CN112779340A

CN112779340A - 与绵羊高繁殖力相关的单倍型分子标记、筛选方法与应用

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Publication number: CN112779340A
Application number: CN202110138770.2A
Authority: CN
Inventors: 杨华; 杨永林; 王明远; 赵宗胜; 余乾; 张宾; 倪建宏; 陈宁; 卢守亮; 刘长彬
Original assignee: Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Sciences
Current assignee: Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Sciences
Priority date: 2021-02-01
Filing date: 2021-02-01
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2041-02-01
Also published as: CN112779340B

Abstract

本发明公开了与绵羊高繁殖力相关的单倍型分子标记、筛选方法与应用。属于分子遗传学技术领域。该单倍型分子标记由SNP1、SNP2和SNP3组成；SNP1所在位置为MTNR1A基因的第735bp处，该处碱基为G或A；SNP2所在位置为MTNR1A基因的第753bp处，该处碱基为G或A；SNP3所在位置为MTNR1A基因的第845bp处，该处碱基为C或A。当待测绵羊SNP1处碱基为G、SNP2处碱基为G、SNP3处碱基为C且均为纯合体时或单倍型为GGC时为高繁殖力个体。本发明为绵羊育种提供了一个有效准确的分子育种标记方法，能提高群体选种的准确性和育种进程，将在多胎肉羊和多胎细毛羊分子育种中发挥作用。

Description

与绵羊高繁殖力相关的单倍型分子标记、筛选方法与应用

技术领域

本发明涉及分子遗传学技术领域，更具体的说是涉及与绵羊高繁殖力相关的单倍型分子标记、筛选方法与应用。

背景技术

近年来，随着人民生活水平的逐渐提高，健康合理的饮食结构日益受到人们的重视，对蛋白质含量高、脂肪和胆固醇含量低的羊肉需求量逐年提高，导致连续多年羊肉供不应求，价格持续上涨。而培育高繁殖力绵羊、饲养多胎绵羊、提高绵羊群体的繁殖率可以显著增加存栏羔羊数量，缓解市场羊肉价高和供给紧张的局面。随着封山禁牧各项政策措施的实施，绵羊养殖已由传统的放牧散养方式转变为舍饲喂养的方式，为了确保养羊业的经济效益，实现持续健康发展，培育和饲养高繁殖力绵羊已成为世界绵羊生产共同追求的目标之一。但是，世界绵羊近700个品种中，绝大多数产单羔，少数产双羔，极大地影响了绵羊的繁殖性能。随着集约化养羊业的不断发展，提高绵羊繁殖力已成为舍饲养羊获得经济效益的关键因素。现有繁殖力较高的品种有芬兰的兰得瑞斯，前苏联的罗曼诺夫，我国的小尾寒羊和湖羊等，但是这些品种远不能满足现代养羊业发展所需的多胎肉羊品种需求。而要育成新品种多胎肉羊，所需的时间较长、投入的人力和物力较多。因此，要满足肉羊生产发展的需要，仅依靠传统的繁殖和育种方式是远远不够的，需大力开发现代育种和繁殖新技术，以推动优质多胎绵羊的快速精准育成。

根据Turner等对美利奴及罗姆羊等研究结果表明，繁殖性状是绵羊遗传性状中极为重要的经济性状，其遗传力平均仅为0.10左右。针对低遗传力的绵羊繁殖性状的选育，传统表型选择育种方法速度慢、效率低、准确性差，因此难以用常规育种技术在短期内提升繁殖性能。而现代分子育种技术能够利用基因标记辅助选择技术实现早期、准确、快速的育种，极大的提高难以早期选择、低遗传力的绵羊繁殖性状选择效率。研究表明，单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，即基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A、T、C或G)的突变而引起的多态性，包括单碱基的插入、缺失、转化和颠换等，其中一些重要的SNPs可直接影响蛋白结构和表达水平等，从而导致表型的变化。生物体中的SNPs占所有已知多态性的90％以上，SNPs作为第三代遗传标记，具有分布广泛、遗传稳定、易于自动化高通量快速检测分析的特点。连锁不平衡(Linkage Disequilibrium，LD)是指在某一群体中不同座位上某两个等位基因同时遗传的频率明显高于预期的随机频率的现象，LD分析可以检验SNPs之间的互作关系，实现基因的精细定位，是一种对重要表型相关基因的功能进行鉴定的有效方法。单倍型(Haplotype)是指在同一染色体上或一定区域内若干个决定同一表型性状且紧密连锁的SNPs，具有统计学关联性，包含了比单个SNP以及多个SNP简单相加的更多信息(JoshuaAkey等，2001)，以及各遗传位点的互作，能够更准确解释表型性状的遗传信息。SNP分子标记及其组成的单倍型由于分布的广泛性和稳定性，在动物分子标记辅助选择(MarkerAssisted Selection，MAS)育种中发挥着重要作用。基于此，为进一步鉴定与绵羊高繁殖力相关的MTNR1A基因SNP分子标记及其单倍型，将重要SNP标记及其单倍型作为筛选标记用于高繁殖力绵羊的标记辅助选择上，可以显著提高选种的效率和准确性，对培育多胎绵羊具有重要意义。

褪黑激素是一种在夜间由松果体分泌的多效性信号分子，其生物学功能主要通过与高亲和力的褪黑素受体(Melatonin Receptor，MTNR)结合对动物的昼夜节律和生殖活动发挥调节作用。褪黑素受体1A蛋白是褪黑激素主要的高亲和力受体，是一种经典的G蛋白，带有七个跨膜结构域，一个细胞外N-末端结构域和三个细胞外环的耦合受体，具有跨膜信号传递功能。然而，MTNR1A基因在绵羊上的研究主要集中于季节性发情，针对绵羊高繁殖力的相关研究较少，尚无应用于多胎绵羊分子育种中的MTNR1A基因分子标记和单倍型。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种与绵羊高繁殖力相关的单倍型分子标记、筛选方法与应用。为提高绵羊繁殖性能提供了一种有效的分子标记育种手段，可辅助选育高繁殖力的优质种羊，加速育种进程，提高选种的准确性。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种与绵羊高繁殖力相关的单倍型分子标记，所述单倍型分子标记由SNP1、SNP2和SNP3共3个SNP位点组成；

其中，SNP1所在位置为MTNR1A基因的第735bp处，该处碱基为G或A；

SNP2所在位置为MTNR1A基因的第753bp处，该处碱基为G或A；

SNP3所在位置为MTNR1A基因的第845bp处，该处碱基为C或A。

优选的，当待测绵羊SNP1处的碱基为G、SNP2处的碱基为G、SNP3处的碱基为C且均为纯合体(即SNP1、SNP2和SNP3处的基因型分别为GG、GG和CC)时，为高繁殖力个体。

优选的，当待测绵羊的单倍型为GGC时，为高繁殖力个体。

用于扩增上述单倍体分子标记的引物组，其核苷酸序列如下：

用于扩增SNP1的引物：

SNP1F：TCGCCGTGGTGGTGTTCCATTTCAT；SEQ ID NO.1；

SNP1R：ACAAACATGGTGACAAAATTTCTGAAGTCCTGGG

TT；S EQ ID NO.2；

用于扩增SNP2的引物：

SNP2F：TCGCCGTGGTGGTGTTCCATTTC；SEQ ID NO.3；

SNP2R：GGCAAAGAGGACAAAAACCACAAACATGGTGACAAA

T；SEQ ID NO.4；

用于扩增SNP3的引物：

SNP3F：GGACAACAAACCGAAACTGA；SEQ ID NO.5；

SNP3R：AATGAGTAAGGCTTGGAGTAG；SEQ ID NO.6。

注：引物序列中画框碱基为引入的突变碱基。

含有上述引物的检测试剂盒。

上述单倍体分子标记的筛选方法，包括如下步骤：

(1)根据MTNR1A基因SNP1、SNP2和SNP3位点的核苷酸序列设计引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.7所示；

(2)提取绵羊基因组DNA，利用上述引物进行PCR扩增；

(3)将扩增产物分别用限制性内切酶酶切，酶切产物采用琼脂糖凝胶电泳进行基因型判定；

(4)MTNR1A基因外显子2区域变异分析；

(5)绵羊群体MTNR1A基因分型；

(6)分析绵羊群体中不同基因型与产羔数的相关性。

SNP1位点的PCR扩增产物用限制性内切酶EcoRⅠ酶切，酶切产物经3％琼脂糖凝胶进行电泳分离，根据参考序列和电泳分离结果进行基因型判定，基因型判定的标准为：将只有一条带，大小为160bp的个体命名为AA基因型，PCR产物不能被限制性内切酶EcoRⅠ切开，则绵羊SNP1位点发生突变；将存在两条带，大小为160bp和122bp的个体命名为AG基因型，PCR产物不能被限制性内切酶EcoRⅠ完全切开，则绵羊SNP1位点处于杂合状态；将只有一条带，大小为122bp的个体命名为GG基因型，PCR产物能被限制性内切酶EcoRⅠ完全切开，则绵羊SNP1位点未发生突变；

SNP2位点的PCR扩增产物用限制性内切酶FokⅠ酶切，酶切产物经3％琼脂糖凝胶进行电泳分离，根据电泳分离结果进行基因型判定，基因型判定的标准为：将只有一条带，大小为179bp的个体命名为AA基因型，PCR产物不能被限制性内切酶FokⅠ切开，则绵羊SNP2位点发生突变；将存在两条带，大小为179和152bp的个体命名为AG基因型，PCR产物不能被限制性内切酶FokⅠ完全切开，则绵羊SNP2位点处于杂合状态；将只有一条带，大小为152bp的个体命名为GG基因型，PCR产物能被限制性内切酶FokⅠ完全切开，则绵羊SNP2位点未发生突变；

SNP3位点的PCR扩增产物用限制性内切酶BglⅠ酶切，酶切产物经3％琼脂糖凝胶进行电泳分离，根据电泳分离结果进行基因型判定，基因型判定的标准为：将只有一条带，大小为438bp的个体命名为AA基因型，PCR产物不能被限制性内切酶BglⅠ切开，则绵羊SNP3位点发生突变；将存在三条带，大小为438、304和134bp的个体命名为AC基因型，PCR产物不能被限制性内切酶BglⅠ完全切开，则绵羊SNP3位点处于杂合状态；将存在两条带，大小为304和134bp的个体命名为CC基因型，PCR产物能被限制性内切酶BglⅠ完全切开，则绵羊SNP3位点未发生突变。

限制性内切酶EcoRⅠ所识别的碱基序列为GAATTC；限制性内切酶FokⅠ所识别的碱基序列为GGATGNNNNNNNNN；限制性内切酶BglⅠ所识别的碱基序列为GCCNNNNNGGC。

为建立MTNR1A基因SNP1、SNP2和SNP3的PCR-RFLP检测方法，经过分析证明SNP3位点具有一个BglⅠ酶切位点，而SNP1和SNP2位点不具有酶切位点。为符合force-PCR-RFLP的检测分析，根据限制性内切酶EcoRⅠ识别序列GAATTC，在SNP1位点下游引物中强制引入TT碱基突变，即MTNR1A基因编码区738和739位的GC两个碱基突变为TT碱基，SNP1R引物序列的画框碱基为引入的突变碱基，从而形成EcoRⅠforced-RFLP-PCR检测分析；同样，根据限制性内切酶FokⅠ识别序列GGATGNNNNNNNNN，在SNP2位点下游引物中强制引入TG碱基突变，即MTNR1A基因编码区755和756位的AT两个碱基突变为TG碱基，SNP2R引物序列画框碱基为引入的突变碱基，从而形成FokⅠforced-RFLP-PCR检测分析。

上述单倍型分子标记、上述引物组、上述检测试剂盒在绵羊育种方面的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：(1)本发明为多胎绵羊分子标记辅助选择育种提供了一个更加高效、准确的单倍型分子遗传标记，为提高绵羊高繁殖力提供了一种有效的分子标记育种手段，用该遗传标记对绵羊产羔性能进行标记辅助选择，可以提高绵羊个体和群体的繁殖性能，增加舍饲绵羊养殖的经济效益。(2)使用3个变异位点作为标记，应用forcedPCR-RFLP为主要检测方法，具有成本低、实用性强、准确性高、易操作的优点，可加快多胎绵羊的育种进程，为加速绵羊繁殖性能的育种工作奠定基础。(3)本发明的检测方法操作简单、成本低、准确性高、易于实现自动化检测，本发明将在多胎绵羊育种中发挥重要作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明的技术路线示意图；

图2附图、图3附图和图4附图为本发明实施例1中绵羊MTNR1A基因编码区片段的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中M为pUC19DNA/MspⅠ(HpaⅡ)marker，C为空白对照，1-3为MTNR1A基因编码区735位点(SNP1)片段扩增结果(图2附图)，4-6为MTNR1A基因编码区753位点(SNP2)片段扩增结果(图3附图)，7-9为MTNR1A基因编码区845位点(SNP3)片段扩增结果(图4附图)；

图5附图为本发明实施例1中绵羊MTNR1A基因编码区第735位点(SNP1)PCR产物酶切后琼脂糖凝胶电泳检测基因分型图，其中M为pUC19DNA/MspⅠ(HpaⅡ)marker，5、6、11、14为AA基因型，1、2、7、8、9、12为GG基因型，3、4、10、13为AG基因型；

图6附图为本发明实施例1中绵羊MTNR1A基因编码区第753位点(SNP2)PCR产物酶切后琼脂糖凝胶电泳检测基因分型图，其中M为pUC19DNA/MspⅠ(HpaⅡ)marker；1,6为AA基因型；2为GG基因型；3,4,5为AG基因型；

图7附图为本发明实施例1中绵羊MTNR1A基因编码区第845位点(SNP3)PCR产物酶切后琼脂糖凝胶电泳检测基因分型结果，其中M为pUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ)marker；1,3,4,5为AA基因型；2,8,9,10,14为CC基因型；6,7,11,12,13为AC基因型；

图8附图为本发明实施例1中绵羊MTNR1A基因3个SNP位点不同基因型个体测序结果比较图；SNP1：第735bp存在G/A突变位点；SNP2第753bp存在G/A突变位点；SNP3第845bp存在C/A突变位点；

图9附图为本发明实施例4中MTNR1A基因的单倍型block分析结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中的试验绵羊品种为中国美利奴羊(新疆军垦型)和多胎萨福克羊，样本来源于新疆农垦科学院种羊场。

本发明实施例中所需材料均采购自市售渠道，例如：

血液基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；

Taq酶购自康为世纪生物科技有限公司。

实施例中未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。

实施例1绵羊MTNR1A基因编码区SNP检测分析

1、绵羊基因组DNA的提取

方法一：采用通用的绵羊血液基因组DNA的提取方法

(1)将1mL抗凝全血转入一个无菌的2mL离心管中。

(2)加入等体积(1mL)的PBS缓冲液，温和摇动10min；室温3500g离心10min，用移液器弃上清，重复步骤至上清液透明，沉淀无色。

(3)离心管中加DNA提取液1mL(10mmol/L Tris(pH8.0)，0.1mol/L EDTA，0.5％SDS)，温和摇动使细胞沉淀悬浮；37℃水浴1h。

(4)加入3μL蛋白酶K(终浓度为60μg/mL)，混匀；在恒温水浴箱中55℃温育(2～4h左右)，至细胞沉淀物被完全消化，溶液澄清，得反应液。

(5)反应液冷却至室温，加入1倍体积(1mL)的Tris饱和酚，温和摇动10min。

(6)4℃，12000g离心10min；将上层水相用移液器移到另一灭菌离心管中。

(7)加入0.5倍体积(0.5mL)的酚和0.5倍体积(0.5mL)的氯仿，放置冰上温和摇动20min。

(8)4℃，12000g离心10min；将上层水相用移液器移到另一灭菌离心管中。

(9)加入1倍体积(1mL)的氯仿，温和摇动10min。

(10)4℃，12000g离心10min；将上层水相用移液器移到另一灭菌离心管中。

(11)加入2倍体积的预冷无水乙醇(-20℃)，轻轻颠倒混合多次至DNA析出，然后-20℃放置30min。

(12)用tip头将DNA团钩出转入一新的灭菌离心管中，或4℃，12000g离心10min，弃去乙醇。

(13)加入70％乙醇1mL，温和摇动10min；4℃，12000g离心10min，弃乙醇，重复漂洗一次。

(14)真空干燥或室温下使乙醇挥发干净；根据DNA的量，加入超纯水100～300μL，DNA完全溶解以后，使用分光光度计测定浓度，-4℃保存备用。

方法二：

采用天根生化科技(北京)有限公司生产的血液基因组DNA试剂盒提取，严格按照该试剂盒说明书进行操作，具体步骤如下所述：

(1)采用一次性注射器从绵羊颈静脉中抽取5mL血液，记录羊号，制备EDTA-Na₂抗凝血，-20℃保存备用。吸取200μL EDTA-Na₂抗凝血，加入200μL CL，充分颠倒混匀，10000rpm离心1min，吸去上清，留下细胞核沉淀，向细胞核沉淀中加200μL缓冲液GS，振荡混匀。

(2)加入20μL蛋白酶K，混匀后加200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10min裂解至溶液清亮。

(3)加入200μL无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能出现絮状沉淀。

(4)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管)，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。

(5)向吸附柱中加入500μL缓冲液GD(含无水乙醇)，12000rpm离心30s倒掉收集管废液，将吸附柱放入收集管。

(6)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW(含无水乙醇)，12000rpm离心30s倒掉收集管废液，将吸附柱放入收集管。

(7)重复操作步骤6。

(8)12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱置于室温彻底晾干漂洗液。

(7)将吸附柱置于一个干净的离心管中，在柱的中央加入50～200μL预热的洗脱缓冲液TB，室温静置2min，12000g离心2min，将溶液收集到离心管，于-20℃下保存备用。

2、绵羊MTNR1A基因PCR扩增

应用UCSC Genome Browser查询绵羊参考基因组[(ISGC Oar_v4.0)，http:// genome.ucsc.edu/CGI-bin/hgBlat]，根据绵羊MTNR1A基因序列设计引物对，SNP1、SNP2和SNP3位点的引物序列、PCR产物大小、退火温度如表1所示。

表1引物信息表

注：引物序列中画框碱基为引入的突变碱基。

以提取的绵羊基因组DNA为模板，利用表1中设计的引物进行PCR扩增，25μL PCR反应体系包含如表2所示的溶液或试剂：

表2PCR反应体系

将上述溶液混合，按以下条件进行PCR反应：

94℃预变性5min；94℃变性30sec，不同位点对应不同的退火温度30sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃延伸5min。

反应结束以后，PCR扩增产物(5～10μL)用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果分别见图2、图3和图4。

3、RFLP分析

突变位点SNP1的PCR产物用EcoRⅠ限制性内切酶进行酶切反应，酶切体系为20μL：限制性内切酶1μL，10×H Buffer 2μL，PCR扩增产物5μL，ddH₂O 12μL，37℃酶切5h。突变位点SNP2的PCR产物用FokⅠ限制性内切酶进行酶切反应，酶切体系为20μL：限制性内切酶1μL，10×M Buffer 2μL，0.1％BSA 2μL，PCR扩增产物8μL，ddH₂O 7μL，37℃酶切5h。突变位点SNP3的PCR产物用BglⅠ限制性内切酶进行酶切反应，酶切体系为20μL：限制性内切酶1μL，10×Basal Buffer 2μL，PCR扩增产物8μL，ddH₂O 9μL，37℃酶切5h。酶切完成以后，取酶切产物(10～20μL)进行3.0％琼脂糖凝胶电泳检测，分析判断基因型。

4、MTNR1A基因变异位点的基因型分析

SNP1位点的PCR产物用EcoRⅠ酶切分析，经3％的琼脂糖凝胶电泳后产生3种基因型(图5)，将只有160bp片段的个体命名为AA基因型，存在160和122bp两个片段的个体命名为AG基因型，存在122bp片段的个体命名为GG基因型。SNP2位点的PCR产物用FokⅠ酶切分析，经3％的琼脂糖凝胶电泳后产生3种基因型(图6)，将只有179bp片段的个体命名为AA基因型，存在179和152bp两个片段的个体命名为AG基因型，存在152bp片段的个体命名为GG基因型。SNP3位点的PCR产物用BglⅠ酶切分析，经3％的琼脂糖凝胶电泳后产生3种基因型(图7)，将只有438bp片段的个体命名为AA基因型，存在438、304和134bp三个片段的个体命名为AC基因型，存在304和134bp片段的个体命名为CC基因型。根据RFLP分型结果判定该位点在检测群体中的基因型。

为进一步验证结果的准确性，随机选择每一个SNP位点的PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，利用DNAMAN V8.0比对分析序列，Chromas V2.13分析测序峰图的突变位点，结果如图8所示，证明在序列中的第735bp、753bp和845bp处分别存在G/A、G/A和C/A三个等位基因突变。

上述3个SNP标记的MTNR1A基因编码区核苷酸序列如下：

atggcggggcggctgtggggctcgccgggcgggacccccaagggcaacggcagcagcgcgctgctcaacgtctcgcaggcggcgcccggcgccggggacggtgtgcggccgcggccctcgtggctggccgccaccctcgcctccatcctcatcttcaccatcgtggtggacatcgtgggcaacctcctggtggtcctgtccgtgtatcggaacaagaagctgaggaacgcagggaatgtgtttgtggtgagcctggcagttgcagacctgctggtggccgtgtatccgtaccccttggcgctggcgtctatagttaacaatgggtggagcctgagctccctgcattgccaacttagtggcttcctgatgggcttgagcgtcatcgggtccgttttcagcatcacgggaattgccatcaaccgctattgctgcatctgccacagcctcagatacggcaagctgtatagcggcacgaattccctctgctacgtgttcctgatctggacgctgacgctcgtggcgatcgtgcccaacctgtgtgtggggaccctgcagtatgacccgaggatctattcctgtaccttcacgcagtccgtcagctcagcctacacgatcgccgtggtggtgttccatttcatagttccgatgctcgtagtcgtcttctgttacctgagaatctgggccctggttcttcaggtcagatggaaggtgaaaccggacaacaaaccgaaactraagccccaggacttcagraattttgtcaccatgtttgtggtttttgtcctctttgccatttgctgggctcctctgaacttcattggtctcgttgtggcctcggaccctgmcagcatggcacccaggatccccgagtggctgtttgtggctagttactatatggcatatttcaacagctgcctcaatgcgatcatatatggactactgaaccaaaatttcaggcaggaatacagaaaaattatagtctcattgtgtaccaccaagatgttctttgtggatagctccaatcatgtagcagatagaattaaacgcaaaccttctccattaatagccaaccgtaacctagtaaaggtggactccgtttaa；SEQ ID NO：7。

其中，r代表g或a；m代表c或a。

实施例2本发明制备的分子标记在中国美利奴羊(新疆军垦型)和多胎萨福克羊多态性分布检测

对绵羊MTNR1A基因编码区区域的3个SNP位点多态性进行检测，在每个位点均检测到三种基因型，基因型频率、等位基因频率如表3所示。

表3 MTNR1A基因的基因型频率和等位基因频率

注：基因型频率一列括号内数字为该基因型的个体数。

由表3可知，所述序列的3个突变位点均检测到3种基因型，在MTNR1A_SNP1、MTNR1A_SNP2和MTNR1A_SNP3位点上，优势等位基因分别为G、G、C，优势基因型分别为GG、GG和CC。

实施例3本发明的分子标记与绵羊繁殖性状的关联分析与应用

为确定检测出的绵羊MTNR1A_SNP1、MTNR1A_SNP2和MTNR1A_SNP3标记与绵羊繁殖性状是否相关，选择224只中国美利奴羊(新疆军垦型)和190只多胎萨福克羊为试验材料，样本均来自新疆农垦科学院种羊场，记录每只羊的产羔数，利用PCR-RFLP法进行多态性检测，并分析绵羊MTNR1A基因编码区不同基因型与绵羊产羔性状的相关性。采用SPSS19.0软件进行基因型与表型之间的关联分析，构建基因型遗传效应的统计模型为：Y＝μ+G+B+(G×B)+e，其中，Y为性状观察值；μ为性状群体均值；G为基因型效应；B为品种系效应；G×B为基因型与品种系的互作效应；e为残差效应。

在中国美利奴羊(新疆军垦型)和多胎萨福克羊中进行3个突变位点不同基因型与绵羊产羔性状间的关联分析，统计分析结果见表4。

表4绵羊MTNR1A基因3个突变位点不同基因型对平均产羔数的影响

注：同行数据上标不同小写字母表示同一位点三种基因型间差异显著(P＜0.05)，同行数据上标不同大写字母表示同一位点三种基因型间差异极显著(P＜0.01)。基因型一列括号内数字为该基因型的个体数。

由表4可见，MTNR1A基因MTNR1A_SNP1和MTNR1A_SNP2极显著影响绵羊产羔数(P＜0.01)，MTNR1A_SNP3显著影响绵羊产羔数(P＜0.05)。其中MTNR1A_SNP1位点的GG基因型、MTNR1A_SNP2位点的GG基因型及MTNR1A_SNP3位点的CC基因型绵羊个体具有较高的产羔数。

实施例4具有高繁殖力绵羊的MTNR1A_SNP1、MTNR1A_SNP2和MTNR1A_SNP3位点的单倍型组合构建与鉴定

1、单倍型构建

利用Haploview软件进行MTNR1A_SNP1、MTNR1A_SNP2和MTNR1A_SNP3的单倍型分析，将得到的所有个体的MTNR1A_SNP1、MTNR1A_SNP2和MTNR1A_SNP3位点的基因型数据输入PHASE程序，计算得到每个个体的基因型，同时计算位点之间的成对连锁不平衡程度。单倍型block分析结果如图9所示。

由图9可知，根据MTNR1A_SNP1、MTNR1A_SNP2和MTNR1A_SNP3位点连锁不平衡分析，共找到1个单倍型block，对该单倍型block进行单倍型分析，在本发明研究的中国美利奴羊(新疆军垦型)和多胎萨福克羊群体中发现4种单倍型，如表5所示，H1为优势单倍型。

表5 MTNR1A基因SNP位点单倍型统计结果

单倍型(n)	频率％
		H1：GGC(550)	0.664
H2：GAC(14)	0.017
		H3：AAC(72)	0.087
H4：AAA(173)	0.209

注：括号中为单倍型个体数量。

剔除样品群体中频率小于0.01的部分单倍型样本，最终选择数量最多的4种单倍型进行关联分析。

2、单倍型与绵羊产羔数的关联分析

利用SPSS19.0软件进行单倍型组合与绵羊产羔性状的关联分析，构建单倍型遗传效应的统计模型为：Y＝μ+H+B+(H×B)+e，其中，Y为性状观察值；μ为性状群体均值；H为单倍型效应；B为品种系效应；H×B为单倍型与品种系的互作效应；e为残差效应。结果见表6。

表6单倍型对绵羊平均产羔数的影响

单倍型	平均产羔数
		H1：GGC	1.61±0.02<sup>A</sup>
H2：GAC	1.60±0.15<sup>AB</sup>
		H3：AAC	1.44±0.08<sup>AB</sup>
H4：AAA	1.43±0.04<sup>B</sup>
		P-value	0.002

注：同列数据上标不同大写字母表示单倍型间差异极显著(P＜0.01)。

由表6可知，H1(GGC)单倍型个体的绵羊产羔数极显著高于H4(AAA)单倍型个体(P＜0.01)。因此，在本实施例的试验群体中H1(GGC)单倍型具有最高的产羔数。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 新疆农垦科学院

<120> 与绵羊高繁殖力相关的单倍型分子标记、筛选方法与应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcgccgtggt ggtgttccat ttcat 25

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acaaacatgg tgacaaaatt tctgaagtcc tgggaatt 38

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcgccgtggt ggtgttccat ttc 23

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggcaaagagg acaaaaacca caaacatggt gacaaacat 39

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggacaacaaa ccgaaactga 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aatgagtaag gcttggagta g 21

<210> 7

<211> 1101

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggcggggc ggctgtgggg ctcgccgggc gggaccccca agggcaacgg cagcagcgcg 60

ctgctcaacg tctcgcaggc ggcgcccggc gccggggacg gtgtgcggcc gcggccctcg 120

tggctggccg ccaccctcgc ctccatcctc atcttcacca tcgtggtgga catcgtgggc 180

aacctcctgg tggtcctgtc cgtgtatcgg aacaagaagc tgaggaacgc agggaatgtg 240

tttgtggtga gcctggcagt tgcagacctg ctggtggccg tgtatccgta ccccttggcg 300

ctggcgtcta tagttaacaa tgggtggagc ctgagctccc tgcattgcca acttagtggc 360

ttcctgatgg gcttgagcgt catcgggtcc gttttcagca tcacgggaat tgccatcaac 420

cgctattgct gcatctgcca cagcctcaga tacggcaagc tgtatagcgg cacgaattcc 480

ctctgctacg tgttcctgat ctggacgctg acgctcgtgg cgatcgtgcc caacctgtgt 540

gtggggaccc tgcagtatga cccgaggatc tattcctgta ccttcacgca gtccgtcagc 600

tcagcctaca cgatcgccgt ggtggtgttc catttcatag ttccgatgct cgtagtcgtc 660

ttctgttacc tgagaatctg ggccctggtt cttcaggtca gatggaaggt gaaaccggac 720

aacaaaccga aactraagcc ccaggacttc agraattttg tcaccatgtt tgtggttttt 780

gtcctctttg ccatttgctg ggctcctctg aacttcattg gtctcgttgt ggcctcggac 840

cctgmcagca tggcacccag gatccccgag tggctgtttg tggctagtta ctatatggca 900

tatttcaaca gctgcctcaa tgcgatcata tatggactac tgaaccaaaa tttcaggcag 960

gaatacagaa aaattatagt ctcattgtgt accaccaaga tgttctttgt ggatagctcc 1020

aatcatgtag cagatagaat taaacgcaaa ccttctccat taatagccaa ccgtaaccta 1080

gtaaaggtgg actccgttta a 1101

Claims

1.一种与绵羊高繁殖力相关的单倍型分子标记，其特征在于，所述单倍型分子标记由SNP1、SNP2和SNP3共3个SNP位点组成；

SNP2所在位置为MTNR1A基因的第753bp处，该处碱基为G或A；

SNP3所在位置为MTNR1A基因的第845bp处，该处碱基为C或A。

2.如权利要求1所述的一种与绵羊高繁殖力相关的单倍型分子标记，其特征在于，当待测绵羊SNP1处的碱基为G、SNP2处的碱基为G、SNP3处的碱基为C且均为纯合体时，为高繁殖力个体。

3.如权利要求1所述的一种与绵羊高繁殖力相关的单倍型分子标记，其特征在于，当待测绵羊的单倍型为GGC时，为高繁殖力个体。

4.用于扩增权利要求1所述单倍体分子标记的引物组，其特征在于，其核苷酸序列如下：

用于扩增SNP1的引物：

SNP1F：TCGCCGTGGTGGTGTTCCATTTCAT；SEQ ID NO.1；

SNP1R：ACAAACATGGTGACAAAATTTCTGAAGTCCTGGGAATT；SEQ ID NO.2；

用于扩增SNP2的引物：

SNP2F：TCGCCGTGGTGGTGTTCCATTTC；SEQ ID NO.3；

SNP2R：GGCAAAGAGGACAAAAACCACAAACATGGTGACAAACAT；SEQ ID NO.4；

用于扩增SNP3的引物：

SNP3F：GGACAACAAACCGAAACTGA；SEQ ID NO.5；

SNP3R：AATGAGTAAGGCTTGGAGTAG；SEQ ID NO.6。

5.含有如权利要求4所述引物的检测试剂盒。

6.权利要求1所述单倍体分子标记的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

(2)提取绵羊基因组DNA，利用上述引物进行PCR扩增；

(3)将扩增产物分别用限制性内切酶酶切，酶切产物利用琼脂糖凝胶电泳进行基因型判定；

(4)MTNR1A基因外显子2区域变异分析；

(5)绵羊群体MTNR1A基因分型；

(6)分析绵羊群体中不同基因型与产羔数的相关性。

7.如权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(3)中，SNP1位点的扩增产物用限制性内切酶EcoR Ⅰ酶切，SNP2位点的扩增产物用限制性内切酶Fok Ⅰ酶切，SNP3位点的扩增产物用限制性内切酶Bgl Ⅰ酶切。

8.权利要求1所述的单倍型分子标记、权利要求4所述的引物组、权利要求5所述的检测试剂盒在绵羊育种方面的应用。