CN108866206A

CN108866206A - 与绵羊多羔相关的snp分子标记及其应用

Info

Publication number: CN108866206A
Application number: CN201810847318.1A
Authority: CN
Inventors: 储明星; 胡文萍; 梁奔梦; 董新龙; 刘秋月; 狄冉; 王翔宇; 汤继顺; 郭晓飞; 魏彩虹
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2018-07-27
Filing date: 2018-07-27
Publication date: 2018-11-23
Anticipated expiration: 2038-07-27
Also published as: CN108866206B

Abstract

本发明提供与绵羊产羔相关的SNP分子标记及其应用，该分子标记位于绵羊第12号染色体第55865867位(NW_014639021.1)，是Pappa2基因SNP标记。本发明提供了用于检测该SNP标记的特异性引物组合，特异性引物组合的序列如SEQ ID NO.1‑3所示，基于Sequenom

Description

与绵羊多羔相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及与中国山羊产奶性状相关的SNP分子标记、以及检测中国山羊产奶性状的方法。

背景技术

产羔数性状是绵羊最重要的经济性状之一，因其受微效多基因控制且遗传力低，难以用常规育种方法来快速改良，而分子技术能有效快速地提高其遗传进展，因此鉴定与产羔数相关的主效基因或分子遗传标记是现代分子育种的关键。

2001年，Michael T.Overgaard等在JBC发表文章称，他们在哺乳动物细胞中表达了重组的PAPP-A2，发现重组的PAPP-A2蛋白的1558个氨基酸残基的多肽是由1791个氨基酸残基的前蛋白原(prepro-protein)加工而来的。和PAPP-A不同，PAPP-A2在非还原的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中是以一个大概220kDa的单体迁移。PAPP-A2的前体和PAPP-A是不同源的，但是成熟的PAPP-A2和PAPP-A有45％的氨基酸残基相同。PAPP-A可以特异性地剪切胰岛素样生长因子结合蛋白4(Insulin-like Growth Factor-binding Protein-4，IGFBP-4)。IGFBP-4是6个已知的胰岛素生长因子IGF-I和IGF-II的调节因子之一。Overgaard等的研究发现PAPP-A2可以特异性地剪切胰岛素样生长因子结合蛋白5(Insulin-like GrowthFactor-binding Protein-5，IGFBP-5)在Ser-142和Lys-144之间的一个位点，从而使得IGFI和IGFII产生活性，该基因和生长以及繁殖相关性状有紧密联系。，PAPP-A2很有可能是IGFBP-5在很多组织中的候选蛋白酶。

2014年，研究发现，Pappa2基因通过IGFBP-5信号通路发挥功能.2015年，Christians J K等人在小鼠中发现pappa2基因敲除后，IGFBP-5在卵巢中的表达量显著增加，同时有研究指出在小鼠中IGFBP-5和卵泡发育密切相关。

2004年，Conover et al.研究发现Pappa2基因敲除小鼠的体型大小是野生型小鼠的60％。2010年，Nyegaard et al等人揭示了Pappa2基因敲除小鼠的卵巢功能和繁殖力都有所下降。

2011年，Cheryl A.Conover获得了Pappa2基因双敲除的小鼠，检测了在野生型小鼠中PAPP-A2的mRNA的组织特异性表达，且鉴定了缺失PAPP-A2的小鼠的表型。PAPP-A2在组织中的表达和PAPP-A并不相关。研究发现在胎盘中有最高水平的PAPP-A2的表达，在胚胎、骨骼肌、繁殖相关组织中也有高水平的PAPP-A2的表达。纯合的Pappa2基因敲除小鼠在出生时大小正常。但是，出生后的生长速度却比正常小鼠更迟缓。雄性的双敲小鼠的体重较正常小鼠降低了10％，雌性双敲小鼠体重降低了25-30％。双敲的成年小鼠的股骨长和体长也变短了。Pappa2的敲除会影响动物幼崽的体重和骨骼发育情况。并且研究发现和野生型相比，Pappa2基因敲除的小鼠虽然也可以繁殖，但是产仔数和野生型比更少，第一次产仔时间和胎次间隔时间也更长，也就是说Pappa2基因敲除后小鼠的繁殖力下降。

同年，在荷斯坦奶牛上发现Pappa2基因和奶牛的繁殖健康有关，并且鉴定出了一个SNP和奶牛的繁殖性状和生产性状相关。

2009年一些研究发现，对于人类妊娠高血压的患者，血清中Pappa2基因的表达水平升高，可能是导致死胎的原因，Pappa2和人的生殖密切相关。

基于Pappa2基因在小鼠，奶牛和人上的研究发现，推测PAPP-A2应该也是与哺乳动物繁殖力相关的一个很重要的因子。

因此，申请人试图在绵羊上开展Pappa2基因的功能研究。对它们在多态性、组织表达与绵羊繁殖性能相关性方面进行研究，这将为进一步阐明绵羊多羔性状的分子遗传学机制提供较好的科学思路。

目前关于Pappa2基因在绵羊繁殖过程中的具体作用研究几乎没有，因此，对其进行研究有助于挖掘出更多与绵羊产羔数相关的分析标记。传统的基因型检测方法，大多采用PCR-RFLP(polymerase chain reaction-restriction fragment lengthpolymorphism)和PCR-SSCP(polymerase chain reaction-single strand conformationpolymorphism)检测方法，这些方法通量较低，程序繁多，较难实现高通量自动化测定。

发明内容

本发明的目的是提供一种与绵羊多羔相关的SNP分子标记及其应用，并提供了一种利用SequenomSNP技术检测绵羊Pappa2基因型的方法。

本发明的技术方案如下：

本申请通过对10个绵羊品种99个绵羊个体进行全基因组重测序并将其分为单羔组和多羔组。在99个绵羊的重测序结果中通过Fst值计算获得了大量的有效SNP位点并筛选获得一些基因，其中包括Pappa2基因。然后在5个绵羊品种中做了基因分型，并且在380只小尾寒羊中做了产羔数的关联分析，发现与产羔数相关。进一步克隆了这个基因，并做了组织表达谱和表达量的分析，并做了生物信息学分析。

本发明首先提供一种与绵羊多羔相关的SNP分子标记，其含有一个与绵羊多羔相关的SNP位点，该位点位于绵羊第12号染色体55865867bp位点(NW_014639021.1，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v4.0，2015年11月)，该位点的碱基存在C/G突变，与绵羊多羔具有显著的相关性。

基于此，本发明提供一种检测绵羊多羔候选基因Pappa2基因型的方法，通过对绵羊第12号染色体55865867bp位点(NW_014639021.1，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v4.0，2015年11月)的核苷酸进行单核苷酸型检测，根据检测结果判定绵羊Pappa2基因为AA、CA或CC。本发明利用SequenomSNP技术实现单核苷酸型检测。

本发明首先提供用于检测绵羊Pappa2基因型或上述SNP分子标记的特异性引物组合：

上游引物F：

5’-ACGTTGGATGTTTGGCTGCTTACTCCCTTC-3’；

下游引物R：

5’-ACGTTGGATGGTTTGCACATCATACCGTCC-3’；

延伸引物的核苷酸序列如下：

S1：5’-AGATTTACCAGAGCACC-3’。

本发明提供含有所述特异性引物组合的用于SequenomSNP技术检测绵羊Pappa2基因型的试剂盒。

进一步地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、标准阳性模板和SAP酶。

本发明提供了上述SNP分子标记或特异性引物组合或含有该特异性引物组合的试剂盒在绵羊分子辅助育种中的应用。

本发明提供了上述SNP分子标记或特异性引物组合或含有该特异性引物组合的试剂盒在鉴定绵羊多羔性状中的应用。

本发明提供的利用SequenomSNP技术检测绵羊Pappa2基因型的方法，包括以下步骤：

1)提取待测绵羊的基因组DNA；

2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用上游引物F和下游引物R，进行PCR扩增反应；上游引物F：

5’-ACGTTGGATGTTTGGCTGCTTACTCCCTTC-3’；

下游引物R：

5’-ACGTTGGATGGTTTGCACATCATACCGTCC-3’；

3)用SAP酶对PCR扩增产物进行消化；

4)以消化后的PCR扩增产物为模板，利用延伸引物进行延伸反应；所述延伸引物序列为：5’-AGATTTACCAGAGCACC-3’；

5)分析延伸产物，从而对绵羊Pappa2基因型进行判定。

其中，步骤2)中PCR扩增反应使用的反应体系以5μL计为：20-50ng/μL基因组DNA 1μL，10×PCR反应缓冲液0.5μL，25mmol/L MgCl₂ 0.4μL，25μmol/L dNTPs 0.1μL，PCRPrimer mix 1μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，去离子水补齐至5μL；

PCR扩增反应的扩增程序为：95℃2min；95℃30s，56℃30s，72℃60s，45个循环；72℃5min。

步骤3)中对PCR扩增产物进行消化，使用的SAP酶消化体系以2μL计为：SAP Buffer0.17μL，SAP Enzyme 0.3μL，去离子水补齐至2μL。

反应条件为：37℃40min，85℃15min，25℃保存。

步骤4)中延伸反应体系以2μL计为：iplex Buffer 0.2μL，Terminator mix 0.2μL，Extend primer mix 0.94μL，iplex Enzyme 0.041μL，去离子水补齐至2μL；

延伸反应条件为：94℃30s；[94℃5s，(52℃5s，80℃5s)5个内部循环]，40个外部循环；72℃3min。

优选地，本发明采用质谱检测法分析延伸产物。

本发明进一步提供前述方法在绵羊分子标记辅助育种中的应用。

SequenomSNP技术的基本原理为：首先使用引物扩增目标SNPs所在片段，在扩增产物中加入SAP酶消化掉反应体系中的引物序列和剩余的dNTPs，然后对待检位点同时进行单碱基延伸，位点特异性的延伸引物将在突变位点处延伸一个碱基并终止。延伸引物将根据突变类型的差异而连接上不同的ddNTPs，形成分子量差异。延伸产物在经过树脂纯化后，将点样至靶片上，并使用质谱仪对不同延伸产物的分子量差异进行检测，通过数据分析，就可得到各突变位点的具体基因型。针对绵羊Pappa2基因第12号染色体上第55865867bp位点的单核苷酸型检测，根据测序结果判定为CC、CG或GG是。

本发明提供的利用SequenomSNP技术检测绵羊Pappa2基因型的方法，该技术更灵敏，准确性更高，性价比更高，能同时对数百至数千份样本中数十到数百个SNP位点进行检测。利用本方法可对Pappa2基因的SNP位点实现自动化检测，可以将具有高产羔数性状的CG杂合个体和CC纯合个体选留下来，从而提高绵羊的繁殖力，对绵羊大规模分子育种具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中利用SequenomSNP技术对Pappa2基因的三种基因型，即CC、CG或GG的检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1与绵羊产羔相关的SNP分子标记的鉴定

通过对10个绵羊品种99个绵羊个体进行全基因组重测序，包括藏系绵羊三个品种(山谷型藏羊、草原型藏羊、欧拉羊)、6个蒙古系绵羊(小尾寒羊、乌珠穆沁、滩羊、湖羊、策勒黑羊和巴音布鲁克)和1个欧洲绵羊(澳洲美利奴)，获得了迄今为止最大数量的绵羊基因组遗传多态位点，分析了这些绵羊群体的遗传多样性和群体遗传结构，筛选了与高原适应性、脂肪代谢、多羔以及季节性发情相关基因。并通过Fst值计算获得了大量的有效SNP位点并筛选获得一些基因，其中包括与绵羊产羔相关的Pappa2基因的SNP位点。发现Pappa2基因位于第12号染色体55865867bp位点(NW_014639021.1，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v4.0，2015年11月)的碱基存在C/G突变，与绵羊多羔具有显著的相关性。具体检测方法见实施例2。

实施例2利用SequenomSNP技术检测绵羊Pappa2基因型并预测经产母羊窝平均产羔数的方法

1、实验材料

选取378只小尾寒羊绵羊为检测对象。

分型样品选择

2、试剂及仪器

试剂：Complete Genotyping Reagent Kit forCompact 384；

基因扩增：ABI9700 384Dual；

质谱点样：MassARRAY NanodispenserRS1000；

质谱分析：MassARRAY Compact System；

所有试剂和仪器均购自北京君诺德生物技术有限公司(Beijing GenenodeBiotech Co.，Ltd)。

3、基因组DNA的提取

绵羊颈静脉采血1mL，用EDTA抗凝处理。首先红细胞裂解液裂解去除不含DNA的红细胞，细胞核裂解液裂解包细胞释放出基因组DNA，然后蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白，最后纯净的基因组DNA通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液。

4、SequenomSNP技术进行基因分型

针对绵羊第12号染色体55865867bp位点(NW_014639021.1，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v4.0，2015年11月)设计引物组合。

PCR扩增引物的核苷酸序列如下：

上游引物F：5’-ACGTTGGATGTTTGGCTGCTTACTCCCTTC-3’

下游引物R：5’-ACGTTGGATGGTTTGCACATCATACCGTCC-3’

延伸引物序列及延伸产物如表1所示。

表1延伸引物序列及延伸产物

上述引物由君诺德公司合成。

检测流程如下：

1、提取待测绵羊的基因组DNA；

2、以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用上游引物F和下游引物R进行PCR扩增反应；

3、用SAP酶对PCR扩增产物进行消化；

4、以消化后的PCR扩增产物为模板，利用所述延伸引物S1进行延伸反应；

5、分析延伸产物，从而对绵羊HIRA基因型进行判定。

其中，PCR扩增反应使用的反应体系以5μL计为：20-50ng/μL基因组DNA 1μL，10×PCR反应缓冲液0.5μL，25mmol/L MgCl₂ 0.4μL，25μmol/L dNTPs 0.1μL，PCR Primer mix 1μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，去离子水补齐至5μL；

对PCR扩增产物进行消化，主要是用SAP酶去除反应产物中的剩余引物和dNTP。使用的SAP酶消化体系以2μL计为：SAP Buffer 0.17μL，SAP Enzyme 0.3μL，去离子水补齐至2μL。

反应条件为：37℃40min，85℃15min，25℃保存。

延伸反应体系以2μL计为：iplex Buffer 0.2μL，Terminator mix 0.2μL，Extendprimer mix 0.94μL，iplex Enzyme 0.041μL，去离子水补齐至2μL；

将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上，进行MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)反应，利用Typer 4.0软件检测质谱峰，并根据质谱峰图判读各样本目标位点基因型。

经质谱分析得到PCR扩增产物大小为133bp，延伸产物的质谱检测结果如图1所示。

统计结果：

对绵羊第12号染色体上第55865867bp位点在小尾寒羊群体中的分布情况进行了分析，计算了各位点不同基因型在小尾寒羊群体中的基因型频率和基因频率。分析统计结果见表2。

表2待测绵羊第12号染色体上第55865867bp位点不同基因型分析统计

对绵羊第12号染色体上第55865867bp位点在小尾寒羊中的基因型频率和等位基因频率分别进行了统计，并计算了这个位点在各群体中的多肽信息含量、杂合度和有效等位基因数，并用卡方检验检测该位点在各群体中的平衡状态，结果见表3。

表3第12号染色体上第55865867bp位点在小尾寒羊中的群体遗传学分析

注：P>0.05表示位点在该品种中处于哈代温伯格平衡状态；P<0.05表示位点在该品种中不处于哈代温伯格平衡状态。

从表3可知，绵羊第12号染色体上第55865867bp位点在小尾寒羊中表现为低度多态(PIC<0.25)。卡方适合性检验结果表明，该位点在小尾寒羊中处于哈代温伯格平衡状态(P>0.05)。

待测绵羊第12号染色体上第55865867bp位点不同基因型与小尾寒羊产羔数关联分析统计结果见表4。

表4待测绵羊第12号染色体上第55865867bp位点不同基因型与小尾寒羊产羔数关联分析

有上述分析可得出绵羊第12号染色体上第55865867bp不同基因型与小尾寒羊不同胎次产羔数之间存在显著关联(P<0.05)。而整体来说，在不同胎次CC型产羔数均大于GG型，但与CG型差异不显著。而小尾寒羊是多羔品种，产羔数平均在2左右。以小尾寒羊第三胎为例，CC型的平均产羔数为3.40±0.36只，而GG型的平均产羔数为2.29±0.07只，CC型比GG型产羔数提高了近1.11只。

上文虽然已对本发明以及其实施方式做了详尽的描述，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以对相应的条件等做一些改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 与绵羊多羔相关的SNP分子标记及其应用

<130> KHP181111481.6

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acgttggatg tttggctgct tactcccttc 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acgttggatg gtttgcacat cataccgtcc 30

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agatttacca gagcacc 17

Claims

1.一种与绵羊多羔相关的SNP分子标记，其特征在于，位于绵羊第12号染色体第55865867bp处，该SNP分子标记的多态性为C/G。

2.用于检测权利要求1所述SNP分子标记的特异性引物组合，其特征在于，包括：

上游引物F：

5’-ACGTTGGATGTTTGGCTGCTTACTCCCTTC-3’；

下游引物R：

5’-ACGTTGGATGGTTTGCACATCATACCGTCC-3’；

延伸引物的核苷酸序列如下：

S1：5’-AGATTTACCAGAGCACC-3’。

3.基于SequenomSNP技术用于检测绵羊Pappa2基因型的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的特异性引物组合。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、标准阳性模板和SAP酶。

5.权利要求1所述SNP分子标记或权利要求2所述的特异性引物组合或权利要求3所述的试剂盒在绵羊分子辅助育种中的应用。

6.权利要求1所述SNP分子标记或权利要求2所述的特异性引物组合或权利要求3所述的试剂盒在鉴定绵羊多羔性状中的应用。

7.利用SequenomSNP技术检测绵羊Pappa2基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测绵羊的基因组DNA；

2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用上游引物F和下游引物R，进行PCR扩增反应；所述上游引物F：5’-ACGTTGGATGTTTGGCTGCTTACTCCCTTC-3’；下游引物R：5’-ACGTTGGATGGTTTGCACATCATACCGTCC-3’；

3)用SAP酶对PCR扩增产物进行消化；

4)以消化后的PCR扩增产物为模板，利用延伸引物进行延伸反应；所述延伸引物为5’-AGATTTACCAGAGCACC-3’；

5)分析延伸产物，从而对绵羊Juno基因型进行判定。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2)中PCR扩增反应使用的反应体系以5μL计为：20-50ng/μL基因组DNA 1μL，10×PCR反应缓冲液0.5μL，25mmol/L MgCl₂ 0.4μL，25μmol/L dNTPs 0.1μL，PCR Primer mix 1μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，去离子水补齐至5μL；

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤3)中对PCR扩增产物进行消化，使用的SAP酶消化体系以2μL计为：SAP Buffer 0.17μL，SAP Enzyme 0.3μL，去离子水补齐至2μL；

反应条件为：37℃40min，85℃15min，25℃保存。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤4)中延伸反应体系以2μL计为：iplexBuffer 0.2μL，Terminator mix 0.2μL，Extend primer mix 0.94μL，iplex Enzyme 0.041μL，去离子水补齐至2μL；延伸反应条件为：

(1)94℃30s；

(2)94℃5s，

(3)5个内部循环：52℃5s，80℃5s；

步骤(2)-(3)一共40个外部循环；72℃3min。