CN105671175A - 一种黄牛spag17基因插入/缺失的检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄牛SPAG17基因插入/缺失的检测方法及其应用。以包含SPAG17基因的待测全基因组DNA为模板，以参照牛全基因组设计的引物对P1为引物，通过PCR技术扩增SPAG17基因，再进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果鉴定SPAG17基因在AC_000160:g146755-146756insTCCTGACT位点存在不同的基因型。结果发现，SPAG17基因8-bp插入/缺失的不同类型与夏南牛体高和体斜长等生长发育性状之间存在显著相关，提示SPAG17基因8-bp插入/缺失的不同类型可作为提高夏南牛生长发育性状的DNA标记。故本发明将有利于快速建立生长发育性状优良的黄牛遗传资源群体。

Description

一种黄牛SPAG17基因插入/缺失的检测方法及其应用

技术领域

本发明属于现代生物技术与家畜育种领域，涉及基因插入/缺失(indel)的检测，特别涉及一种检测夏南牛SPAG17基因8-bp插入/缺失(indel)的方法。

背景技术

动物育种技术主要包括以表型和表型值为基础的常规育种技术和以DNA多态为基础的分子育种技术。作为分子育种技术体系的重要组成部分，分子标记辅助选择(marker-assistedselection，MAS)育种技术首先检测重要基因的DNA多态性，然后分析DNA多态与遗传性状之间的相关性，最后再根据与遗传性状显著相关的DNA标记进行性状选择。作为现代分子生物学技术发展过程中孕育而生的新技术，MAS育种技术可以在DNA水平上快速准确地分析个体的遗传组成，该方法通过有性杂交将目的基因转移到需要改良的亲本中，将目标基因型的鉴定与传统育种相结合，从而实现对基因型的直接选择，提高育种目标的定向性。该方法在克服表型鉴定的困难、早期选择、进行无损害的性状评价和选择及提高回交育种效率等方面具有优越性。

在MAS育种技术体系中，寻找重要功能基因、筛查重要基因遗传变异位点，并分析重要功能基因遗传变异位点与生长性能的相关性，是分子标记辅助选择技术应用的前提和关键。作为分子遗传标记的重要方式之一，插入/缺失(indel)是一种新型分子标记。indel是指DNA序列上核苷酸片段的插入或缺失而引起DNA序列的改变，造成包括人类在内的物种之间染色体基因组的多样性。随着对基因组研究的逐渐深入，基因组上的一种亚显微水平的结构变异--拷贝数变异(copynumbervariations,CNVs)被广泛报道，现已成为“基因组变异”到“表型变化”的另一研究热点。由于CNV涉及到更多的基因序列，甚至包含整个功能基因，因此，能够通过基因剂量效应的改变，进而影响该基因控制的表型。在近年的《GenomeResearch》杂志上，Bickhart等人(2012)利用全基因组测序技术，检测到了许多个与牛生长、肉质相关的QTLs位于CNVs区域内，表明影响个体表型差异的CNVs广泛存在于基因组中。indel是指基因组中片段长度在1-50bp之间的插入或缺失，可能包括微小CNV，利用indel分析个体基因组可以更好地解释个体的表型差异，因此从DNA水平上对小片段核苷酸的差异进行indel检测在动物分子育种的MAS体系中具有重要意义。

在基因组中，CNV通常发生的区域含有大片段序列重复(Homologousrepeats)或SD序列(Segmentalduplications)。SD序列是指由于基因组重排产生的长度大于1kb串联重复的DNA片段，且序列之间具有90％以上的同源性(Redonetal2006)。

CNV形成的变异机制主要有：非等位同源重组NAHR(Non-allelichomologousrecombination)、非同源末端连接NHEJ(Non-homologousendjoining)、复制滑动(Replicationslippage)和反转录座(Retrotransposition)。

为探索从基因组CNVs到表型变化的作用机理，科研人员通过大量的假设和实验验证，认为CNVs影响表型的作用机制主要有以下几个方面：1)小片段的重复、缺失/插入，改变单个基因或与其临近的几个基因，直接导致基因剂量的改变、使相关的蛋白质的表达量的减少或增加，进而引起表型的变化。2)DNA片段的倒位，功能基因倒位至无活性异染色体区域，使基因不表达或表达量极少，从而导致表型的变化。3)调控基因转录调控因子，间接影响基因表达量。

另外，有些CNVs具有一定的干扰效应，但涉及到的区域通长不会引起重要的功能基因改变。正常个体的一个基因发生拷贝数变异不一定会导致表型的相关改变，因为很多表型都是多基因控制的数量性状，该基因发生CNVs所产生的功能缺失会被其他功能类似的基因补偿，从而缓冲了这种不平衡作用。所以，在群体遗传研究中，微小CNV(插入/缺失)作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。因此，indel在育种的研究中具重要意义，倍受动物育种专家的青睐。

插入/缺失(indel)是DNA或蛋白质序列水平上发生频率仅次于残基替换的进化改变，indel多态性是基因组中一种特殊类型的二等位基因遗传标记，表现为基因组中插入或缺失了不同大小的小片段DNA。indel大致分成以下5大类：(1)单碱基对的插入/缺失；(2)单一碱基的插入/缺失；(3)重复单元为2～15碱基的多碱基对插入/缺失；(4)转座子插入/缺失；(5)任意DNA序列的插入/缺失多态性。随着比较基因组学的深入研究，indel为理论研究和遗传育种应用研究提供了大量的生物信息，其作为新一代的遗传学鉴定标记，兼具SNP的优点，与SNP相比，均是源于单突变事件，其突变频率较低，约为10^-8，相对比较稳定。在结构上属于二等位基因多态性，等位基因都固定且已知，能够通过很小的扩增子进行扩增(<50bp)，提高了扩增高度降解DNA的成功率。作为一种重要的遗传标记，indel的研究最早聚焦在分子生物学及生物医学领域。遍布于整个基因组的indel频率仅次于SNP，位居第二，其中约三分之一位于已知的基因区域内，还有一些位于决定基因功能的关键性区域，如启动子区和外显子区。分子生物学家最早将其用于基因表型相关的研究，希望通过将人类性状、疾病症状或是易感性进行联系，从而达到基因诊断和治疗的目的。2005年，Bhangale等报道了一种能够从目的基因中全面识别indel变异的方法，并应用该方法从330个备选基因中找到2393个indel变异位点，得出人类基因组中插入/缺失态出现的频率高于插入多态性的结论，同时提出，indel和SNP的形成机制可能不同，但其进化史是相似的。然而相关的后续报道并不是很多，甚至在近几年有递减的趋势。

随着经济发展和人们生活水平的不断提高，社会对黄牛产品的需求不断加强，但由于近年来牛肉、牛奶等产品严重短缺，所以黄牛育种专家期望更早、更好、更快地获得黄牛产品的优良品种。在高产、优质和高效的黄牛育种目标上，黄牛育种专家一直关注生长发育性状，但仅靠传统育种手段是不行的，还需要依靠分子育种技术。即首先在DNA水平上筛查和检测与黄牛生长发育性状密切相关的DNA标记，然后进行基因多态性的检测，最后是进行基因多态性与生长发育性状的关联分析，从而实现MAS和实现早期诊断选择。

精子相关抗原17(Sperm-associatedantigen17,SPAG17)基因，又叫做鞭毛中央对相关(Flagellarcentralpair-associated，PF6)基因。在人上SPAG17基因还通过影响骨骼的生长从而影响人的身高。人类的身高是一种可遗传的典型多基因性状，是许多生长发育过程的结果。大多数与身高相关的基因在骨骼发展中发挥作用。SPAG17基因的单核苷酸多态性与人类身高有关。然而,目前尚不清楚这个基因如何影响线性增长。MariaEugeniaTeves等(2015)表明，SPAG17基因有针对性的突变会导致骨骼畸形。后肢在突变体长度明显短于野生型老鼠。研究显示成熟的股骨和胫骨的差异表明改变肢体模式。形态学研究显示，通过增加骨小梁面积增加与骨区域总面积的比率可以增加骨形成，导致在股骨骨髓面积/总面积的比率减少。通过硝酸银染色证明可以增加股骨的矿物。此外，骨钙素和具有锌指结构的转录因子在突变小鼠股骨中比野生型老鼠中表达要高。这些数据表明，股骨骨缩短可能是由于过早骨化。另一方面，由于软骨和骨骼发育延迟胫骨似乎稍短。形态学研究显示，在生长板和骨的形成减少。这些缺陷并不影响骨矿化，尽管初级骨的体积和骨钙素水平和具有锌指结构的转录因子变得更高。SPAG17基因在骨骼生长和矿化的调控，也许因为它在初级纤毛的软骨细胞和成骨细胞的角色。XuKang等(2015)揭示SPAG17基因与雄性不育相关。Silina,Karina等(2011)揭示SPAG17基因与癌症的免疫抗原相关。

目前，对SPAG17基因的研究主要集中在与骨骼相关方面的研究上，Weedon等(2008)；Takeuchi等(2009)；N'Diaye等(2011)；Teves等(2015)研究表明SPAG17基因与人的身高相关。对中国地方黄牛SPAG17基因遗传变异领域的研究匮乏，该基因位点的功能研究更是空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黄牛SPAG17基因插入/缺失的检测方法及其应用，从而加快良种选育速度。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种黄牛SPAG17基因插入/缺失的检测方法，以待测夏南牛(黄牛品种)全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，通过PCR扩增夏南牛SPAG17基因片段，该片段包含夏南牛SPAG17基因8-bp插入/缺失多态性位点；再对PCR扩增得到的片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定夏南牛SPAG17基因8-bp插入/缺失多态性位点的插入/缺失多态性；所述的引物对P1为：

上游引物：5’-ACATGGGAGAAATACCCG-3’；

下游引物：5’-GTCTGAAGATGGCAAACG-3’。

所述PCR的扩增反应程序为：

1)94℃预变性5min，然后进入步骤2)；

2)94℃变性30s，复性30s，72℃延伸20s；共18个循环；第一个循环中复性温度为68℃，剩余每个循环中复性温度较上一个循环降低1℃，然后进入步骤3)；

3)94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸20s；共24个循环，然后进入步骤4)；

4)72℃延伸10min。

所述琼脂糖凝胶电泳采用的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.5％。

所述插入/缺失多态性为：插入/插入基因型表现为255bp一条带纹；插入/缺失基因型表现为247bp和255bp两条带纹；缺失/缺失基因型表现为247bp一条带纹。

一种黄牛SPAG17基因插入/缺失的检测试剂盒，该试剂盒包括用于PCR扩增夏南牛SPAG17基因中8-bp插入/缺失多态位点的引物对P1。

上述黄牛SPAG17基因插入/缺失的检测方法在夏南牛分子标记辅助选择育种中的应用。

所述插入/缺失多态位点的插入/缺失(ID)基因型可作为夏南牛体斜长和体高指数的DNA标记。

本发明的有益效果体现在：

本发明根据SPAG17基因的序列设计引物，分别以3种黄牛品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳后获得黄牛的SPAG17基因的插入/缺失多态性(AC_000160:g146755-146756insTCCTGACT的插入/缺失多态性)。

本发明对3个黄牛品种的插入/缺失多态性位点基因型进行了检测和基因频率分析，对上述插入/缺失多态性位点与黄牛部分生长性状(如体高、体斜长)进行关联分析，结果表明该位点能够作为提高夏南牛体高(P＝0.038)和体斜长(P＝0.041)的分子标记。

结合以上实验结果，本发明提供了针对该插入/缺失多态性位点的检测方法，通过设计的引物经PCR扩增后再经琼脂糖凝胶电泳鉴定，能够简单、快速、低成本、精确的检测其插入/缺失的多态性，从而为黄牛良种选育提供依据，有利于快速建立生长发育性状优良的黄牛遗传资源群体，加快良种选育速度。

附图说明

图1为黄牛SPAG17基因扩增在AC_000160:g146755-146756insTCCTGACT位点的8-bp插入/缺失(indel)多态位点的PCR产物电泳结果，包含DD以及II基因型的结果，M为MarkerI。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明利用PCR扩增方法对黄牛SPAG17基因在AC_000160:g146755-146756insTCCTGACT位点突变可能产生的插入/缺失多态性进行检测，并将其与生长性状进行关联分析，验证其是否可以作为黄牛分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。

(一)实验药品与试剂

1.生化试剂与生物学试剂：①TaqDNA聚合酶(购自Fermantas即MBI公司)；②；蛋白酶K(购自华美生物工程公司)③；MarkerI(购自天根生化科技(北京)有限公司)。

2.普通试剂：普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品：Tris、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化乙锭(EB)、溴酚蓝、二甲基苯氰FF、乙酸、蔗糖、硼酸、琼脂糖等。

3.溶液与缓冲液：所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。高压灭菌条件为15bf/in(1.034×10⁵Pa)，25min。试剂配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》。

1)提取组织样DNA所用溶液：除了基因组DNA提取时的公用溶液外，还配制以下试剂：①2mol/LNaCl：11.688g溶于水，定容至100mL，高压灭菌。②组织DNA提取液(100mL)：lmol/LTris-Cl(pH8.0)lmL，0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL，2mol/LNaCl5mL，定容至100mL。

2)琼脂糖电泳分析所用溶液:①1×TBE缓冲液：取10×TBE100mL定容至1000mL。②上样缓冲液：0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青FF，40.0％(w/v)蔗糖水溶液。

(二)黄牛SPAG17基因在AC_000160:g146755-146756insTCCTGACT位PCR引物的设计

在NCBI上检索牛SPAG17基因的序列，并利用PrimerPremier5.0设计能够扩增包含牛SPAG17基因第22内含子区域8-bpindel位点的PCR引物对P1，其引物序列如下：

上游引物：5’-ACATGGGAGAAATACCCG-3’；

下游引物：5’-GTCTGAAGATGGCAAACG-3’；

上述引物对P1对黄牛基因组扩增，能够扩增包含黄牛SPAG17基因在AC_000160:g146755-146756insTCCTGACT位点的indel的不同的基因型片段。理论上，当146755与146756nt之间的TCCTGACT缺失时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测之后是247bp大小的一条带纹；146755与146756nt之间的TCCTGACT插入时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测之后是255bp大小的一条带纹。146755与146756nt之间的TCCTGACT插入/缺失时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测之后是247bp+255bp两条带纹。为此，根据理论分析结果，插入/插入(II)基因型表现为255bp一条带纹；插入/缺失(ID)基因型表现为247bp+255bp两条带纹；缺失/缺失(DD)基因型表现为247bp一条带纹。

(三)以引物对P1进行PCR扩增待测黄牛的SPAG17基因片段

1、黄牛样本的采集

实验所用的动物为3个品种黄牛共计629个样本，其中：

1)秦川牛(QC)样品252份采自陕西省扶风县秦川牛保种场。采用随机采样方式采取个体耳组织样品，这些样品为70％乙醇保存，冰盒低温带回实验室后置于-80℃冻存。

2)晋南牛(JN)样品共186份，采自陕西省运城县保种场。采用随机采样方式采取牛场个体的耳组织样品，这些样品为70％乙醇保存，冰盒低温带回实验室后置于-80℃冻存。

3)夏南牛(XN)样品共191份，采自河南省泌阳畜牧局夏南牛保种场。采用随机采样方式采取牛场个体的耳组织样品，这些样品为70％乙醇保存，冰盒低温带回实验室后置于-80℃冻存。

表1黄牛样本的采集

2、组织样品DNA的提取与分离

1)取约10mg耳组织样，放于1.5mL的离心管中，用小剪刀尽量剪碎。

2)加入600μL组织提取液，10％SDS至终浓度为1％，蛋白酶K至终浓度为100μg/mL，55.0℃消化过夜，最好保证组织样较均匀地分布在组织提取液中。

3)将溶液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min。

4)取上清液，加入等体积的酚：氯仿(1：1)，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min。

5)取上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min。

6)取上清液，加入2倍体积的冰冷无水乙醇和1/10体积的3mol/L乙酸钠，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，直至液体清亮，出现白色絮状DNA。

7)挑出DNA，放进一个1.5mL的离心管中，加入500μL70％乙醇，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，然后12000r/min离心3～5min，小心倒掉乙醇，将管倒置于吸水纸上。

8)再一次向离心管中加入500μL70％乙醇，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，然后12000r/min离心3～5min，小心倒掉乙醇，将管倒置于吸水纸上。

9)待干燥后，加入60μL灭菌超纯水，为使其完全溶解，4℃保存过夜，待检测。

3、琼脂糖凝胶电泳检测DNA

1)将凝胶电泳槽洗干净，用胶带纸将两端封住，插上梳子。

2)称取0.24g的琼脂糖，转入三角瓶中，加入1×TBE30mL使其悬浮，微波炉中火加热，待沸腾2次拿出，待其冷却至不烫手时加入终浓度为0.5μg/mL的EB。然后快速将琼脂糖溶液导入，轻微摇动，防止出现气泡。

3)混匀后(约60℃)，立即将琼脂糖溶液到入槽内。如出现气泡，立即用移液器移出。

4)完全冷却凝固(约25～40min)后，拔掉梳子，去掉两端胶带纸，将凝胶移入电泳槽中。

5)向电泳槽中加入1×TBE缓冲液，使液面高出胶面2～5mm。

6)取DNA样品2～4μL，加2μL上样缓冲液后混匀，统一上样(注意枪头的顺序应前后对应)，并将DNAMarker加在一边。

7)80V电压电泳2h。

8)在紫外分析仪上观察，如果有RNA则需要纯化，如果有明显降解不能用，需重新提取相应样品的DNA。

4、DNA的纯化

1)500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到100μg/mL。

2)55℃保温10h左右。

3)等体积苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)和氯仿分别抽提一次。

4)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中。

5)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA。

6)倒掉液体，70％乙醇洗涤后凉干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

5、分光光度法检测DNA

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度(ng/μL)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，存于-20℃备用，其余的存放于-80℃。

6、PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mLEppendorfPCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；PCR反应体系包括2×TaqPCRSuperMix(包括TaqDNA聚合酶、dNTPs和优化的反应缓冲液，浓度为2×)12.5μL；上游引物1.0μL；下游引物1.0μL(上下游引物浓度为10pmol/μL)；基因组DNA(浓度为50ng/μL黄牛基因组DNA)1.0μL；去离子水9.5μL；共25μL体积的PCR扩增体系。

7、PCR反应的程序

PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，68℃复性30s，72℃延伸20s，18个循环，每个循环中复性温度降低1℃；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸20s，24个循环之后，72℃延伸10min，10℃保存扩增产物。

(四)扩增PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析

1)制作3.5％的琼脂糖凝胶，点样后120V电压电泳2h，电泳结束后EB染色；

2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RADGelDoc2000凝胶成像系统成像；

3)根据琼脂糖凝胶电泳成像分析indel多态性

用BIO-RADGelDoc2000凝胶成像系统照相分析，判断插入/缺失(indel)的多态性：

黄牛基因组的SPAG17基因在AC_000160:g146755-146756insTCCTGACT位点的插入/缺失(indel)的多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为：插入/缺失(ID)基因型表现为247bp和255bp两条条带，插入/插入(II)基因型表现为255bp一条条带，缺失/缺失(DD)基因型表现为247bp一条条带，参见图1。

(五)黄牛SPAG17基因indel位点的频率统计分析

1)基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_TT＝N_TT/N，其中P_TT代表某一位点的TT基因型频率；N_TT表示群体中具有TT基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_T＝(2N_TT+N_Ta1+N_Ta2+N_Ta3+N_Ta4+……+N_Tan)/2N

式中，P_T表示等位基因T频率，N_TT表示群体中具有TT基因型的个体数量，N_Tai表示群体中具有Tai基因型个体数量，a1～an为等位基因T的n个互不相同的复等位基因。

在不同黄牛品种SPAG17基因8-bp插入/缺失(indel)位点中的等位基因型频率及等位基因频率如表2所示。夏南牛、秦川牛、晋南牛的等位基因“I”的频率分别为0.116、0.022和0.048，相应的等位基因“D”的频率为0.884、0.978和0.952，等位基因“I”和“D”的频率均大于1％，故为稳定存在插入/缺失(indel)类型。

表2黄牛SPAG17基因在AC_000160:g146755-146756insTCCTGACT位点上的indel基因频率分布表

(六)黄牛SPAG17基因indel位点基因效应的关联分析

基因型数据：PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳识别的基因型。

生产数据：秦川牛、晋南牛和夏南牛体长、体高、体重等体尺性状数据。

关联分析模型：利用SPSS(18.0)软件来分析品种，不同因素与生长形状相关性。首先要对所得数据描述性的统计分析，来确定是不是存在离群值。然后根据数据的特性，利用方差分析、多元线性模型或者t分析进而来分析基因型的效应。在数据处理的过程中，依据影响体重、体尺生长发育的指标的因素的不同，考虑到个体的效应，基因之间的互作以及基因型的效应，采用固定的模型来进行相关分析。此外，根据实际条件来进行取舍，完整模型如下所示：Y＝μ+G+E，其中，Y：个体表型记录；u：总体均值；G：标记基因型效应；E：随机误差。

结果表明：黄牛SPAG17基因不同基因型频率与等位基因频率的分布对黄牛某些生产性状(如体高，体斜长)的影响均有显著差异。

由表3可以看出，在对191只夏南牛群体的研究中，SPAG17基因的8-bp插入/缺失(indel)多态性对夏南牛的体高(P＝0.038)和体斜长(P＝0.041)均有显著影响(P<0.05)。

因此，SPAG17基因8-bp插入/缺失(indel)是夏南牛生长发育的插入/缺失(indel)遗传标记。

表3SPAG17基因indel多态性对夏南牛生长性状的影响

注：生产性状不同的上标(a,b)表示有显著性不同。

Claims (7)

1.一种黄牛SPAG17基因插入/缺失的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：以待测夏南牛全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，通过PCR扩增夏南牛SPAG17基因片段，该片段包含夏南牛SPAG17基因8-bp插入/缺失多态性位点；再对PCR扩增得到的片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定夏南牛SPAG17基因8-bp插入/缺失多态性位点的插入/缺失多态性；所述的引物对P1为：

上游引物：5’-ACATGGGAGAAATACCCG-3’；

下游引物：5’-GTCTGAAGATGGCAAACG-3’。

2.根据权利要求1所述一种黄牛SPAG17基因插入/缺失的检测方法，其特征在于：所述PCR的扩增反应程序为：

1)94℃预变性5min，然后进入步骤2)；

2)94℃变性30s，复性30s，72℃延伸20s；共18个循环；第一个循环中复性温度为68℃，剩余每个循环中复性温度较上一个循环降低1℃，然后进入步骤3)；

3)94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸20s；共24个循环，然后进入步骤4)；

4)72℃延伸10min。

3.根据权利要求1所述一种黄牛SPAG17基因插入/缺失的检测方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶电泳采用的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.5％。

4.根据权利要求1所述一种黄牛SPAG17基因插入/缺失的检测方法，其特征在于：所述插入/缺失多态性为：插入/插入基因型表现为255bp一条带纹；插入/缺失基因型表现为247bp和255bp两条带纹；缺失/缺失基因型表现为247bp一条带纹。

5.一种黄牛SPAG17基因插入/缺失的检测试剂盒，该试剂盒包括用于PCR扩增夏南牛SPAG17基因中8-bp插入/缺失多态位点的引物对P1，所述的引物对P1为：

上游引物：5’-ACATGGGAGAAATACCCG-3’；

下游引物：5’-GTCTGAAGATGGCAAACG-3’。

6.一种如权利要求1所述黄牛SPAG17基因插入/缺失的检测方法在夏南牛分子标记辅助选择育种中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述插入/缺失多态位点的插入/缺失基因型可作为夏南牛体斜长和体高指数的DNA标记。