CN111979337A

CN111979337A - 一种羊多胎性状分子标记及其应用

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Publication number: CN111979337A
Application number: CN202010907183.0A
Authority: CN
Inventors: 刘学峰; 张立春; 李信涛; 海龙; 李旭业; 郭立宏; 姜明生; 王嘉厚; 吴宪; 郝彩虹; 杜军; 吕雄杰; 孙继权; 穆文利; 王�锋; 尤海洋; 李莉; 郭文凯; 杨淑萍; 刘丽秋
Original assignee: Individual
Current assignee: Animal Husbandry and Veterinary Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-09-02
Filing date: 2020-09-02
Publication date: 2020-11-24
Anticipated expiration: 2040-09-02
Also published as: CN111979337B

Abstract

本发明属于分子生物学和分子育种领域。具体地，本发明提供了小尾寒羊BMP2基因上与多胎性状相关的SNP分子标记，所述分子标记的检测方法以及该方法在提高绵羊繁殖性能以及多胎品种培育中的应用。所述分子标记为BMP2基因外显子2第76位的多态性位点，记作C76T。经统计分析可知，分子标记C76T与多胎性状显著相关，且等位基因T具有明显的加性效应。因此，在繁殖培育绵羊的过程中可以通过该SNP分子标记辅助选择繁殖力高的CT型或TT型个体，从而加速绵羊繁殖性能的育种进程。

Description

一种羊多胎性状分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学和分子育种领域。具体地，本发明提供了小尾寒羊BMP2基因与多胎性状相关的SNP分子标记，所述分子标记的检测方法以及该方法在提高绵羊繁殖性能以及多胎品种培育中的应用。

背景技术

繁殖性能是绵羊的重要经济性状，尤其是在当今绵羊育种方向从过去的单一毛用、毛肉兼用向肉毛兼用或肉用的转移过程中，追求较高的产羔率以及较多的胎产羔数具有重大的经济意义。绵羊的繁殖性能高低主要受多胎性、受胎率和成活率三个因素的影响，其中以多胎性的变量最大。绵羊属单胎哺乳类动物，但某些绵羊品种却具有稳定的多胎性能，如中国的湖羊、小尾寒羊以及澳洲的Booroola美利奴羊、芬兰兰德瑞斯羊、罗曼诺夫羊等品种。但由于绝大多数绵羊品种产单羔，少数双羔，这极大地影响了母羊胎产羔数这一绵羊生产最重要的繁殖指标。通过对多胎性的研究，可大大提高繁殖性能，进一步提高养羊业的经济效益。然而，多胎性是一个复杂的性状，受基因、年龄、季节和营养等因素的影响。因此，研究多胎性需要采用繁殖学、环境卫生条件、饲养管理条件、育种的杂交选择和基因工程等研究手段。

DNA分子标记技术的迅猛发展，为人们在分子水平上研究绵羊多胎性状的遗传机理奠定了基础。关于绵羊产羔性状的研究不断深入，研究人员陆续发现骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)受体1B (BMP receptor 1B, BM-PR1B)、骨形态发生蛋白15 (BMP15)以及生长分化因子9 (growth differentiation factor 9, GDF9)等基因是影响绵羊产羔数的主效基因。上述3 个基因都是转化生长因子-β(transforming growthfactor-β, TGF-β)超家族最大的亚家族BMP 家族中的重要基因。BMP家族广泛作用于绵羊卵巢细胞(卵泡, 黄体, 卵母细胞和颗粒细胞)，并通过旁/自分泌对卵泡发育发挥重要调节作用。

在绵羊多胎性主效基因或DNA分子标记研究的基础上所提出的分子标记辅助选择，被认为是提高绵羊繁殖力最具应用前景的育种改良方法。由于分子标记辅助选择不易受环境因素的影响，且没有性别、年龄的限制，可早期进行选择，因而能够缩短世代间隔，提高选择强度，进而提高选择效率和准确性。

小尾寒羊是我国肉毛兼用型绵羊品种，具有生长发育快、早熟、繁殖力强、性能遗传稳定、适应性强的特点，被国家定为名畜两种。小尾寒羊一般2年可生3胎，每胎3-4只，多的可达7-8只，属于典型的具有多胎性状的绵羊品种，因此被广泛用于多胎性状的研究。目前，尚未有研究报道骨形态发生蛋白2(BMP2)存在与小尾寒羊多胎性相关的分子标记。

发明内容

本发明的目的在于提供一种绵羊多胎性状分子标记及其在品种培育中的应用。具体地，本发明提供了小尾寒羊BMP2基因与多胎性状相关的SNP分子标记，所述分子标记的检测方法以及该方法在提高绵羊繁殖性能以及多胎品种培育中的应用。

一方面，本发明提供了与绵羊多胎性状相关的分子标记，其对应于BMP2基因的SNP位点；进一步地，所述SNP位点具体为BMP2基因外显子2第76位的多态性位点。进一步地，所述分子标记的SNP位点如SEQ ID NO:1所示，其中第76位核苷酸为C或T，记作C76T；

进一步地，所述绵羊为小尾寒羊；

进一步地，所述BMP2基因为GenBank登录号NC_040264.1所示（Gene ID:101117688）

另一方面，本发明提供了用于检测绵羊多胎性状分子标记C76T的引物，其含有如下所述的核苷酸序列：

上游引物F：5’-TTCTAGCGTTGCTGCTTCCC-3’（SEQ ID NO：2）；

下游引物R：5’-TTCGTGGTGAAAGCTGCG-3’（SEQ ID NO：3）。

另一方面，本发明提供了包含所述鉴定绵羊多胎性分子标记的试剂盒，所述试剂盒包含如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物对；

另一方面，本发明提供了上述分子标记、引物以及试剂盒在鉴定和/或培育多胎绵羊品种中的应用；进一步地，所述绵羊品种包括但不限于小尾寒羊、湖羊、杜泊羊、考力代羊、美利奴羊、兰德瑞斯羊、罗曼诺夫羊。优选地，所述绵羊品种为小尾寒羊。

另一方面，本发明提供了一种检测绵羊多胎性状的方法，包括如下步骤：检测绵羊多胎性状分子标记C76T处的单核苷酸种类。进一步地，所述方法还包括利用如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物对扩增目的片段的步骤；进一步地，所述方法还包括鉴定所述PCR产物第47位的单核苷酸种类；进一步地，所述鉴定方法为测序或PCR-RFLP。进一步地，所述绵羊品种包括但不限于小尾寒羊、湖羊、杜泊羊、考力代羊、美利奴羊、兰德瑞斯羊、罗曼诺夫羊。优选地，所述绵羊品种为小尾寒羊。

另一方面，本发明提供了一种绵羊育种改良的方法；所述改良为提高绵羊的繁殖力，所述繁殖力具体为多胎性；所述方法包括确定绵羊核心群分子标记C76T处的单核苷酸种类，选择基因型为TT或CT的个体作为种羊进行繁殖，从而提高羊群后代的繁殖力。进一步地，所述绵羊品种包括但不限于小尾寒羊、湖羊、杜泊羊、考力代羊、美利奴羊、兰德瑞斯羊、罗曼诺夫羊。优选地，所述绵羊品种为小尾寒羊。

本发明的方法和试剂盒可与其他分子生物学品种培育方法或传统品种培育方法联合使用。

本发明的方法和试剂盒筛选出的种羊可用于自然交配和人工授精的品种培育方法。

本发明的有益效果在于：发现了与绵羊多胎性状相关的分子标记C76T，并提供了能够用于检测所述分子标记的引物对或试剂盒以及相应的检测方法，可以快速准确地鉴定绵羊的基因型，从而建立高效的分子标记辅助选择育种技术，用于绵羊多胎性状的改良，加快育种进程，促进养羊业经济效益的提高。

附图说明

图1为限制性内切酶NaeI切割包含分子标记C76T的PCR产物的示意图。

图2为PCR-RFLP法鉴定基因型的部分电泳结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详述，但本发明的实施方式不仅限于实施例。

实施例1 小尾寒羊BMP2基因多态性位点的发现

实验对象选自申请人自有养殖场内的健康、有完整产羔记录的小尾寒羊300只，颈静脉抽血2ml，抗凝处理，-20℃保存待用。

（1）基因组DNA的提取。基因组DNA使用天根生化科技有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒提取，经1%琼脂糖凝胶电泳检测无拖尾或弥散现象。用紫外分光光度计对DNA进行检测，A260/280比值在1.8-2.0范围内，A260/230比值在1.7-1.9范围内，样品质量合格。稀释样品至50ng/μl，于-20℃冻存。

（2）BMP2基因的外显子测序。随机选择20个小尾寒羊DNA样本构建池DNA用于外显子测序。以NCBI GenBank数据库上绵羊（Ovis aries）BMP2基因的基因组DNA序列（登录号：NC_040264.1）为模板。BMP2基因位于绵羊第13号染色体上，DNA序列全长12564bp。该基因包含三个外显子（1-1161，2348-2697，10594-12564），编码区包含1188bp，编码蛋白质由396个氨基酸组成。根据该基因的外显子序列共设计5对能够覆盖全部外显子区域的引物用于序列扩增，将PCR扩增产物进行测序。以上涉及分子生物学实验部分委托北京微阅基因技术有限公司进行。将测序结果与GenBank上登录号为NC_040264.1的基因组DNA序列进行比对，发现外显子2序列的第76位存在一个单核苷酸突变位点（C>T），该单核苷酸突变为错义突变，导致BMP2蛋白第23位甘氨酸突变为半胱氨酸（Gly>Cys）。BMP2基因外显子2的DNA序列如SEQID NO：1所示，其中下划线处第76位存在单核苷酸突变（C>T），记作C76T：

gtcgaccatggtggccgggacccgctgtcttctagcgttgctgcttccccaggtcctcctgggcggcgcggccggcctcattcccgagctgggccggaggaagttcgcggcgtctgctggccgctcctcatcccagccttcggacgaagtcctgagcgagttcgagttgcggctgctcagcatgttcggcctgaagcagagacccacccccagcagggacgccgtggtgcccccctacatgctggacttgtaccgccagcactcgggccaacccggtgcgcccgccccggaccaccggctggagagggcagccagcctcgccaacacagtgcgcagctttcaccacgaag（SEQ ID NO：1）

实施例2 多态性位点的基因型频率和等位基因频率

（1）PCR扩增包含突变位点的BMP2外显子2的DNA片段。利用Primer Premier 5.0设计引物扩增包含突变位点的DNA片段并进行限制性内切酶位点分析。上游引物F：5’-TTCTAGCGTTGCTGCTTCCC-3’（SEQ ID NO：2）；下游引物R：5’-TTCGTGGTGAAAGCTGCG-3’（SEQID NO：3）。PCR反应体系：10μl体系中含模板1μl，上、下游引物各0.2μl，5μl Taq DNA聚合酶，剩余为milli-Q水；PCR反应程序：94℃预变性2min，35个循环（94℃变性30s，60℃退火30s，71℃延伸30s），71℃后延伸5min，4℃保存待用。该PCR产物为320bp的DNA片段（SEQ IDNO:4），其中第47位为单核苷酸突变位点（C>T）。经分析，该突变位点导致原来存在的限制性内切酶NaeI（GCC丨GGC）位点消失，图1为NaeI切割非突变和突变PCR产物的示意图。

（2）PCR-RFLP法检测基因型。PCR-RFLP方法基于PCR技术，PCR特异性扩增包含突变位点的DNA，经特定限制性内切酶酶切后，再利用琼脂糖凝胶电泳分子酶切产物，通过电泳行为的改变区分变异样本以及鉴定基因型。对PCR产物进行酶切，酶切体系：10μl体系含10×Buffer 1μl，NaeI酶（5U/μl，宝生物）1μl，PCR产物5μl，剩余为milli-Q水。37℃水浴30min。使用3%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物（44/276,44/276/320,320bp）用于基因分型（CC,CT,TT），图2为部分样本电泳结果。

（3）基因型分析

经统计，300只小尾寒羊BMP2外显子2第76位个单核苷酸突变位点（C>T）的基因型频率和等位基因频率见表1：

表1：基因型频率和等位基因频率

利用SPSS进行卡方检验，结果表明小尾寒羊羊群在两个多态性位点处于Hardy-Weinberg 平衡状态（P>0.05）。其中，T为优势等位基因。

实施例3不同基因型与多胎性状的关联性分析

采用SPSS 2.0统计分析软件中的GLM(General LinearModel)程序配合构建的单位点效应模型对所述分子标记位点进行统计分析，采用LSD和Dunnett’sT3法进行均数间的多重比较，研究胎次和基因型对多胎性状的影响，统计分析所用的线性模型如下：

y_jkl＝μ+P_j+G_k+e_jkl

其中：y_jkl为个体产羔数记录值；μ为群体平均值；P_j为第j个胎次的固定效应；G_k为第k种基因型的固定效应；e_jkl为随机残差效应。所有数据均用平均值±标准差(Mean±SD)的形式呈现,表2显示了BMP2外显子2上分子标记C76T的基因型与平均产羔数之间的关系。

表2. 基因型与多胎性状的关联性

注：^*表示平均值间差异显著（P＜0.05）

由上表可以看出，TT型小尾寒羊每只平均产羔数较CC型和CT型分别增加1.44只(P＜0.05)和0.59只（P<0.05），CT型较CC型增加0.85只（P＜0.05），TT基因型具有明显的加性效应，等位基因T对等位基因C的显性度为0.18，可见BMP2外显子2 上的SNP分子标记C76T与多胎性状显著相关，且等位基因T具有明显的加性效应。

实施例4 BMP2基因SNP分子标记在选育多胎型小尾寒羊中的应用

BMP2基因外显子2上的SNP分子标记C76T与小尾寒羊多胎性状显著相关，等位基因T对于产羔数具有明显的加性作用。因此，在繁殖培育小尾寒羊的过程中可以通过该SNP分子标记辅助选择繁殖力高的CT型或TT型个体，从而加速小尾寒羊繁殖性能的育种进程。小尾寒羊属于典型的具有多胎性状的绵羊品种，因而小尾寒羊中多胎性状相关分子标记的发现还能够应用于其他绵羊品种的培育，所述绵羊品种包括但不限于湖羊、杜泊羊、考力代羊、美利奴羊、兰德瑞斯羊、罗曼诺夫羊。

以上实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、替代、简化、组合、修饰，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 刘学峰

<120> 一种羊多胎性状分子标记及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 350

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtcgaccatg gtggccggga cccgctgtct tctagcgttg ctgcttcccc aggtcctcct 60

gggcggcgcg gccggcctca ttcccgagct gggccggagg aagttcgcgg cgtctgctgg 120

ccgctcctca tcccagcctt cggacgaagt cctgagcgag ttcgagttgc ggctgctcag 180

catgttcggc ctgaagcaga gacccacccc cagcagggac gccgtggtgc ccccctacat 240

gctggacttg taccgccagc actcgggcca acccggtgcg cccgccccgg accaccggct 300

ggagagggca gccagcctcg ccaacacagt gcgcagcttt caccacgaag 350

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttctagcgtt gctgcttccc 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttcgtggtga aagctgcg 18

<210> 4

<211> 320

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttctagcgtt gctgcttccc caggtcctcc tgggcggcgc ggccggtctc attcccgagc 60

tgggccggag gaagttcgcg gcgtctgctg gccgctcctc atcccagcct tcggacgaag 120

tcctgagcga gttcgagttg cggctgctca gcatgttcgg cctgaagcag agacccaccc 180

ccagcaggga cgccgtggtg cccccctaca tgctggactt gtaccgccag cactcgggcc 240

aacccggtgc gcccgccccg gaccaccggc tggagagggc agccagcctc gccaacacag 300

tgcgcagctt tcaccacgaa 320

Claims

1.一种绵羊多胎性状的SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记是BMP2基因外显子2第76位核苷酸的SNP位点，所述位点核苷酸为C或T。

2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，所述分子标记如SEQ ID NO:1所示，其中第76位核苷酸为C或T。

3.一种用于检测权利要求1所述绵羊多胎性状SNP分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对的核酸序列如下所示：

a)上游引物F如SEQ ID NO：2所示；

b)下游引物R如SEQ ID NO：3所示。

4.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求3所述的引物对。

5.权利要求1或2任一所述的SNP分子标记，或权利要求3所述的引物对，或权利要求4所述的试剂盒在鉴定和/或培育多胎绵羊品种中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，所述绵羊品种选自小尾寒羊、湖羊、杜泊羊、考力代羊、美利奴羊、兰德瑞斯羊、罗曼诺夫羊；所述绵羊品种优选为小尾寒羊。

7.一种检测绵羊多胎性状的方法，其特征在于，包括检测如权利要求1所述的SNP分子标记的步骤，所述检测方法为测序和/或PCR或PCR-RFLP。

8.根据权利要求7所述的方法，所述检测方法包括利用如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物对扩增目的片段的步骤。

9.一种绵羊育种改良的方法，其特征在于，包括检测如权利要求1所述的SNP分子标记和选择基因型为TT或CT的个体作为种羊进行繁殖的步骤。

10.根据权利要求9所述的方法，所述检测方法包括利用如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物对扩增目的片段的步骤。