：

一种基于猪LINE1转座子的新型分子标记的获取方式，包括以下步骤：

(1)利用LINE1的5’端核苷酸序列或3’端核苷酸序列作为查询序列，一般可以使用5’端核苷酸序列的前300-500核苷酸或3’端核苷酸序列的末端300-500核苷酸作为查询序列，在生物学公用数据库中对猪公开基因组进行检索，寻找插入位点；

(2)针对寻找到的LINE1的每个插入位点，分别向上游或下游延伸300-500个核苷酸序列，然后分别下载每条序列；

(3)将步骤(2)获得的序列去除冗余；

(4)根据步骤(3)获得的序列信息设计检测引物，作为待验证分子标记引物，其中使一侧引物位于LINE1插入位点的基因组侧翼序列中，另一侧引物位于LINE1的5’端或3’端核苷酸序列中；

(5)利用步骤(4)所得的待验证分子标记引物PCR扩增不同品种，或同一品种不同个体基因组样品，选取能清晰扩出条带且有多态性的引物组合，获得分子标记。

其中，LINE1家族的成员序列有差异，可以用任何一个作为查询序列，获得的位点都属于LINE1转座子的插入位点。所述LINE1的5’端500个核苷酸序列包括但不限于SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.12；所述3’端500个核苷酸序列包括但不限于SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22或SEQ ID No.23。

上述方法的一个实例是：

(1)利用LINE1的5’端核苷酸序列SEQ ID No.1作为查询序列，在Ensembl数据和UCSC数据库对猪公开的考基因组进行比对(blat)搜索，寻找LINE1在基因组上的插入位点，选择比对上的长度大于95％，相似度大于98％的位点，共303个插入位点；

(2)根据303个插入位点分别向上游延伸300核苷酸，然后分别下载每条序列；共303条序列；

(3)将获得的303条序列利用CD-HIT程序按照相似性95％进行合并，去除冗余，最终获得204条序列。

(4)截取LINE1 300核苷酸与其5’端前300个侧翼核苷酸序列作为设计引物的模板，根据序列设计检测引物，其中使上游引物位于LINE1插入位点的5’端上游序列中，下游引物位于LINE1的5’端核苷酸序列SEQ ID No.1中，最后获得204对待验证分子标记引物。

(5)利用待验证分子标记引物PCR扩增不同品种，或同一品种不同个体基因组样品，选取能清晰扩出条带且有多态性的引物组合，获得分子标记，共获得84个标记，对应的引物名称，引物组合，引物序列如表1所示。

其中，步骤(5)中PCR扩增的操作可以是包括以下步骤：

1)人工合成上述204对待验证分子标记引物；

2)提取不同品种的池DNA以及不同品种的不同个体基因组；

3)以不同品种的池DNA以及不同品种的不同个体基因组为模板进行PCR扩增；

4)对PCR扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测。

本发明主要通过获取LINE1插入位点序列，设计各位点检测引物，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳等步骤获得转座子插入情况，据此建立基于转座子插入多态性检测方法。为猪的品系鉴定，育种中的标记辅助选择提供有用的分子标记。

附图说明

图1标记L1TIP-29在11个不同品种中的扩增结果。marker为宝生物的DL5000，从左到右1-12分别是洛克猪、长白猪、大白猪、梅山猪、姜曲海猪、苏姜猪、藏猪、野猪、巴马香猪、皖南花猪、烟台黑猪混合基因组及空白对照，混合基因组均为5个个体的等质量混合基因组。

图2标记L1TIP-50在11个不同品种中的扩增结果。marker为宝生物的DL2000，从左到右1-12分别是洛克猪、长白猪、大白猪、梅山猪、姜曲海猪、苏姜猪、藏猪、野猪、巴马香猪、皖南花猪、烟台黑猪混合基因组及空白对照，混合基因组均为5个个体的等质量混合基因组。

图3标记L1TIP-6在9个不同品种的不同个体中的检测结果。图3中marker为宝生物的DL2000，从左到右分别是野猪、大白、杜洛克、梅山、二花脸、藏猪、荣昌、巴马香猪、苏姜猪，其中藏猪3头，其余品种均为5头。

图4标记L1TIP-13在9个不同品种的不同个体中的检测结果。图4中marker为宝生物的DL2000，从左到右分别是野猪、大白、杜洛克、梅山、二花脸、藏猪、荣昌、巴马香猪、苏姜猪，其中藏猪3头，其余品种均为5头。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

一、参考基因组中LINE1插入位点序列获取，具体过程如下：

1、LINE1转座子在基因组中插入位点检索：利用LINE1的5’端核苷酸序列SEQ IDNo.1作为查询序列，在Ensembl数据库(http://www.ensembl.org/)和UCSC数据库(http://genome.ucsc.edu/)中利用Blat程序对猪的参考基因组(SGCG Sscrofa10.2/susScr3)进行比对搜索，运行参数使用数据库中各自的默认设置，寻找LINE1在基因组上的插入位点。

2、在两个数据库中每个LINE1插入位点序列获取：在Ensembl数据库中检索插入位点后，向比对上的长度大于95％，相似度大于98％的位点，分别向每个插入位点的5’端上游延伸300核苷酸，然后下载每条序列，同理在UCSC数据库中进行再次检索，剔除与Ensembl数据库中一致的位点，然后向每个插入位点的5’端上游延伸300核苷酸，下载每条序列，最后合并两个数据库下载的序列。

3、将获得的序列利用CD-HIT-est程序(http://weizhongli-lab.org/cdhit_suite/cgi-bin/index.cgi？cmd＝cd-hit-est)将Sequence identity cut-off参数设置为0.95，其他参数使用默认值进行去冗余。

二、引物的设计

利用获得的序列，使用BatchPrimer3(http://batchprimer3.bioinformatics.ucdavis.edu/cgi-bin/batchprimer3/batchprimer3.cgi)在线软件进行引物设计，使上游引物位于LINE1插入位点的5’端的侧翼序列，下游引物位于LINE1的5’端核苷酸序列SEQ IDNo.1中。产物长度设置为400-600bp，其他参数使用软件默认设置。设计好的各引物用Olige7进行分析评价，然后由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

三、分子标记在11个不同品种中检测

1、池基因组的准备：

(1)选取11品种(杜洛克猪、长白猪、姜曲海猪、大白猪、梅山猪、苏姜猪、皖南花猪、藏猪、野猪、巴马香猪、烟台黑猪)各5头，采集耳组织，用TaKaRa MiniBEST UniversalGenomic DNA Extraction Kit Ver.5.0提取各自基因组，主要步骤如下：

a)取2-25mg的耳组织，剪碎，加入180微升的Buffer GL、20微升的Proteinase K和10微升Rnase A(10mg/ml)，56℃水浴至组织完全裂解。b)向裂解液中加入200微升BufferGB和200微升100％乙醇，充分混匀。c)将Spin Column安置于Collection Tube上，溶液移至Spin Column中，12000rpm离心2分钟，弃滤液。d)向Spin Column中加入500微升buffer WA，12000rpm离心1分钟，弃滤液。e)将700微升的buffer WB加入至Spin Column中，12000rpm离心1分钟，弃滤液。f)重复操作步骤6。g)将Spin Column安置于Collection Tube上，12000rpm离心2分钟。h)将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入80微升的灭菌水，室温静置5分钟。i)12000rpm离心2分钟洗脱DNA.

(2)调整各个基因组浓度成为40ng/μl，取每个个体基因组50μl混合为品种池DNA，共11种混合基因组，以此作为模板进行PCR扩增。

2、PCR扩增

设计以下PCR反应体系：

(1)在灭菌PCR管中配制20μl反应体系

(2)将PCR管置于PCR仪中，进行如下反应程序

注：1：南京诺唯赞生物科技有限公司

3、琼脂糖凝胶检测

(1)制作1.5％的琼脂糖凝胶：称取1.5g琼脂糖放入三角烧瓶中，加入100ml 1×TAE溶液，放于微波炉中加热使之完全溶解，取出冷却至约60℃时，将琼脂糖胶倒入插有胶梳的模具中，并检查有无气泡存在。室温放置30min待凝胶完全凝固后，小心拔出胶梳，浸没于加有1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中。

(2)PCR产物电泳：用移液器吸取6μl PCR扩增产物依次加入到凝胶孔中，同时点4μl DNA Maker作为参照，120V恒压电泳，待指示剂到达胶块的2/3处停止电泳，然后将凝胶放到溴化乙锭溶液中，染色10分钟，将凝胶拿出放到紫外灯下观察并拍照记录。

四、分子标记在9个不同品种中检测

1、基因组的准备：

(1)选取9个品种(野猪、大白、杜洛克、梅山、二花脸、荣昌、巴马香猪、苏姜猪、藏猪)，藏猪三头个体，其余每种5头个体，采集耳组织，用TaKaRa MiniBEST UniversalGenomic DNA Extraction Kit Ver.5.0提取各自基因组，主要步骤如下：

a)取2-25mg的耳组织，剪碎，加入180微升的Buffer GL、20微升的Proteinase K和10微升Rnase A(10mg/ml)，56℃水浴至组织完全裂解。b)向裂解液中加入200微升BufferGB和200微升100％乙醇，充分混匀。c)将Spin Column安置于Collection Tube上，溶液移至Spin Column中，12000rpm离心2分钟，弃滤液。d)向Spin Column中加入500微升buffer WA，12000rpm离心1分钟，弃滤液。e)将700微升的buffer WB加入至Spin Column中，12000rpm离心1分钟，弃滤液。f)重复操作步骤6。g)将Spin Column安置于Collection Tube上，12000rpm离心2分钟。h)将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入50-200微升的灭菌水或Elution Buffer，室温静置5分钟。i)12000rpm离心2分钟洗脱DNA.

(2)调整各个基因组浓度成为40ng/l，以此作为模板进行PCR扩增。

2、PCR扩增

设计以下PCR反应体系：

(1)在灭菌PCR管中配制20μl反应体系

(2)将PCR管置于PCR仪中，进行如下反应程序

注：1：南京诺唯赞生物科技有限公司

3、琼脂糖凝胶检测

(1)制作1.5％的琼脂糖凝胶：称取1.5g琼脂糖放入三角烧瓶中，加入100ml 1×TAE溶液，放于微波炉中加热使之完全溶解，取出冷却至约60℃时，将琼脂糖胶倒入插有胶梳的模具中，并检查有无气泡存在。室温放置30min待凝胶完全凝固后，小心拔出胶梳，浸没于加有1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中。

(2)PCR产物电泳：用移液器吸取6μl PCR扩增产物依次加入到凝胶孔中，同时点4μl DNA Maker作为参照，120V恒压电泳，待指示剂到达胶块的2/3处停止电泳，然后将凝胶放到溴化乙锭溶液中，染色10分钟，将凝胶拿出放到紫外灯下观察并拍照记录。

五、结果分析

部分检测结果如图1，图2，图3，图4所示。图1，图2所示基于LINE1插入多态性的分子标记在不同品种间存在良好的多态性，图3，图4所示基于LINE1插入多态性的分子标记在不同个体间存在良好的多态。

六、结论

经过两轮实验验证，获得表1所示的84个基于LINE1插入多态性的分子标记，能够在品种内或品种间产生清晰且具有多态的检测结果，可以为品种鉴定提供鉴定方法，可以作为个体鉴定，分子辅助育种的良好标记，具有检测成本低，重复性好，结果清晰等优点；且为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。

表1.LINE1转座子插入多态性标记检测引物列表

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 一种基于猪LINE1插入多态性研发新型分子标记的方法

<130>

<160> 112

<170> PatentIn version 3.3

<210>1

<211>500

<212>DNA

<213>猪 (Sus scrofa )

<400>1

gagaggacaa gatggcggag gagtaggggg acacgctcgc cctctcccac aaacacaaca 60

aaaaaagcac atctacagaa gaaatgactc gcacagaaca acaaccaatc gctggcagag 120

gaacctaaac tccaataacg gcaagaagtt cgtgacatta ttgggcagaa cgggagaaaa 180

gaggagagtg agagaaggtg aatccgagcg ggacgggcgc tcccgaaagg gaactgcgga 240

ggagaaaggg atcccgcacc ctggaaagtc tcctaccggg ggaaagatca aacgaaccgg 300

aggaatctcc agatgcagag aagagtgtag cagtaagtcg gagtacggaa aaacgatcaa 360

gaacccaacg gaccatctga actacgggca cagtcaccaa aaattgagac gcctgggtgg 420

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ctgggtgggg gctgggcacc 500

<210>2

<211>500

<212>DNA

<213>猪 (Sus scrofa )

<400>2

ggagggatta agatggcgga atagaaggac tggagctcaa cttctctcct aaaaacaaca 60

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gcaggagctc cacgggactg ggggaaacgg agaccccatt cttaaaaggc gcacacagac 420

tttcacgtgc actgggtccc agggcaaagc aaagtctcca tgggaatctg ggtcaaacct 480

gactgcagtt cttggaggac 500

<210>3

<211>500

<212>DNA

<213>猪 (Sus scrofa )

<400>3

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<210>4

<211>500

<212>DNA

<213>猪 (Sus scrofa )

<400>4

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gggctaagga gcagtgccca 500

<210>5

<211>500

<212>DNA

<213>猪 (Sus scrofa )

<400>5

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<210>6

<211>500

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<213>猪 (Sus scrofa )

<400>6

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<210>7

<211>500

<212>DNA

<213>猪 (Sus scrofa )

<400>7

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gactgcttgg ggggtctagg 500

<210>8

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<212>DNA

<213>猪 (Sus scrofa )

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aacaatctac atgtaaaacg actcgcacag aacatcaact gaatgctggc agaagaactt 120

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gagacttagg ctctggaggt cgcctattcc cactgtgacc acacagaaag cagaaatatc 480

aaccaggggt tcttgcatag 500

<210>9

<211>500

<212>DNA

<213>猪 (Sus scrofa )

<400>9

ggaggcaaga tggcggaaga gtagggggac gcgctcgccc tctcccacaa acacaacaaa 60

aaaacacatc tacacgtaaa gactcacaca gaacagcaac tgaatgctgg cagaagaact 120

taaacctcca aaaaggcaag aatctcttga cataactggg taaaacaaga gaaaagagga 180

gagagagaga aggggaatca ggacggactg gcactcctga gagggaactg tgaaggagaa 240

agggaaccca caccctggaa agtcacctaa ccacggaaag atcaactgag ttggagggat 300

ctccagaccg agaaaagtgc agcagcaggt ctgagatctg aaaagcagag tgagagccac 360

acagatcatc tgaaccactg gcacagacac caaaaacgag atgcttgggt gggggctggg 420

caccgagacc taggctccga ggttagtccc tgggagcggg ctggggttgg cggtgtggag 480

acagcctgag ggactaggaa 500

<210>10

<211>500

<212>DNA

<213>猪 (Sus scrofa )

<400>10

gggggcaaga tggagaagag taagaggagc tcaccctctc ccacaaacac atcaaaaaaa 60

cacatctaca tgtaaaagat tcacacagaa catcaactga atgctggcag aagaacttaa 120

acctccaaaa agggcaagaa actcttgaca taactgggta gaacaaaaga aaaaagagag 180

agagaaaagg aatcaggatg ggactagcac tccctgaggg agctgtgaag gagaaaggga 240

acccacaccc tgggaagcca cctaaccaac ggaaagatca gccgagtcgg agggaactcc 300

aagaagccaa gaaaagcaca gcagcaggtc tgagaaccaa aaagcagagt gagagatgca 360

cagaccatct gaaccactgg cacagacacc acagcctgag atgctcggtg ggggctgggc 420

actgagactt aggctccaga ggtcagtccc agggagcggc tggggttggg tgtggagaca 480

gcctaaggga ctagggagca 500

<210>11

<211>500

<212>DNA

<213>猪 (Sus scrofa )

<400>11

ggagcaagat gggaagagta gggggagctg ccctctccca caaacacaaa aaaaacacat 60

ctacagtaaa cactcacaga acagcaactg aatgctggca gaagaactta aacctccaaa 120

aaggcaagaa tctcttgaca taactgggta aaacaagaga aaagaggaga ggagagaagg 180

ggaatcagga cggacggcac tccgagaggg aactgtgaag gagaaaggga acccacaccc 240

tggaaagtca cctaaagaaa gatcaacagt cgagggatct ccagacagaa aagccagcag 300

aggtctgaga tctgaaaagc agagtgagag cacagatcat ctgaaccact ggcacagaca 360

ccaaaaacga gatgctgggt gggggctggg caccagacct aggctcgagg ttagtccctg 420

ggagggctgg ggttgggtgt ggagacagcc tgagggatag gaaggtgtgg tggagggagc 480

aatactaagg gctggggagt 500

<210>12

<211>500

<212>DNA

<213>猪 (Sus scrofa )

<400>12

ggggaggtct aagatggcgg agtagcagga cgtaaggctc atctactccc acaaatacat 60

tgaaaataca actatatgtg gaactattcg cacagaaaat ttgcgaaaaa ctgacaaaag 120

acctcaagat tatgatagaa caagaaaaac attacaaaac cagataggac ataagaaaga 180

agaagaacaa gagaaaaaga agcgaaagga aatgagatgg gacctgctct cccaggaggg 240

agctggaaag aggaatagct cctgcacccc gggaagttcc cccaccagcg acgagatcag 300

ccaaaaacgg aggaggaact ctagacaaat ggtctgaagc agttaagaag gagacagtcc 360

tccacaaacg gtcagtgcta cgggcaacgg gcaaccgtag gcgggtgcca gcaggtgttg 420

ggaactaaaa ctttggcctt agagatcaga cccaaagagg gagctggggc cggctacgtg 480

gggggaaaaa actgggttgg 500

<210>13

<211>500

<212>DNA

<213>猪 (Sus scrofa )

<400>13

attcttacca gttaagttat tctttttatt atgctatata aaatatttaa tggtatataa 60

ggctttcttc tttataaatt ttagttgcat aatatacaca attttaatat aatgctaatt 120

tttaaagaaa aattgaaatg taatagataa tactaaatag taaagatgaa agccatacaa 180

aatgggataa agcatagaat aaatttccta tttgtctcag catattttcc attccacttc 240

tccagaggga gacacttaat ctgtttctta agatccatga tataataatc tgtctgaatg 300

taattgtgtt taaatatatg tattttattc tgtaaaaaaa aaatattctg tgataatcta 360

tgtgggaaaa gaatgtgaaa gggaatggat gtgtgtacat gtataactga atctctttgt 420

tgtacagcag aaattatcac aaccttgtaa atcaactata cttcaataaa ttttttttaa 480

aaaaaatgaa aaaaaaaaaa 500

<210>14

<211>500

<212>DNA

<213>猪 (Sus scrofa )

<400>14

gggcatctat ccagagaaaa ccagactcgc aaagacacat gtactccaat gttcattgca 60

gcactattta caatagccaa gacatggaaa caacctaaat gtccatcgac agaggagtgg 120

atcaagaaga tgtggtacat atacacaatg gaatattact cagccattaa aaagaacgaa 180

ataccagcat ttttagcaac atggatggac ctagaaacta tcatgctaag tgaagtcagc 240

catacaatga gacaccaaca tcaaatgctt tcactgacat gtggaatctg aaaaaaggac 300

agactgaact tctttgcaga acagatgctg actcacagac attgaaaaac ttatggtctc 360

cggaggagac agtttggggg gtggggggat gtgcttgggc tgtgggatgg aaatcctgtg 420

aaatcagatt gttatgatca ttatacaact acagatgtga taaattcatt tgagtaataa 480

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 500

<210>15

<211>500

<212>DNA

<213>猪 (Sus scrofa )

<400>15

aagaagatgt ggtatatata cacaatggaa tactactcag ccataaaaaa gaacaaaata 60

atgccatttg cagcaacatg gatggaacta gagactctca tactaagtga agtaagtcag 120

aaagagaaag acaaatacca tatgatatca cttatatctg gaatctaata tatggcacaa 180

atgaaccttt ccacagaaaa gaaactcatg gacttggaga acagacttgt ggttgccaag 240

ggggaggggg agggagtggg atggactggg agtttggggt taatagatgc aaactattgc 300

atttggaatg gataagcaat gagatcctgc tgtatagcac agggaactat atctagtcac 360

ttgtgatgga acatgatgga ggataatgtg agaaaaagaa tgtatatatt atgttactgg 420

gtcactttgc tgtacagtag aaaatgacag aacactgtaa acaactataa tggaaaaaat 480

aaaaatcata aaaaaaaaaa 500

<210>16

<211>500

<212>DNA

<213>猪 (Sus scrofa )

<400>16

acaacccaaa tgtccatcga cagatgattg gattcggaag agtggtatat atacacaatg 60

gaatactact cagccataaa aaaggatgac ataatgccat ttgcagcaac atggatggaa 120

ctagagaatc tcatcctgag tgaaatgagc cagaaagaca aagacaaata ccatatgata 180

tcacttataa ctggaatcta atatccagca caaatgaaca tctcctcaga aaagaaaatc 240

atggacttgg agaagagact tgtggttgcc tgatgggagg gggagggagt gggagggatc 300

gggagcttgg gcttatcaga cacaactaga atagatttac aaggagatcc tgctgaatag 360

cattgagaac tatgtctaga tactcatgtt gcaacagaag aaagggtggg ggaaaaactg 420

taattgtaat gtatacatgt aaggataacc tgaccccctt gctgtacagt gggaaaataa 480

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 500

<210>17

<211>500

<212>DNA

<213>猪 (Sus scrofa )

<400>17

aattggtgca accactgtgg aaaacagtat ggagattcct cagaaaacta aaaatagaac 60

taccatttga tccagcaatc ccactcctgg gcatctatcc agagaaaacc agactgcaaa 120

gacacatgta ctccaatgtt cattgcagca ctatttgcaa tagccaagac atggaaacaa 180

cctaaatgtc catcgacaga ggagtggatc aagaagatgt ggtacatgga gttcccgtcg 240

tggcgcagtg gttaacgaat ccgactagga accatgaggt tgcgggttcg atccctggcc 300

ttgctcagtg ggttaaggat ctggcattgc cgtgagctgt ggtgtaggtt gcagacgcgg 360

ctcggatccc gcgttgctgt ggctctggcg taggccggtg gctacagctc cgattagacc 420

cctagcctgg gaacctccat atgcccagga gcggcccaag aaaagcaaaa aacaaaaaga 480

caaaaaaaaa aaaaaaaaaa 500

<210>18

<211>500

<212>DNA

<213>猪 (Sus scrofa )

<400>18

acagatgaat ggattaagaa gatgtggtac atatacacaa tggaatacta ctcagccata 60

aaaaagaaca aaataatgcc atttgcagca acatggatgg aactagagat tctcatacta 120

agtgaagtaa gtcagaaaga gaaagacaaa taccatatga tatcacttat atgtggaatc 180

taaaatatgg cacaaatgaa cctatctaca aacagaaaca gactcacaga catggagaac 240

agacttgtgg ttgccaaggg gagggggagg gagtgggatg gactgggagt ttggggttag 300

tagatgcaaa ctattacatt tagaatggat aagcaatgag gtcctgctgt atagcacagg 360

gaactatatc caatcacttg tgatagaaca tgatggaaga taatatgaga aaaaatgtat 420

atatatttat actgggtcac tttgctgtac agcagaaatt gaaaatattt aaaaatataa 480

taaataaaaa attaaaaaaa 500

<210>19

<211>500

<212>DNA

<213>猪 (Sus scrofa )

<400>19

atgattggat taggaatgtg gtatatatac acaatggaat actactcagc cataaaaaag 60

aacaaaataa tgccatttgc agcaacatgg atggaactag agactctcat actgagtgaa 120

gtaagtcaga aagagaaaga caaataccat atgatatcac ttatatctgg aatctaatat 180

aggcacaaat gaacctttcc acagaaaaga aaatcatgga cttggagaat agacttgtgg 240

ttgccaaggg ggagggggag ggagtggggt ggattgggag cttggggtta atagatgcaa 300

actattgcct ttggaatgga ttagcaatga gatcctgctg tgtagcactg ggaactatgt 360

ctagtcactt atgatggagc atgataatgt gagaaaatag aatgtgtaca tgtatgtgta 420

actgggtcac catgctgtac agtagaaaaa aaaattgtat tggggaaata actattaaaa 480

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 500

<210>20

<211>500

<212>DNA

<213>猪 (Sus scrofa )

<400>20

catggaaaca acccaaatgt ccatacagat gattggatta ggaagatgtg gtatatatac 60

acaatggaat actactcagc cataaaaaag aacaaataat gccatttgca gcaacatgga 120

tggaactaga gactctcata ctgagtgaat aagtcagaaa gagaaagaca aataccatat 180

gatatcacta tatctggaat ctaatataca gacaaatgaa cctttccaca gaaaagaaaa 240

tcatggactt ggagaataga cttgtggttg cctgggggag gggagggagt gggagggatt 300

gggagcttgg ggttaaggat gcaaactatt gctcttggaa tggatttaca atgagatcct 360

gctgtgtagc actgagaact atgtctagat actaaagcag catgacaatg ggagaaaaaa 420

ttatgtatac atgtatgtgt aactggtccc atgctgtaca gtggaaaaaa aaagtgttaa 480

aaataaaaaa aaaataaaaa 500

<210>21

<211>500

<212>DNA

<213>猪 (Sus scrofa )

<400>21

gcactattca caatagccag acatggaaac aacccaaatg tccatcacag atgattggat 60

tggaagatgt ggtatatata cacaatggaa tactactcag ccataaaaaa atgacataat 120

gccatttgca gcaacatgga tggaactaga gactctcata ctgagtgaaa tgagtcagaa 180

agacaaagac aaataccata tgatatcact tataactgga atctaatatc agcacaaatg 240

aacatttcca cagaaaagaa aatcatggac ttggagaata gacttgtggc tgccggggga 300

gagggaggga gtgggaggga tgggagcttg gggttatgat acaacttgga atggatttac 360

aagagatcct gctgagtagc attgagaact atgtctagat acttatattg caacagaaca 420

aagggtggga aaaaatgtat acatgtaagg taacttggtc cccatgctgt acagtggaaa 480

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 500

<210>22

<211>500

<212>DNA

<213>猪 (Sus scrofa )

<400>22

agacaaaact ttcattcaaa aagatacatg cacctatgtt cattgcagca ctattcacaa 60

tagccaagac atggaaacaa cctaaatgtc catcacagat gaatggatta agaagatgtg 120

gtacatatac acaatggaat actactcagc cataaaaaga acaaaataat gccatttgca 180

gcaacatgga tggaactaga gattctcata ctaagtgaag taagtcagaa agagaaagac 240

aaataccata tgatatcact tatatgtgga atctaaaata tggcacagat gaacctatct 300

acagaaagaa acaactcacg acatggagaa cagacttgtg gttgccaagg gggggaggag 360

tgggatggac tgggagtttg gggttataga tgcaaactat tacatttaga atggataagc 420

aatgagatcc tgctgtatag cacagggaac tatatccaat cacttgtgat ggaacatgat 480

ggaagataat atgaaaaaaa 500

<210>23

<211>500

<212>DNA

<213>猪 (Sus scrofa )

<400>23

aatggattag gaagatgtgg tacatatata caatggaata ctactcagcc ataaaaaagg 60

acaaaataat gccatttgca gcaacatgga tggaactaga gactctcata ctgagtgaag 120

taagtcagaa agagaaagac agacaccata tgatatcact tatatgtgga gtctaaaata 180

tggcacaaat gatctatcta caaaacagaa aagatcatgg acatgtagga cagactcgtg 240

tttgccaggg gggaggggga gggagtggga tggattggga gtctggggtt agtagatgaa 300

aactcttgca tttggagtgg acgggcaatg agatcctgct gtatagcaca gggaactata 360

tatctaatca cttgtgatgg aacatgatgg aggataatgt gagaaaaaga atgtatatat 420

atgtatgact gggtcacttt gctgtacagc agaaattgac agaacattgt aaatcaatca 480

taaaaaattt aaaaaaaaaa 500

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

acttatgaaa agggcattgg a 21

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

taaacctaaa gcaagcagga gga 23

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

aatcccccta ctctgtgtgt aga 23

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ctgtctagca cttggttttc tga 23

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

aaccattttc ttttcccaga ttc 23

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

attcaagctt tagcagtttc tca 23

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

tcttccagtt gtattttaga agca 24

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

atggttgaaa tcatactgca taaa 24

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

agccttgcct ccagttctc 19

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

tacactgttg gtaggaatgt caa 23

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

tctccaccct actgttttcg 20

<210> 35

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

actcaagcct ctcttttaaa tagtctg 27

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

ctgatgagcg taacaatttt ctg 23

<210> 37

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

agtgtatata agcaaggaaa tcagtg 26

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

tgtgtgtggt gaccgtatga 20

<210> 39

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

tacaagcatc ttcctagtgc tg 22

<210> 40

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

atcaaccacc aggaaagaaa tga 23

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

cttcccaagg cttcccaact 20

<210> 42

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

agcactcata atcacaggtt ctg 23

<210> 43

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

accacacaat tctaactgac ttcc 24

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

tccaaatcaa gctccactga 20

<210> 45

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

gtatgtctgt cccttaacca ctg 23

<210> 46

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

taattgataa gccagacttc attaaaa 27

<210> 47

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

aaattcaatt ctaagtggtg tgtgtg 26

<210> 48

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

ccaacaccaa gcaccacac 19

<210> 49

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

caaagggcgg acaatgga 18

<210> 50

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

ttattctttc ttatctcagg gttttg 26

<210> 51

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

ctcctaacta cttcgaaccc tatcc 25

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

gcccacagat tggtgttctc 20

<210> 53

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

ctgagaggac ttctctaaac caaaa 25

<210> 54

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

ttctccttta ctgggttcat tg 22

<210> 55

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

tggagaatcc aattaccaca gc 22

<210> 56

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

aatgaaacgt caaacaacat ttta 24

<210> 57

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

tgactagaaa catgaaaatt acaaaac 27

<210> 58

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

caactgtgac tcaatggtaa tgaa 24

<210> 59

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

atatgtgcag ttttatggca aga 23

<210> 60

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

actaaaaagc aactaaccaa actaaaa 27

<210> 61

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

atcaattctc tccccattgg a 21

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

gctccaggaa ctgtgttggt 20

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

acactgccaa aactcaccat 20

<210> 64

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

cattggtcca cggtagcac 19

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

tccaatcaaa tccctcctga 20

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

cctacactgc agccaaaaca 20

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

gctctgctat tcagccacca 20

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

tggcctgaga aaaatgtgtg 20

<210> 69

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

cattttaggg gtaagcacca a 21

<210> 70

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

cagaagatct gaatcaaatt cccta 25

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 71

ccagatcatc cgtggaatct 20

<210> 72

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 72

aatttccttt ctccccatcc 20

<210> 73

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 73

ttatccagtc ctctgtcaat gg 22

<210> 74

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

tcgtttctgg gttgagtcct 20

<210> 75

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 76

gcttgcttac ccattggttg 20

<210> 76

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 97

gcattcacca accctgtcta a 21

<210> 77

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 77

gccctcatgg agcttacatt 20

<210> 78

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 78

atggaggcat ggaggcttta 20

<210> 79

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 79

tgagagatca ctccacacct g 21

<210> 80

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 80

ccttagggca actatagcaa tg 22

<210> 81

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 81

ccagtcacct ccctttgaac 20

<210> 82

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 82

gcaaagcaga aagacctgaa a 21

<210> 83

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 83

gggagagaaa aggaccaagg 20

<210> 84

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 84

tatggccaca aaagcaaatg 20

<210> 85

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 85

ggggcatgac acacttgata 20

<210> 86

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 86

atctccccag agagggaatc 20

<210> 87

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 87

tcaccaagtc tctgatcatc ttaca 25

<210> 88

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 88

gaaaaatgac cctccccatt 20

<210> 89

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 89

caagtttctg cccatttctc tt 22

<210> 90

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 90

gagagccagg gaaaggactc 20

<210> 91

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 91

gccaaaagaa tcaccctatg a 21

<210> 92

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 92

ctgtgtaacc aagaagccac a 21

<210> 93

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 93

ggacagggaa gggacaattt 20

<210> 94

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 94

ctgcatcctc attaagaatt gg 22

<210> 95

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 95

ccaagaggca ggatgagaag 20

<210> 96

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 96

atggggaagg ggatttacaa 20

<210> 97

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 97

acagtccagg tgctgcctac 20

<210> 98

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 98

gcctcactct ggccctatac 20

<210> 99

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 99

tgcaagccag tgactacagc 20

<210> 100

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 100

cgggaactcc catctcaaat 20

<210> 101

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 101

agacagggtg gccaaaaact 20

<210> 102

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 102

cccatgataa accataatgg aa 22

<210> 103

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 103

ccctggccag actcactaaa 20

<210> 104

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 104

ttgggctgtg agatggaaat 20

<210> 105

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 105

gggttccccc ttaacctttc 20

<210> 106

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 106

cccattgagc tcctaccttg 20

<210> 107

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 107

ccttgtggaa gaagcagatg 20

<210> 108

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 108

gtgcgggatc cctttctc 18

<210> 109

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 109

tcctcttttc tcccgttctg 20

<210> 110

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 110

cctttctcct ccgcagttc 19

<210> 111

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 111

ttctgcccaa taatgtcacg 20

<210> 112

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 112

tctgcccaat aatgtcacga 20

Claims (5)

1.一种基于猪LINE1转座子插入多态性筛选分子标记的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用LINE1的5’端核苷酸序列或3’端核苷酸序列作为查询序列，在生物学公用数据库中对猪公开的基因组进行检索，寻找插入位点；所述LINE1的5’端核苷酸序列是SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.12；所述LINE1的3’端核苷酸序列是SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ IDNo.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22或SEQID No.23；

(2)针对步骤(1)寻找到的LINE1的每个插入位点，分别向上游或下游延伸300-500个核苷酸序列，然后分别下载每条序列；

(3)将步骤(2)获得的序列去除冗余；

(4)根据步骤(3)获得的序列信息设计检测引物，作为待验证分子标记引物，其中使一侧引物位于LINE1插入位点的基因组侧翼序列中，另一侧引物位于LINE1的5’端或3’端核苷酸序列中；

(5)利用步骤(4)所得的待验证分子标记引物PCR扩增不同品种，或同一品种不同个体基因组样品，选取能清晰扩出条带且有多态性的引物组合，获得分子标记。

2.根据权利要求1所述基于猪LINE1转座子插入多态性筛选分子标记的方法，其特征是：所述步骤(1)中，在NCBI、Ensembl或UCSC数据库中对猪公开的基因组进行比对搜索，寻找LINE1在基因组上的插入位点，获得若干序列。

3.根据权利要求1所述基于猪LINE1转座子插入多态性筛选分子标记的方法，其特征是：所述步骤(3)是将获得的序列利用CD-HIT程序按照相似性95％进行合并，去除冗余，最终获得若干基因组位置特异序列。

4.根据权利要求1所述基于猪LINE1转座子插入多态性筛选分子标记的方法，其特征是：所述步骤(4)根据5’端查询下载的序列设计检测引物，使上游引物位于LINE1插入位点的5’端上游侧翼序列中，下游引物位于LINE1的5’端核苷酸序列中，根据3’端查询下载的序列设计检测引物，使上游引物位于LINE1的3’端序列中，下游引物位于LINE1的3’端下游侧翼序列中，最后获得若干待验证分子标记引物。

5.根据权利要求1所述基于猪LINE1转座子插入多态性筛选分子标记的方法，其特征是：所述步骤(5)利用待验证分子标记引物PCR扩增不同品种，或同一品种不同个体基因组样品，选取能清晰扩出条带且有多态性的引物组合，获得分子标记。

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