CN113430285B - 与番鸭繁殖性状相关的分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与番鸭繁殖性状相关的分子标记及应用，属于生物技术领域。本发明公开一种与番鸭繁殖性状相关的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，且SEQ ID NO：1所示序列的rs7092830位点处存在G>T突变，分为GG、TT、GT三种基因型。利用该分子标记检测番鸭的基因组DNA，经过试验发现，DRD2基因外显子序列的4个SNP位点，只有该基因7092830:G>T位点与番鸭的繁殖性状成显著相关。因此，本发明可以准确鉴定不同周龄的番鸭繁殖性状，为分子标记辅助选择育种提供了新的分子标记。

Description

与番鸭繁殖性状相关的分子标记及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种与番鸭繁殖性状相关的分子标记及应用。

背景技术

番鸭又名麝香鸭、瘤头鸭，原产于中、南美洲热带地区，现在我国江、浙、沪、皖、闽等地均有分布。产区群从在每年1～5月份孵化种蛋，按出壳时间先后，将雏鸭分为“头番”(2～3份出壳的雏苗)、“二番”(3～4月份的鸭苗)和“尾番”(5～6月份的鸭苗)。群从多选头、二番发育良好、生长快的鸭子留作种用。但是这种根据时间留种的方法，并不能准确判断繁殖性能的优劣。开产日龄、产蛋合格数和产蛋量等性状是鉴定番鸭的繁殖性能的关键指标。单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)是指基因组DNA序列由于插入、缺失、颠换和转换等单个碱基变化而引起的基因组DNA多态性，具有稳定遗传，易于检测等特性。SNP可用于分子标记辅助选择 (Molecular Mark-assist Selection,MAS)，提高选种准确性和选育效果。

多巴胺(Dopamine,DA)是一种神经递质，在大脑、肾脏、血管和胰腺等器官中发挥重要的作用。多巴胺受体2(Dopamine Receptor 2,DRD2)可通过的促卵泡激素 (Follicle-stimulating hormone,FSH)和促黄体生成素(Luteinizing Hormone,LH)协助生殖激素的分泌。DRD2基因的多个SNP位点与番鸭繁殖性能显著相关。因此，结合番鸭的繁殖性能指标提供一种新的SNP分子标记。

发明内容

本发明的目的是提供一种与番鸭繁殖性状相关的分子标记及应用，以解决上述现有技术存在的问题，发现DRD2基因外显子区的SNP位点，并将其与番鸭的繁殖性状关联分析，为MAS提供新的SNP分子标记。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种与番鸭繁殖性状相关的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，且SEQ ID NO：1所示序列的rs7092830位点处存在G>T突变，分为GG、TT、 GT三种基因型。

本发明还提供一种用于扩增所述的分子标记的引物对，包括如SEQ ID NO：2所示序列的上游引物和SEQ ID NO：3所示序列的下游引物。

本发明还提供包含所述的引物对的鉴别番鸭繁殖性状的试剂盒。

本发明还提供一种鉴别番鸭繁殖性状的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测番鸭基因组DNA，利用权利要求2所述的引物对扩增，获得扩增产物；

(2)对所述扩增产物测序，检测相应SNP位点的基因型。

优选的是，扩增体系为：模板DNA 2μL、金牌Mix 26μL、上游引物2μL、下游引物2μL。

优选的是，反应程序：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸15s，15个循环，每个循环退火温度减1℃；98℃变性10s，50℃退火10s， 72℃延伸15s，25个循环；72℃最终延伸3min；4℃保存。

优选的是，扩增产物测序时，若rs7092830位点为TT基因型，则番鸭35周龄产蛋量、38周龄产蛋量、300日龄产蛋量和45周龄产蛋量高且开产日龄小。

本发明还提供所述的分子标记或者所述的引物对或者所述的试剂盒或者所述的方法在番鸭育种中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过分析DRD2基因，发现该基因外显子区有多个与番鸭繁殖性能显著相关的SNP位点，为MAS提供新的SNP分子标记，并且通过试验验证，该分子标记 7092830：G>T位点与35周龄产蛋量、38周龄产蛋量、300日龄产蛋量、45周龄产蛋量和开产日龄存在显著相关(p<0.05)。其中GG基因型和TT基因型的白番鸭35周龄产蛋量和45周龄产蛋量具有显著差异(p<0.05)，GG/GT基因型和TT基因型白番鸭 38周龄和300日龄产蛋量差异显著(p<0.05)，GG、GT和TT基因型之间开产日龄差异不显著(p>0.05)。其他SNP位点与繁殖性状关联性未达到显著水平(p>0.05)。可见，本申请提供的分子标记可以准确的鉴定白番鸭不同周龄的繁殖性状，以为番鸭的选育提供科学数据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为引物配对位置；

图2为DRD2基因外显子区SNP位点。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例

1、材料与方法

1.1动物样品

选取619只60周龄的雌性白番鸭(广东温氏南方家禽育种有限公司仁马种鸭场)。采集皮下静脉血液2mL，-80℃保存，用作DNA提取样本。记录选择群体的家系信息和开产日龄、每日产蛋量、总产蛋数以及产蛋合格数等繁殖性状。

1.2主要试剂

血样DNA提取试剂盒(品牌：OMEGA；货号：D3392；广州飞扬生物工程有限公司)、金牌Mix(green)(品牌：擎科；货号：TSE101；北京擎科生物科技有限公司)、DNA marker(品牌：诺维赞；货号：MD101；江苏诺维赞生物科技股份有限公司)、高纯度低电渗琼脂糖(品牌：擎科；货号：TSJ001；北京擎科生物科技有限公司)。

1.3实验方法

1.3.1引物设计

根据Ensemble公布的绿头野鸭(Mallard)DRD2基因的序列(ENSAPLG00000009051)，使用NCBI(National Center for Biotechnology InformationSearch database)的Primer-BLAST工具设计引物，由广州擎科生物科技有限公司提供引物合成服务。引物序列相关信息如表1所示，引物在DRD2基因上的配对位置如图1 所示。

表1 PCR扩增引物序列

1.3.2血样DNA提取

参照血样DNA提取试剂盒操作手册提取血样DNA。

1.3.3 DRD2基因外显子序列的PCR扩增

以上述619只半同胞白番鸭(同父本)的血样基因组DNA作为模板，遵循以下反应体系进行：模板DNA 2μL、金牌Mix 26μL、上游引物2μL、下游引物2μL。

反应程序：98℃预变性3min，98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸15s (进行15个循环，每个循环退火温度减1℃)，98℃变性10s，50℃退火10s，72℃延伸15s(进行25个循环)，72℃最终延伸3min，4℃保存。PCR产物交由广州擎科生物科技有限公司进行Sanger测序。

1.3.4 SNPs确定与基因分型

利用Snapgene软件对PCR产物的Sanger测序结果进行序列峰图的分析以确定潜在SNP位点。通过DNAstar 11软件的SeqMan工具比对每个样本的测序数据，进行基因分型。

1.3.5基因型与繁殖性状关联分析

利用Haploview 4.2软件分析DRD2基因的多个SNP位点得到单倍型块内位点，再经PHASE 2.1软件分析单倍型块内位点在619个白番鸭个体中的分布，得到单倍型数据。

SNPs位点与基因型对应个体的繁殖性状数据，采用SAS 9.4GLM程序包进行关联分析。

2、结果

2.1 DRD2基因外显子序列PCR扩增及SNP筛选

选取619只白番鸭个体，以每个个体的血样DNA为模板进行PCR扩增，得到的 PCR产物(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)进行Sanger测序，将测序后的峰图进行比对分析，共检测到4个SNP位点，分别为：rs7092781:C>A，rs7092830:G>T， rs7092925:C>T和rs7093211:C>T，如图2所示。

SEQ ID NO：1：

TCTGTGTTTGCTTGCTATACAGACCAACAGGCTGGACTCGAAAAGGATAAAAACCCCACTAGC ACTAAGGGAAATGCTCTAGAGGATGGTTAGGATGATTCTCCTTCTGGCAGTGCCATCATTTGAG ACCTTTAGTCTAGAGAGAACAAAGTGCTCGAAGGGATCAGTGAACAATCCTGCTTGGCTCAG CATGGGAGTGATGGAGTGCGGCCAGATTCCAGCTGCAACTTGACCATGTTTTCTCTGTTTGCA GGTGGTTGGTGAGTGGAGGTTCAGTCGGATCCACTGTGATATCTTCATGACCCTTGATGTCATG ATGTGCACTGCCAGCATCCTCAACCTCTGTGCCATCAGCATTGACAGGTGAGGGCTCTGTGGC AGCAACCCATGGCCACCTTTACTTGGCCTGGGGGACTCAAAGACTCAAGAAGGGTGACAGCTAGCAGTGCTGAAGTGTTTTAGAAGAGTGATTTAGCGGACAGATGACTTTAAATAGTATAGTAAT AGAAGCTAGCTGCCTTGGAGGCACTGCAGGGCCCAGCCCCAGGTGGTTTGGGCCCTGCCTCA CCAGAGGCTGATGGGGGTGGGTGTTGCCCCCCGCCTTTGCCTACAAAAGTCCCCGGGGAGGG TGGCTCCTGTTGGGAGGGATTGGGTGCCACATGGAGAGCTGATCCCTCTTTGAAGGGAAGTCT GGGGTCTGTGTGGAGTGAAGATACCACCAGGATGCTGCACAGATTGCTGCCTGCTGCTGATCT TCCAGGCAGGTGGGGAGAAAGCTGTGGGCAGAGGAGAATGAAA

2.2 DRD2基因外显子序列SNP位点与繁殖性状的关联分析

对上述4个SNP位点与繁殖性状(总产蛋数、合格产蛋数、35周龄产蛋量、38 周龄产蛋量、300日龄产蛋数、45周龄产蛋量、46周龄产蛋量、59周龄产蛋数和开产日龄)进行关联分析。

如表2所示，结果显示，7092830：G>T位点与35周龄产蛋量、38周龄产蛋量、 300日龄产蛋量、45周龄产蛋量和开产日龄存在显著相关(p<0.05)。其中，GG基因型和TT基因型的白番鸭35周龄产蛋量和45周龄产蛋量具有显著差异(p<0.05)，GG/GT 基因型和TT基因型白番鸭38周龄和300日龄产蛋量差异显著(p<0.05)，GG、GT和 TT基因型之间开产日龄差异不显著(p>0.05)。其他SNP位点与繁殖性状关联性未达到显著水平(p>0.05)。

表2 SNP位点与繁殖现状关联

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 与番鸭繁殖性状相关的分子标记及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 798

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tctgtgtttg cttgctatac agaccaacag gctggactcg aaaaggataa aaaccccact 60

agcactaagg gaaatgctct agaggatggt taggatgatt ctccttctgg cagtgccatc 120

atttgagacc tttagtctag agagaacaaa gtgctcgaag ggatcagtga acaatcctgc 180

ttggctcagc atgggagtga tggagtgcgg ccagattcca gctgcaactt gaccatgttt 240

tctctgtttg caggtggttg gtgagtggag gttcagtcgg atccactgtg atatcttcat 300

gacccttgat gtcatgatgt gcactgccag catcctcaac ctctgtgcca tcagcattga 360

caggtgaggg ctctgtggca gcaacccatg gccaccttta cttggcctgg gggactcaaa 420

gactcaagaa gggtgacagc tagcagtgct gaagtgtttt agaagagtga tttagcggac 480

agatgacttt aaatagtata gtaatagaag ctagctgcct tggaggcact gcagggccca 540

gccccaggtg gtttgggccc tgcctcacca gaggctgatg ggggtgggtg ttgccccccg 600

cctttgccta caaaagtccc cggggagggt ggctcctgtt gggagggatt gggtgccaca 660

tggagagctg atccctcttt gaagggaagt ctggggtctg tgtggagtga agataccacc 720

aggatgctgc acagattgct gcctgctgct gatcttccag gcaggtgggg agaaagctgt 780

gggcagagga gaatgaaa 798

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cttgcactcc catgtctc 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgccttgaa gtctttcc 18

Claims (6)

1.一种与番鸭繁殖性状相关的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，且SEQ ID NO：1所示序列的第113位处存在G>T突变，分为GG、TT、GT三种基因型。

2.一种鉴别番鸭繁殖性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测番鸭基因组DNA，利用引物对扩增，获得扩增产物；所述引物对包括如SEQID NO：2所示序列的上游引物和SEQ ID NO：3所示序列的下游 引物；

(2)对所述扩增产物测序，检测相应SNP位点的基因型；所述SNP位点为SEQ ID NO：1所示序列的第113位处存在G>T突变，所述SNP位点与番鸭的产蛋量相关。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，扩增体系为：模板DNA 2μL、金牌Mix 26μL、上游引物2μL、下游引物2μL。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，反应程序：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸15s，15个循环，每个循环退火温度减1℃；98℃变性10s，50℃退火10s，72℃延伸15s，25个循环；72℃最终延伸3min；4℃保存。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，扩增产物测序时，若SEQ ID NO：1所示序列的第113位为TT基因型，则番鸭35周龄产蛋量、38周龄产蛋量、300日龄产蛋量和45周龄产蛋量高且开产日龄小。

6.如权利要求1所述的分子标记或者权利要求2所述的方法在番鸭育种中的应用。

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