CN108103208B - 一种影响湖羊产羔性状的snp标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，特别是涉及一种羊SNP分子标记在羊产羔性状研究和羊育种中的应用。所述的羊SNP分子标记位点如SEQ ID NO.1，位于该序列片段的第343位核酸单碱基突变，命名为：T‑87C。该SNP分子标记对应于GeneBank上已经发布的绵羊6号染色体上BMPR‑IB基因(登录号：NC_019463.2)的编码区序列的第‑87bp处的T>C突变。本发明通过优选该SNP分子标记的优势等位基因，能够增加湖羊产羔性状的遗传进展，缩短湖羊的繁殖性状的育种时间，从而降低繁殖成本，有效地提高肉羊养殖业的经济效益。

Description

一种影响湖羊产羔性状的SNP标记及其应用

技术领域

本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，特别涉及到一种湖羊SNP分子标记在羊产羔性状研究和羊育种中的应用。

背景技术

产羔数是绵羊最重要的繁殖性状，受基因和环境等因素的影响，其经济效益十分显著，是影响肉羊产业发展的主要因素，因此产羔性状是种羊遗传改良研究中的重点。采取常规的育种方法，很难迅速地改善肉羊群体的繁殖性能，而分子标记辅助选择(markerassisted selection，MAS)则打破了这一技术壁垒，可以消除年龄、性别、环境等因素对表型性状选择的干扰，从而弥补了常规表型选择的不足(王百川等，2014年)。该方法可用于提高抗病能力(如抗痢疾)和改善肉质(如大理石纹)等活体很难度量或活体测量花销很大(如体尺、日增重)的性状，以及繁殖(如产羔数)等在生命活动中表达相对较晚的限性性状。而MAS能对这些性状进行早期选择，从而能起到缩短世代间隔、加快育种进度的目的。因此如能利用MAS技术改良种种羊的产羔性状，将具备较广阔的应用前景，但找到与这些数量性状基因座相关联的分子遗传标记，是实现MAS的先决条件。

湖羊是世界著名的多胎绵羊品种，也是我国一级保护地方畜禽品种。湖羊为稀有白色羔皮羊品种，以早熟、繁殖力高、泌乳性能好、生长发育快、产肉性能好、耐高温高湿等优点著称。因此，对湖羊的产羔性状进行改良，可以有效地缩短肉羊的育种进程，快速选育出高繁的种母羊，从而扩大养殖的经济效益。

专利CN105950638A中公开了绵羊(湖羊和小尾寒羊)的TrkA基因片段的432位发生等位基因突变，影响绵羊的产羔数量。该SNP标记位点可以用于绵羊产羔数的分子标记辅助育种。专利CN104099330A中公开了绵羊(品种包含杜泊和湖羊)LHβ基因片段的713位发生等位基因突变，影响绵阳的产羔数量。

但是，目前分子育种中还存在一些问题，主要有：标记遗传图谱的局限性；与育种目标性状连锁分子标记的多态性频率较低；在DNA提取、定量和PCR扩增以及数据处理等方面的自动化程度较低，所需仪器设备及试剂价格昂贵。而在基因定位中，由于现用定位材料的局限性，常常存在定位不准确的问题，而且在数量性状基因座QTL定位的技术中，并不是所有的目标QTL都可以被检测出来，且QTL与环境存在互作、以及大效应的QTL对小效应的QTL的掩盖等问题。此外，本研究中所采用的RFLP标记方法也存在DNA需要量大、检测技术繁杂以及难以应用于大规模的育种实践中等技术缺陷。而这些因素都增加了寻找一个新的SNP分子标记的难度。

此外，某些现有的产羔性状的分子标记，其等位基因中不同的基因型，产羔数量差异不是特别显著，对于产羔数量的提升不是特别理想。因此，寻找新的、且差异显著的羊产羔性状的SNP分子标记，具有重要意义。

发明内容

为了克服现有技术对产羔性状遗传选育的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种新的SNP分子标记在羊产羔性状研究和羊繁殖育种中的应用，尤其是在湖羊产羔性状研究和羊繁殖育种中的应用。

本发明的目的还在于提供一种不同等位基因有显著差异的羊产羔数量的SNP分子标记，其能有效提高羊繁殖育种工作。

本发明的目的通过下述技术方案得以实现：

一方面，本发明提供了一种影响羊产羔性状的SNP分子标记，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，位于该序列片段的第343位核酸单碱基突变，其序列中的M是T或C，其差异导致了羊产羔性状的不同；所标记的羊SNP位点对应于GeneBank上已经发布的绵羊6号染色体上BMPR-IB基因(登录号：NC_019463.2)的编码区序列的第-87bp，命名为T-87C(以编码区序列的第一位碱基为+1位计算)处的T>C突变。

另一方面，本发明还提供了用于鉴定上述羊SNP分子标记的引物，其含有如下所示的核酸序列：

SEQ ID NO：2

上游引物PCR-F：5'-TTTTAGGGCTCCATGTACTCC-3'；

SEQ ID NO：3

下游引物PCR-R：5'-TTTCCTCTGGGTGCTGTG-3'。

另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒含有如SEQ ID NO：2(上游引物)和SEQ ID NO：3(下游引物)所示的引物对。

另一方面，本发明还提供了上述的SNP分子标记、以及引物对，以及试剂盒在研究/鉴定/检测/调节的羊产羔数性状，或者是羊繁殖育种中的应用。进一步地，所述的繁殖育种优选为分子标记辅助选择；

另一方面，本发明还提供了一种检测羊产羔性状的方法，包含如下步骤：

检测羊6号染色体上上述羊SNP分子标记，具体是SEQ ID NO:1所示序列中，M的是C还是T。或者，检测羊的6号染色体上BMPR-IB基因编码序列的-87bp处是CT型还是CC型。

作为一种优选的实施方式，采用上述的引物对或试剂盒进行检测。

另一方面，本发明还提供了一种羊的遗传育种改良的方法，包含以下步骤：

确定羊核心群中种羊的上述SNP分子标记，并根据羊SNP分子标记做出相应的选择：种羊的继代选育参照GeneBank中6号染色体上BMPR-IB基因编码序列的-87bp处的CT型和CC型个体，淘汰该位点的TT型个体；以逐代提高该位点的等位基因C的频率，从而提高后代羊的产羔性能。

作为本发明一种优选的实施方式，采用上述的引物对或试剂盒进行确定羊核心群中种羊的SNP分子标记。

本发明中的，所述羊为绵羊；作为优选的实施方式，所述的绵羊为湖羊。发明人经过研究发现，川中黑山羊、海南东山羊、云南努比亚和重庆黑山羊4个山羊品种中均不存在此SNP位点，该位点具有一定的特异性。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明研究并确定影响产羔数相关的分子标记，使用该分子标记进行标记辅助选择，能够极大地增加湖羊的产羔数，加快育种进程。

(2)本发明提供一种用于鉴定影响羊产羔性状分子标记的引物对，通过该分子标记及引物对，可建立高效准确的分子标记辅助选择育种技术，将其应用于羊繁殖性状的遗传改良中，从而提高羊的产羔数，挖掘羊的繁殖潜力，进而提高企业肉羊养殖的经济效益，增加其核心竞争力。

(3)本发明通过优选该分子标记的优势等位基因，能够增加湖羊产羔性状的遗传进展，减少湖羊繁殖性状的育种时间，从而有效提高种羊育种的经济效益，其中，通过该分子标记，本发明将CT型个体全部选育成CC型个体，则每只羊平均产羔数可以增加0.27只。较之专利CN104099330A中公开的绵羊LHβ基因片段的713位发生的C/T等位基因突变，其优势等位基因型CC较杂合型TC的产羔数仅增加了0.15只，而本发明的BMPR-IB基因片段的343bp处的SNP位点在提高繁殖性能方面更显著(优势等位基因型CC比TC型的产羔数多0.27只)。

由此可见优良的繁殖性能在养羊产业中发挥着巨大的收益潜力。

附图说明

图1分子标记T-87C位点的序列比对结果图；注：1表示比对结果的参照序列；2表示20个DNA样的混池测序结果；3表示50个DNA样混池测序结果；4表示NCBI上的原核苷酸序列。

图2是所述分子标记SNP T-87C位点的PCR-RFLP凝胶电泳图。

图3是湖羊突变杂合型TC基因型的测序结果图，其中a为正向引物测序峰图，b为反向引物测序峰图。

图4是湖羊突变纯合型CC基因型的测序结果图，其中a为正向引物测序峰图，b为反向引物测序峰图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

选取有完整产羔记录的湖羊母羊198只，颈静脉抽血2mL并做抗凝处理，于-20℃保存备用。本研究所使用的湖羊均来自广东省云浮市新兴县温氏新旺羊业有限公司的良洞种羊场，该场全年实行高床舍饲饲养，按统一饲养标准饲喂日粮，自由采食饮水。

(1)湖羊血液基因组DNA的抽提是参照血液基因组DNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)，以1％的琼脂糖凝胶电泳检测，无弥散或拖尾现象；并用紫外分光光度计对抽提的DNA进行质量检测和浓度测定。将A260/280比值在1.8～2.0，A260/230比值在1.7～1.9的DNA样判为合格。最后将合格的DNA样品统一稀释成50ng/μL，并于-20℃冰箱内进行低温保存。

(2)DNA pool测序：分别抽取20个和50个不同湖羊个体的DNA样品，按等量混合的原则做成两个DNA池，并以此为模板进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序。利用DNAMAN软件对测序结果进行序列整理并与NCBI上基因组序列进行比对，发现在该扩增序列的第343bp处存在T→C的突变，即为所述SNP位点，如图1所示。

(3)湖羊PCR-RFLP基因型检测：聚合酶链式反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)分析技术是在PCR技术的基础上发展起来的。DNA碱基置换正好发生在某种限制性内切酶的识别位点上，使酶切位点增加或者消失，利用这一酶切性质的改变，PCR特异扩增包含碱基置换的这段DNA，经某一限制酶切割，再利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，与正常PCR产物进行比较来确定是否变异。

本研究以湖羊血液基因组DNA为模板，PCR扩增BMPR-IB基因外显子1的791bp特异性片段产物，通过在线软件NEBcutter V2.0(http://nc2.neb.com/NEBcutter2/)和PrimerPremier 5.0软件对酶切位点进行分析，确定该特异性片段产物包含Hin6I限制性内切酶多态位点，经Hin6I酶切后，以3％的琼脂糖凝胶电泳检测等位片段的长度(791bp+342bp+449bp或342bp+449bp，如图2)，以此为遗传标记进行相关联分析，从而判断此分子标记是否影响湖羊的产羔数。

(4)统计分析：数据采用SPSS 20.0统计分析软件中的GLM(General LinearModel)程序配合构建的单位点效应模型对所述分子标记位点进行统计分析，采用LSD和Dunnett’sT3法进行均数间的多重比较，研究胎次和基因型对多胎性状(产羔数)的影响，统计分析所用的线性模型如下：

y_jkl＝μ+P_j+G_k+e_jkl

其中：y_jkl为个体产羔数记录值；μ为群体平均值；P_j为第j个胎次的固定效应；G_k为第k种基因型的固定效应；e_jkl为随机残差效应。所有数据均用平均值±标准差(Mean±SD)的形式呈现。

(5)不同基因型与产羔数表型的关联性分析：根据表1可知，分子标记的SNP位点T-87C与产羔性状显著相关(P<0.05)，说明此分子标记显著影响湖羊的繁殖性状，可以通过对湖羊的此SNP位点的辅助选择，从而提高该群体产羔数，进而加快育种进程。另外根据表1可知，CC型比TC型的平均产羔数多0.27只，说明纯合子CC对提高湖羊产羔数是有利的。产羔数是繁殖性状的重要指标，产羔数越高说明种羊的繁殖成本越低，经济效益越显著。因此，CC基因型的羊繁殖性能是最好的，我们在进行育种的过程中可以予以保留，以逐代提高该位点的等位基因C的基因频率。

表1 T-87C位点的不同基因型与湖羊产羔数的关联性分析

注：不同字母表示差异显著(p＜0.05)

实施例2

(1)含有与湖羊产羔性状显著相关SNP位点的目的片段的扩增：目的片段为6号染色体上的一段791bp的核苷酸序列，序列扩增的上下游引物是根据GenBank上报道的绵羊BMPR-IB基因序列(登录号为：NC-019463.2)，利用Primer Premier 5.0软件对BMPR-IB基因的外显子1进行引物设计，扩增绵羊BMPR-IB基因的部分序列。引物由华大生物科技有限公司合成，具体序列如下：

SEQ ID NO.2

上游引物PCR-F：5'-TTTTAGGGCTCCATGTACTCC-3'；

SEQ ID NO.3

下游引物PCR-R：5'-TTTCCTCTGGGTGCTGTG-3'。

(2)PCR扩增体系和程序设置

PCR反应体系：10μL体系中含基因组DNA模板1μL，上、下游引物各0.2μL，5μLTaqDNA聚合酶，以去离子双蒸水补充至终体积。

PCR反应程序：94℃预变性2min，35个循环(94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s)，72℃后延伸5min，4℃保存。

(3)PCR-RFLP基因分型

PCR反应结束后即进行分子标记T-87C位点扩增产物的酶切。酶切体系：15μL体系中含10×buffer 1μL，双蒸水8.5μL，限制性内切酶(10U/μL)0.5μL，PCR反应产物5μL，震荡混匀，37℃水浴30min。酶切产物使用3％的琼脂糖凝胶电泳分型。

(3)不同基因型测序结果判定：序列测序在深圳华大基因科技有限公司进行，基因片段进行正反两个方向的测序。将分子标记T-87C位点的两种不同基因型的PCR产物送测，结果如图3和图4所示。

测序结果如下SEQ ID NO.1所示：

注：序列表中标注的M为突变位点，用标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾加粗显示的为引物序列。

实施例3分子标记的SNP位点T-87C效应分析

本发明提供一个能显著增加湖羊产羔数的SNP标记，使用该SNP进行标记辅助选择，能够极大地增加湖羊繁殖性能的育种进程。

本发明中影响羊产羔数的分子标记SNP位点全部选育成CC型个体，则每只种母羊的平均产羔数可以增加0.27只，由此可见繁殖性能高的种母羊的选育，对降低繁殖成本，提高养羊业经济效益及促进我国肉羊产业的快速发展具有重要的意义。本SNP标记的个体中，CC型个体与CT型个体之间的产羔数存在显著差异(P<0.05)，通过优选湖羊该SNP位点的优势等位基因(C)，可最终实现提高养殖效益的目的。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、替代、简化、组合、修饰，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种影响湖羊产羔性状的 SNP 标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 791

<212> DNA

<213> 湖羊(hu sheep)

<400> 1

ttttagggct ccatgtactc cacttctaaa tcctctttag actacccttt cctgctgtca 60

cgggggtgtg tgtgctaagt cgcttcattc gtgtcctact ctttgcgacc atatggactg 120

tagcctgcca gggtcctctc tccatgggat tctccaagga agaatactgg agtggattgt 180

catgctctcc tccaggggat cttcctgacc cagggattga acccctgtct cctgcattgc 240

aggcggattc tttacccact gagccacctc ttgtgaaggc attgccctgt tttatgaaga 300

tgaagttggg gcttctttaa tgcaacacga ggaaccaatg tgmgctgatg tacaacttga 360

aaggaaaggc catacacgac cagtggggga taggagccaa gccagaatgg agatcttgag 420

ggtcatgtca tggtacctct ggcgaggtga gctagttaac tcatcctcag attgcctatg 480

tttttccttt cctgtttcac agtcctggtt gattcctgga tgacattgcc agtaaactac 540

ctgtttgcaa gcagttgtct taggctctac tttcttggaa attaaagtaa caataatacc 600

ttcaaaacac atcttgaatt tgactgcttc tcatcacccc tgccgctgcc atccatgttc 660

aaaccacagt cagtgcccgc cttaatcatc caccaactgc ttcattgtca gtgcctgtag 720

tcatctccta agtgctctct gctttgattg ttgtccctat agtccatcct tggcacagca 780

cccagaggaa a 791

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttttagggct ccatgtactc c 21

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttcctctgg gtgctgtg 18

Claims (5)

1.一种检测羊产羔性状的方法，其特征在于，检测羊的SEQ ID NO:1所示序列中，M是C还是T；或者，检测羊的6号染色体上BMPR-IB基因编码序列的-87bp处是CT型还是CC型；所述羊为湖羊。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用上游引物如SEQ ID NO：2所示和下游引物如SEQ ID NO：3所示的引物对进行检测。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用包含权利要求2所述引物对的试剂盒进行检测。

4.一种羊的遗传改良方法，其特征在于，确定羊核心群中种羊的SNP分子标记，并根据羊SNP分子标记做出相应的选择：种羊的继代选育参照GeneBank中6号染色体上BMPR-IB基因编码序列的-87bp处的CT型和CC型个体，淘汰该位点的TT型个体；以逐代提高该位点的等位基因C的频率，从而提高后代羊的产羔性能；所述包含SNP分子标记的核苷酸序列如SEQID NO:1所示；所述羊为湖羊。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，采用引物对或试剂盒检测羊核心群中种羊的SNP分子标记，所述引物对的核酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；所述试剂盒包含如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的引物对。

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