CN109628609A

CN109628609A - 中国黄牛ppp2r2b基因4个重复缺失多态性位点的检测方法及应用

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Publication number: CN109628609A
Application number: CN201910011409.6A
Authority: CN
Inventors: 王淑辉; 孙秀柱; 李泽; 樊路杰; 王国艳; 江钧益; 刘世荣; 易晓华
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2019-01-07
Filing date: 2019-01-07
Publication date: 2019-04-16
Anticipated expiration: 2039-01-07
Also published as: CN109628609B

Abstract

本发明公开了一种中国黄牛PPP2R2B基因4个重复缺失多态性位点的检测方法及应用。该方法以中国黄牛全基因组DNA为模板，用引物对P1‑P4通过PCR扩增中国黄牛PPP2R2B基因部分片段；再对PCR扩增得到的片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定中国黄牛PPP2R2B基因上的插入/缺失多态性位点的基因型；该基因的重复缺失多态性不同基因型分别与四种中国黄牛，包括秦川牛、南阳牛、郏县牛与鲁西牛的体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰高等生长性状之间显著相关。该方法可在肉牛生长性状的标记辅助选择育种中应用，有利于快速建立遗传资源优良的中国黄牛种群，从而加快具有优良生长性状的中国黄牛的良种选育速度。

Description

中国黄牛PPP2R2B基因4个重复缺失多态性位点的检测方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术与家畜育种领域，涉及基因插入缺失(indel)的检测方法，特别涉及一种黄牛PPP2R2B基因4个重复缺失多态性位点的检测方法，该方法能够快速、准确检测中国黄牛PPP2R2B基因AC_000164.1位点4个重复缺失多态性，并能够用于中国黄牛分子标记辅助选择育种中的应用。

背景技术

当今中国经济飞速发展，人民生活正步入全面小康，对肉蛋奶等动物源性食品需求量越来越大，对品种和质量的要求日益增高。虽然畜牧业总产值的比例已超过农业总产值的三分之一，但畜牧业总体生产水平仍相对低下。肉牛产业作为畜牧业中的重要组成部分，对于改善人们膳食结构、促进农民增收、满足人们消费需求、促进农村劳动力就业、发展农村经济及推动相关产业发展等方面有着十分重要的意义。改革开放以来，中国肉牛产业取得了较快的发展，但目前我国大量繁育的肉牛普遍存在着品种的良种率较低、生产的牛肉质量档次偏低以及犊牛的生产水平较低等缺点。据中国数据库显示，就存栏牛年头均产肉量而言，发达国家普遍达到80～90公斤，而我国仅为46.98公斤；就肉牛胴体重而言，发达国家多在331公斤/头以上，世界平均水准为205公斤/头，而我国仅为147公斤/头。另外据联合国粮农组织数据库显示，中国本土牛肉产量排在世界前列，但肉牛胴体重排名却显著下降。

杂交改良、品系选育等传统育种因其效率取决于高价值个体的识别，选择强度，繁殖与育种周期和有限的遗传多样性等而传面临突变频率低、繁殖与育种周期长、遗传资源限制等诸多挑战。自分子生物学技术快速发展以来，使基于大量样本的分子标记挖掘和鉴定变得更加简便，大幅推动了分子育种技术的发展。畜牧产业发达的国家针对本国家畜品种的重要经济性状进行数量性状基因座(quantitative trait locus，QTL)定位和主效基因挖掘，利用基因辅助育种(gene-assisted selection，GAS)和分子标记辅助育种(marker-assisted selection，MAS)技术提高了目标性状的选育速度和准确度，培育出一批性状优良的国际知名的优良家畜品种。

高通量测序技术的发展使得插入/缺失(insertion-deletion，InDel)标记开发成本降低，InDel适用于全基因组分子标记的开发。与其他分子标记相比，基因组同一位点发生相同长度大小的InDel突变的几率极小，可看作同一来源，所以InDel标记准确性高、变异稳定，避免了由于特异性和复杂性导致的后续分析模糊。因此，引入标记辅助选择的分子育种手段(InDel)开发有效的生长发育分子标记，分析影响肉牛生产增长的因素，找出促进良种产业化的动因，提高目标性状的选育速度和准确度，对于加快牛肉产量增长具有重要意义。不仅可以获得肉牛最基本的生物遗传信息与自主知识产权的功能性新基因，而且能为我国地方牛品种基因资源研究和遗传改良提供理论基础。

蛋白磷酸酶2调节亚基Bβ(Protein phosphatase 2 regulatory subunit Bbeta，PPP2R2B)位于牛第7号染色体，有9个外显子，属于磷酸酶2调节亚基B家族，此基因的表达产物蛋白磷酸酶2(Protein phosphatase 2，PP2A)是四种主要的Ser/Thr磷酸酶之一。PPP2R2B与多种基因互作，其中PP2A通过去磷酸化来负调控PI3(磷脂酰肌醇)激酶/Akt信号通路，而PI3Ks信号参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。此外，其dSTRIPAK PP2A复合物在发育过程中通过去磷酸化阻止Hippo通路激活导致细胞凋亡增加，组织生长减少，是Hpo信号的主要调控因子，与细胞生长和分裂的负调控有关，在调节代谢等方面有着重要作用。因此，PPP2R2B基因碱基序列的插入缺失可能影响牛的生长性状。总的来说，基于全基因组分析和之前的研究，通过分析PPP2R2B基因多态性中对黄牛生长性状的促进作用，可为肉牛高效选育提供依据。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种中国黄牛PPP2R2B基因4个重复缺失多态性位点的检测方法及应用，即利用PCR扩增方法检测中国黄牛PPP2R2B基因的插入/缺失多态性，从而加快良种选育速度。

为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：

一种中国黄牛PPP2R2B基因重复缺失多态性的检测方法，其特征在于，该方法以中国黄牛全基因组DNA为模板，用引物对P1、P2、P3和P4通过PCR扩增中国黄牛PPP2R2B基因部分片段(具体位于基因的内含子区)；再对PCR扩增得到的片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定中国黄牛PPP2R2B基因上的插入/缺失多态性位点的基因型；其中：

引物对P1为：

上游引物：5'-GCATCAGCCCTAAATCCCA-3'；

下游引物：5'-CAGAAAATATCAAAATGCCAGAA-3'。

引物对P2为：

上游引物：5'-AGTCTTAGTTTAGAGGGCTTCC-3'；

下游引物：5'-GCTTAGTCATTCAGCCATTTT-3'。

引物对P3为：

上游引物：5'-GCTGATCCCTCAAATATGGC-3'；

下游引物：5'-TGAAAGCGTCAAGAGCAAG-3'。

引物对P4为：

上游引物：5'-CAACTGGAAAAGCTAAGGC-3'；

下游引物：5'-TGGAATCAGATGGAAGAAAG-3'。

根据本发明，所述中国黄牛PPP2R2B基因上的插入/缺失多态性位点是指：

中国黄牛PPP2R2B基因位点1(L1)AC_000164.1：g.60192910_60192929delGCTTGCTATATGTGATTCTG；

中国黄牛PPP2R2B基因位点2(L2)AC_000164.1：g.60117040_60117065delGCCTGAAAAATCCCATGGACAGAGAA；

中国黄牛PPP2R2B基因位点3(L3)AC_000164.1：g.60254430_60254454delTCCCCAATCCAGCAATGCTGGATGT；和

中国黄牛PPP2R2B基因位点4(L4)AC_000164.1：g.60149610_60149643delCATCTTTTCAAAATTTCTATAGCATTCTATAGCA；

上述四个中国黄牛PPP2R2B基因位点上存在的不同的重复缺失多态性片段。

进一步地，所述PCR扩增的反应程序为：

95.0℃预变性5min；95.0℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸20s，2个循环；之后每2个循环降退火温2-3℃；94.0℃变性30s，53℃退火30s，72.0℃延伸20s，30个循环；最后72.0℃延伸10min，所得的扩增产物4℃条件下保存。

所述琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度为2.0-3.0％的琼脂糖凝胶。

所述电泳结果鉴定中国黄牛PPP2R2B基因上的插入/缺失(Indel)多态性4个位点的基因型分别为：

电泳结果鉴定中国黄牛PPP2R2B基因上位点1(L1)的插入/缺失多态性位点的基因型分别为：

插入/插入(II)基因型，表现为197bp一条带纹；

插入/缺失(ID)基因型，表现为197bp和177bp两条带纹；

缺失/缺失(DD)基因型，表现为177bp一条带纹；

其中，缺失/缺失(DD)基因型作为秦川牛生长性状的分子标记，能够提高中国黄牛体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰高等生长性状；插入/缺失(ID)基因型作为南阳牛、郏县牛生长性状的分子标记，能够提高中国黄牛体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰高等生长性状；插入/插入(II)基因型作为鲁西牛生长性状的分子标记，能够提高中国黄牛体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰高等生长性状。

电泳结果鉴定中国黄牛PPP2R2B基因上位点2(L2)的插入/缺失多态性位点的基因型分别为：

插入/插入(II)基因型，表现为235bp一条带纹；

插入/缺失(ID)基因型，表现为235bp和209bp两条带纹。

其中，插入/缺失(ID)基因型作为秦川牛、南阳牛、鲁西牛、郏县牛生长性状的分子标记，能够提高中国黄牛体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰高生长性状。

所述电泳结果鉴定中国黄牛PPP2R2B基因上位点3(L3)的插入/缺失多态性位点的基因型分别为：

插入/插入(II)基因型，表现为284bp一条带纹；

插入/缺失(ID)基因型，表现为284bp和259bp两条带纹；

缺失/缺失(DD)基因型，表现为259bp一条带纹。

其中，插入/缺失(ID)基因型作为秦川牛、南阳牛生长性状的分子标记，能够提高中国黄牛体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰高等生长性状；插入/插入(II)基因型作为鲁西牛、郏县牛生长性状的分子标记，能够提高中国黄牛体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰高等生长性状。

所述电泳结果鉴定中国黄牛PPP2R2B基因上位点4(L4)的插入/缺失多态性位点的基因型分别为：

插入/插入(II)基因型，表现为247bp一条带纹；

插入/缺失(ID)基因型，表现为247bp和213bp两条带纹；

缺失/缺失(DD)基因型，表现为213bp一条带纹。

其中，插入/缺失(ID)基因型作为秦川牛、南阳牛、郏县牛生长性状的分子标记，能够提高中国黄牛体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰高等生长性状；插入/插入(II)基因型作为鲁西牛生长性状的分子标记，能够提高中国黄牛体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰高等生长性状。

本发明给出一种中国黄牛PPP2R2B基因4个重复缺失多态性位点的检测试剂盒，其特征在于，包括用于PCR扩增中国黄牛PPP2R2B基因上重复缺失多态性位点的引物对P1-P4，其中：

引物对P1为：

上游引物：5'-GCATCAGCCCTAAATCCCA-3'；

下游引物：5'-CAGAAAATATCAAAATGCCAGAA-3'。

引物对P2为：

上游引物：5'-AGTCTTAGTTTAGAGGGCTTCC-3'；

下游引物：5'-GCTTAGTCATTCAGCCATTTT-3'。

引物对P3为：

上游引物：5'-GCTGATCCCTCAAATATGGC-3'；

下游引物：5'-TGAAAGCGTCAAGAGCAAG-3'。

引物对P4为：

上游引物：5'-CAACTGGAAAAGCTAAGGC-3'；

下游引物：5'-TGGAATCAGATGGAAGAAAG-3'。

根据申请人的研究表明，中国黄牛PPP2R2B基因4个重复缺失多态性的检测方法得到的中国黄牛PPP2R2B基因上的插入/缺失多态性位点的基因型用于中国黄牛分子标记辅助选择育种中的应用。

与现有技术相比，本发明的中国黄牛PPP2R2B基因4个重复缺失多态性位点的检测方法，带来的技术创新体现在：

1、根据电泳结果鉴定表明，中国黄牛PPP2R2B基因1(L1)AC_000164.1：g.60192910_60192929del，中国黄牛PPP2R2B基因2(L2)AC_000164.1：g.60117040_60117065del，中国黄牛PPP2R2B基因3(L3)AC_000164.1：g.60254430_60254454del，中国黄牛PPP2R2B基因位点4(L4)AC_000164.1：g.60149610_60149643del位存在的不同的重复缺失多态性设计引物，以中国黄牛基因组DNA为模板，进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，能够简单、快速、低成本、精确地检测中国黄牛PPP2R2B基因4个位点的重复缺失多态性。

2、根据对中国黄牛PPP2R2B基因4个位点重复缺失多态性位点进行基因型和基因频率分析，即对上述重复缺失多态性位点与中国黄牛相关生长性状(体高、胸围、胸宽、胸深、腰高、十字部高、体斜长、臀长、腰角宽、腹围、十字部高、体重、重高比)进行关联分析，结果表明这4个位点能够作为中国黄牛体尺性状(P<0.05或P<0.01)的分子标记，根据不同位点选择具有不同优势基因型的个体，有利于快速建立遗传资源优良的中国黄牛种群，从而加快具有优良生长性状的中国黄牛的良种选育速度。

附图说明

图1(A₁)为引物对P1扩增中国黄牛PPP2R2B基因2.5％琼脂糖凝胶电泳的结果图，图中，M表示Marker；(B₁)为中国黄牛PPP2R2B基因PCR扩增产物测序图；其中，(a₁)图是II基因型，(b₁)图是DD基因型，虚射线内对应的部分表示20-bp重复缺失序列：AC_000164.1：g.60192910_60192929del GCTTGCTATATGTGATTCTG。

图2(A₂)为引物对P2扩增中国黄牛PPP2R2B基因2.5％琼脂糖凝胶电泳的结果图，图中，M表示Marker；(B₂)为中国黄牛PPP2R2B基因PCR扩增产物测序图；其中，(a₂)图是II基因型，(b₂)图是ID基因型，虚射线内对应的部分表示26-bp重复缺失序列：AC_000164.1：g.60117040_60117065del GCCTGAAAAATCCCATGGACAGAGAA。

图3(A₃)为引物对P3扩增中国黄牛PPP2R2B基因2.5％琼脂糖凝胶电泳的结果图，图中，M表示Marker；(B₃)为中国黄牛PPP2R2B基因PCR扩增产物测序图；其中，(a₃)图是DD基因型，(b₃)图是II基因型，虚射线内对应的部分表示25-bp重复缺失序列：AC_000164.1：g.60254430_60254454ins CCCCAATCCAGCAATGCTGGATGTT。

图4(A₄)为引物对P4扩增中国黄牛PPP2R2B基因2.5％琼脂糖凝胶电泳的结果图，图中，M表示Marker；(B₄)为中国黄牛PPP2R2B基因PCR扩增产物测序图；其中，(a₄)图是II基因型，(b₄)图是DD基因型，虚射线内对应的部分表示32-bp重复缺失序列：AC_000164.1：g.60149610_60149643ins CTATAGCATTCTATAGCATCTTTTCAAAATTT。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明。

具体实施方式

本实施例给出四种以中国黄牛全基因组DNA为模板，用引物对P1-P4通过PCR扩增中国黄牛PPP2R2B基因部分片段；再对PCR扩增得到的片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定中国黄牛PPP2R2B基因上的插入/缺失多态性位点的基因型；其中：

引物对P1为：

上游引物：5'-GCATCAGCCCTAAATCCCA-3'；

下游引物：5'-CAGAAAATATCAAAATGCCAGAA-3'。

引物对P2为：

上游引物：5'-AGTCTTAGTTTAGAGGGCTTCC-3'；

下游引物：5'-GCTTAGTCATTCAGCCATTTT-3'。

引物对P3为：

上游引物：5'-GCTGATCCCTCAAATATGGC-3'；

下游引物：5'-TGAAAGCGTCAAGAGCAAG-3'。

引物对P4为：

上游引物：5'-CAACTGGAAAAGCTAAGGC-3'；

下游引物：5'-TGGAATCAGATGGAAGAAAG-3'。

引物对P1所述中国黄牛PPP2R2B基因上的插入/缺失多态性位点是指中国黄牛PPP2R2B基因：AC_000164.1g.60192910_60192929位点上存在的20-bp重复缺失多态性片段GCTTGCTATATGTGATTCTG。

引物对P2所述中国黄牛PPP2R2B基因上的插入/缺失多态性位点是指中国黄牛PPP2R2B基因：AC_000164.1g.60117040_60117065位点上存在的26-bp重复缺失多态性片段GCCTGAAAAATCCCATGGACAGAGAA。

引物对P3所述中国黄牛PPP2R2B基因上的插入/缺失多态性位点是指中国黄牛PPP2R2B基因：AC_000164.1g.60254430_60254454位点上存在的25-bp重复缺失多态性片段CCCCAATCCAGCAATGCTGGATGTT。

引物对P4所述中国黄牛PPP2R2B基因上的插入/缺失多态性位点是指中国黄牛PPP2R2B基因：AC_000164.1g.60149610_60149643位点上存在的32-bp重复缺失多态性片段CTATAGCATTCTATAGCATCTTTTCAAAATTT。

本实施例中，PCR扩增的反应程序为：

95.0℃预变性5min；95.0℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸20s，2个循环；之后每2个循环降退火温2℃-3℃；94.0℃变性30s，53℃退火30s，72.0℃延伸20s，30个循环；最后72.0℃延伸10min，扩增产物于4℃条件下保存。

本实施例中，琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度为2.0-3.0％的琼脂糖凝胶。

电泳结果鉴定中国黄牛PPP2R2B基因上的插入/缺失多态性位点的基因型分别为：

中国黄牛PPP2R2B基因上位点1(L1)的插入/缺失多态性位点的基因型分别为：

插入/插入(II)基因型，表现为197bp一条带纹；

插入/缺失(ID)基因型，表现为197bp和177bp两条带纹；

缺失/缺失(DD)基因型，表现为177bp一条带纹。

中国黄牛PPP2R2B基因上位点2(L2)的插入/缺失多态性位点的基因型分别为：

插入/插入(II)基因型，表现为235bp一条带纹；

插入/缺失(ID)基因型，表现为235bp和209bp两条带纹。

其中，插入/缺失(ID)基因型作为秦川牛、南阳牛、鲁西牛、郏县牛生长性状的分子标记，能够提高中国黄牛体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰高等生长性状。

中国黄牛PPP2R2B基因上位点3(L3)的插入/缺失多态性位点的基因型分别为：

插入/插入(II)基因型，表现为284bp一条带纹；

插入/缺失(ID)基因型，表现为284bp和259bp两条带纹；

缺失/缺失(DD)基因型，表现为259bp一条带纹。

中国黄牛PPP2R2B基因上位点4(L4)的插入/缺失多态性位点的基因型分别为：

插入/插入(II)基因型，表现为247bp一条带纹；

插入/缺失(ID)基因型，表现为247bp和213bp两条带纹；

缺失/缺失(DD)基因型，表现为213bp一条带纹。

其中，插入/缺失(ID)基因型作为秦川牛、南阳牛、郏县牛生长性状的分子标记，能够提高中国黄牛体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰高等生长性状；插入/插入(II)基因型作为鲁西牛生长性状的分子标记，能够提高中国黄牛体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰高等生长性状

上述中国黄牛PPP2R2B基因20-bp、26-bp、25-bp、32-bp重复缺失多态性的检测方法可以扩展到中国黄牛PPP2R2B基因20-bp、26-bp、25-bp、32-bp重复缺失多态性的检测试剂盒的应用，该试剂盒至少包括用于PCR扩增中国黄牛PPP2R2B基因上20-bp、26-bp、25-bp、32-bp重复缺失多态性位点的引物对P1-P4，所述的引物对P1为：

上游引物：5'-GCATCAGCCCTAAATCCCA-3'；

下游引物：5'-CAGAAAATATCAAAATGCCAGAA-3'。

所述的引物对P2为：

上游引物：5'-AGTCTTAGTTTAGAGGGCTTCC-3'；

下游引物：5'-GCTTAGTCATTCAGCCATTTT-3'。

所述的引物对P3为：

上游引物：5'-GCTGATCCCTCAAATATGGC-3'；

下游引物：5'-TGAAAGCGTCAAGAGCAAG-3'。

所述的引物对P4为：

上游引物：5'-CAACTGGAAAAGCTAAGGC-3'；

下游引物：5'-TGGAATCAGATGGAAGAAAG-3'。

以下是发明人给出的具体实施例。

该实施例利用PCR扩增方法对中国黄牛PPP2R2B基因在AC_000164.1：g.60192910_60192929、AC_000164.1：g.60117040_60117065、AC_000164.1：g.60254430_60254454、AC_000164.1：g.60149610_60149643位点突变可能产生的重复缺失多态性进行检测，并将其与中国黄牛相关生长性状(体高、胸围、胸宽、胸深、腰高、十字部高、体斜长、臀长、腰角宽、腹围、十字部高、体重、重高比)进行关联分析，验证其是否可以作为中国黄牛分子育种中辅助选择的分子标记。

1、实验药品与试剂

1.1生化试剂与生物学试剂：

②2×Taq PCR Mastermix(含染料，购自杭州宝赛生物科技有限公司)；

②蛋白酶K(购自华美生物工程公司)；

③Marker(购自天根生化科技(北京)有限公司)。

1.2普通试剂：

普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品：Tris、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na₂HPO4、KH₂PO4、Tris饱和酚、氯仿、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、核酸染料、乙酸、蔗糖、硼酸、琼脂糖等。

1.3溶液与缓冲液：

所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。高压灭菌条件为15bf/in(1.034x10⁵Pa)，25min。试剂配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》。

具体的溶液与缓冲液如下：

琼脂糖电泳分析所用溶液：0.5×TAE缓冲液：10×TAE50mL定容至1000mL。

2、设计中国黄牛PPP2R2B基因Indel引物

在NCBI上检索猪PPP2R2B基因的序列(猪PPP2R2B基因参考序列AC_000171.1)，并利用Primer-BLAST(NCBI)设计能够扩增包含中国黄牛PPP2R2B基因第60192910-60192929位点、第60117040-60117065位点、第60254430-60254454位点、第60149610-60149643位点的PCR引物对P1-P4，其引物序列如下(设计完成时间为2017年10月)：

所述的引物对P1为：

上游引物：5'-GCATCAGCCCTAAATCCCA-3'；

下游引物：5'-CAGAAAATATCAAAATGCCAGAA-3'。

所述的引物对P2为：

上游引物：5'-AGTCTTAGTTTAGAGGGCTTCC-3'；

下游引物：5'-GCTTAGTCATTCAGCCATTTT-3'。

所述的引物对P3为：

上游引物：5'-GCTGATCCCTCAAATATGGC-3'；

下游引物：5'-TGAAAGCGTCAAGAGCAAG-3'。

所述的引物对P4为：

上游引物：5'-CAACTGGAAAAGCTAAGGC-3'；

下游引物：5'-TGGAATCAGATGGAAGAAAG-3'。

用上述引物对P1、P2、P3和P4对中国黄牛基因组进行PCR扩增，能够扩增包含中国黄牛PPP2R2B基因(AC_000164.1：g.60192910_60192929、AC_000164.1：g.60117040_60117065、AC_000164.1：g.60254430_60254454、AC_000164.1：g.60149610_60149643序列)的核苷酸序列片段。

理论上，当中国黄牛PPP2R2B基因(AC_000164.1:g.60192910_60192929序列)的60192910nt与60192929nt之间的核苷酸序列片段GCTTGCTATATGTGATTCTG缺失时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后会有一条177bp大小的带纹；当中国黄牛PPP2R2B基因(AC_000164.1:g.60192910_60192929序列)的60192910nt与60192929nt之间的核苷酸序列片段GCTTGCTATATGTGATTCTG存在时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后会有一条197bp大小的带纹。当中国黄牛PPP2R2B基因(AC_000164.1:g.60192910_60192929序列)的60192910nt与60192929nt之间的核苷酸序列片段GCTTGCTATATGTGATTCTG同时出现插入和缺失时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后会出现177bp和197bp两条带纹。如图1(A₁)扩增后电泳结果所示，左起第1泳道为Marker(由大到小依次是600bp，500bp，400bp，300bp，200bp和100bp)，第2～6泳道为检测样本。根据理论分析结果，II基因型表现为一条197bp大小的带纹，琼脂糖凝胶电泳结果如图1(A₁)中第2、5泳道，测序峰图为图1(B₁，a)所示；DD基因型表现为一条177bp大小的带纹，琼脂糖凝胶电泳结果如图1(A₁)中第6泳道，测序峰图为图1(B₁，b)所示。ID基因型表现为177bp和197bp两条带纹，琼脂糖凝胶电泳结果如图1(A₁)中第3、4泳道。

理论上，当中国黄牛PPP2R2B基因(AC_000164.1:g.60117040_60117065序列)的60117040nt与60117065nt之间的核苷酸序列片段GCCTGAAAAATCCCATGGACAGAGAA缺失时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后会有一条209bp大小的带纹；当中国黄牛PPP2R2B基因(AC_000164.1:g.60117040_60117065序列)的60117040nt与60117065nt之间的核苷酸序列片段GCCTGAAAAATCCCATGGACAGAGAA存在时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后会有一条235bp大小的带纹。当中国黄牛PPP2R2B基因(AC_000164.1:g.60117040_60117065序列)的60117040nt与60117065nt之间的核苷酸序列片段GCCTGAAAAATCCCATGGACAGAGAA同时出现插入和缺失时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后会出现209bp和235bp两条带纹。如图2(A₂)扩增后电泳结果所示，左起第1泳道为Marker(由大到小依次是600bp，500bp，400bp，300bp，200bp和100bp)，第2～7泳道为检测样本。

根据理论分析结果，II基因型表现为一条235bp大小的带纹，琼脂糖凝胶电泳结果如图2(A₂)中第2、3、4、5泳道，测序峰图为图2(B₂，a)所示；ID基因型表现为209bp和235bp两条带纹，琼脂糖凝胶电泳结果如图2(A₂)中第6、7泳道，测序峰图为图2(B₂，b)所示。

理论上，当中国黄牛PPP2R2B基因(AC_000164.1:g.60254430_60254454序列)的60254430nt与60254454nt之间的核苷酸序列片段TCCCCAATCCAGCAATGCTGGATGT缺失时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后会有一条259bp大小的带纹；当中国黄牛PPP2R2B基因(AC_000164.1：g.60254430_60254454序列)的60254430nt与60254454nt之间的核苷酸序列片段TCCCCAATCCAGCAATGCTGGATGT存在时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后会有一条284bp大小的带纹。当中国黄牛PPP2R2B基因(AC_000164.1：g.60254430_60254454序列)的60254430nt与60254454nt之间的核苷酸序列片段TCCCCAATCCAGCAATGCTGGATGT同时出现插入和缺失时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后会出现259bp和284bp两条带纹。如图3(A₃)扩增后电泳结果所示，左起第1泳道为Marker(由大到小依次是600bp，500bp，400bp，300bp，200bp和100bp)，第2～5泳道为检测样本。根据理论分析结果，II基因型表现为一条284bp大小的带纹，琼脂糖凝胶电泳结果如图3(A₃)中第2、4泳道，测序峰图为图3(B₃，b)所示；DD基因型表现为一条259bp大小的带纹，琼脂糖凝胶电泳结果如图3(A₃)中第3泳道，测序峰图为图3(B₃，a)所示。ID基因型表现为259bp和284bp两条带纹，琼脂糖凝胶电泳结果如图3(A₃)中第5泳道。

理论上，当中国黄牛PPP2R2B基因(AC_000164.1：g.60149610_60149643序列)的60149610nt与60149643nt之间的核苷酸序列片段CATCTTTTCAAAATTTCTATAGCATTCTATAGCA缺失时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后会有一条213bp大小的带纹；当中国黄牛PPP2R2B基因(AC_000164.1：g.60149610_60149643序列)的60149610nt与60149643nt之间的核苷酸序列片段CATCTTTTCAAAATTTCTATAGCATTCTATAGCA存在时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后会有一条247bp大小的带纹。当中国黄牛PPP2R2B基因(AC_000164.1：g.60149610_60149643序列)的60149610nt与60149643nt之间的核苷酸序列片段CATCTTTTCAAAATTTCTATAGCATTCTATAGCA同时出现插入和缺失时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后会出现213bp和247bp两条带纹。如图4(A₄)扩增后电泳结果所示，左起第1泳道为Marker(由大到小依次是600bp，500bp，400bp，300bp，200bp和100bp)，第2～6泳道为检测样本。根据理论分析结果，II基因型表现为一条247bp大小的带纹，琼脂糖凝胶电泳结果如图4(A₄)中第2、7泳道，测序峰图为图4(B₄，b)所示；DD基因型表现为一条213bp大小的带纹，琼脂糖凝胶电泳结果如图4(A₄)中第3、5泳道，测序峰图为图4(B₄，a)所示。ID基因型表现为213bp和247bp两条带纹，琼脂糖凝胶电泳结果如图4(A₄)中第4泳道。

3.引物对P3扩增中国黄牛PPP2R2B基因片段

3.1中国黄牛血样的采集

实验所用的组织样本最后完成采集时间截止到2017年4月。实验所用的动物为秦川牛(n＝255)、郏县牛(n＝138)、鲁西牛(n＝110)、南阳牛(n＝136)，共计639个样本，分别采集陕西省、河南省等地。采用颈动脉采血方式采取个体样品，冰盒低温带回实验室后置于-80℃冻存。

3.2血样中DNA的分离、提取

1)300μl抗凝全血加1000ul PBS，充分混匀，8000rpm离心5min。

2)去上清液，加1000ul PBS，充分混匀，8000rpm离心5min。

3)去上清液，加500μl的消化Buffer(配方为：100mg·L-1蛋白酶K，10mmol·L-1Tris-HCI，15mmol·L-1NaCl，10mmol·L-1EDTA，4g·L-1SDS，pH8.0)，充分混匀，55℃水浴16h。

4)加500μl 25：24的酚氯仿，混匀，13000rpm离心10min。

5)取上清液，加等量的25：24的酚氯仿，混匀，13000rpm离心10min。

6)取上清液，加2倍体积的无水乙醇，轻摇混匀，直到出现絮状沉淀(未见沉淀提示DNA量不多)。

7)15000rpm离心3min。

8)去上清液，加500ul浓度为70％的乙醇，充分混匀，15000rpm离心3min。

9)去上清液，晾干，加50ul的TE至完全溶解，在-20℃条件下保存。

3.3琼脂糖凝胶电泳检测DNA

1)将电泳槽洗干净，将干净的制胶底板放入胶盒中，插上梳子；

2)制作浓度为2.5％的琼脂糖凝胶：

称取0.80g琼脂糖，倒入三角瓶中，加入0.5×TAE40mL使其悬浮，微波炉中加热。待煮沸至溶液透明，没有半透明的颗粒存在时拿出，待其冷却至不烫手时(约60℃)加入1μL的核酸染料，轻微摇动；

3)混匀后，将琼脂糖凝胶立即到入槽内，如出现气泡，用移液器枪头将气泡移出；

4)约20min-30min后，待凝胶完全冷却凝固，拔掉梳子，将凝胶移入电泳槽中；

5)向电泳槽中加入0.5×TAE缓冲液，使液面高出胶面2mm-5mm；

6)取DNA样品6μL，统一上样，并将DNA Marker加在一边；

7)120V电压，电泳35min；

8)在紫外分析仪上观察，如果有RNA则需要纯化，如果有明显降解，需重新提取相应样品的DNA。

3.4DNA的纯化

1)500μL的DNA溶液中加入浓度为10％的SDS，使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到100g/mL，55℃保温10h左右；

2)等体积苯酚：氯仿：异戊醇混合液(苯酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1)和氯仿分别抽提一次；

3)2000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中；

4)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA；

5)倒掉液体，用浓度为70％的乙醇洗涤后晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

3.5分光光度法检测DNA

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度(ng/μL)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数。

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，存于-20℃备用，其余的于-40℃条件下存放。

3.6PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到一个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mLEppendorfPCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时高心后进行PCR扩增；PCR反应体系包括2×TaqPCR Mastermix(包括TaqDNA聚合酶、dNTPs、优化的反应缓冲液和染料)7.5μL；上游引物1μL；下游引物1μL(上、下游引物浓度为10pmol/μL)；基因组DNA(浓度为50ng/μL)0.5μL；去离子水5μL；共15μL体积的PCR扩增体系。

3.7 PCR反应的程序

PCR扩增反应程序为：

95.0℃预变性5min，94.0℃变性30s，68℃退火30s，72.0℃延伸25s，2个循环；

之后每2个循环降退火温度2-3℃；94.0℃变性30s，51℃退火30s，72.0℃延伸25s，30个循环：最后72.0℃延伸10min，4℃保存扩增产物。

4、扩增PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测分析

琼脂糖凝胶电泳检测分以下3步：

1)制作质量浓度为2.5％的琼脂糖凝胶，点样后120V电压，电泳60～80min；

2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统成像；

3)根据琼脂糖凝胶电泳成像分析Indel多态性。

利用BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统照相分析，判断Indel的多态性，参见图1(A₁)，中国黄牛基因组PPP2R2B基因的20-bp重复缺失多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为：

II基因型，表现为197bp一条带纹；

ID基因型，表现为197bp和177bp两条带纹；

DD基因型，表现为177bp一条带纹。

参见图2(A₂)，中国黄牛基因组PPP2R2B基因的26-bp重复缺失多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为：

II基因型，表现为235bp一条带纹；

ID基因型，表现为235bp和209bp两条带纹。

参见图3(A₃)，中国黄牛基因组PPP2R2B基因的25-bp重复缺失多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为：

ID基因型表现为259bp和284bp两条带纹；

II基因型表现为284bp一条带纹；

DD基因型表现为259bp一条带纹。

参见图4(A₄)，中国黄牛基因组PPP2R2B基因的32-bp重复缺失多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为：

II基因型，表现为284bp一条带纹；

ID基因型，表现为284bp和259bp两条带纹；

DD基因型，表现为259bp一条带纹。

5、中国黄牛PPP2R2B基因Indel位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_nm＝N_nn/N，其中P_nm代表某一位点的nn基因型频率；N_nn表示群体中具有nn基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：

P_n＝(2N_nn+N_na1+N_na2+N_na3+N_na4+....+N_nam)/2N

式中，P_n表示等位基因n频率，N_nn表示群体中具有nn基因型的个体数量，N_nai表示群体中具有nai基因型个体数量，a1-am为等位基因n的m个互不相同的复等位基因。

四种中国黄牛PPP2R2B基因位点分别为：

中国黄牛PPP2R2B基因位点1(L1)20-bp重复缺失多态性位点中的基因型频率及等位基因频率如表1A所示；

中国黄牛PPP2R2B基因位点2(L2)26-bp重复缺失多态性位点中的基因型频率及等位基因频率如表1B所示；

中国黄牛PPP2R2B基因位点3(L3)25-bp重复缺失多态性位点中的基因型频率及等位基因频率如表1C所示；

中国黄牛PPP2R2B基因位点4(L4)32-bp重复缺失多态性位点中的基因型频率及等位基因频率如表1D所示。

中国黄牛PPP2R2B基因位点1(L1)中秦川牛的等位基因“I”的频率为0.658，相应的等位基因“D”的频率为0.342；南阳牛的等位基因“I”的频率为0.664，相应的等位基因“D”的频率为0.336；郏县牛的等位基因“I”的频率为0.651，相应的等位基因“D”的频率为0.349；鲁西牛的等位基因“I”的频率为0.651，相应的等位基因“D”的频率为0.349；等位基因“I”和“D”的频率均大于1％，属于稳定存在的Indel类型。

中国黄牛PPP2R2B基因位点2(L2)中秦川牛的等位基因“I”的频率为0.739，相应的等位基因“D”的频率为0.261；南阳牛的等位基因“I”的频率为0.732，相应的等位基因“D”的频率为0.268；郏县牛的等位基因“I”的频率为0.761，相应的等位基因“D”的频率为0.239；鲁西牛的等位基因“I”的频率为0.730，相应的等位基因“D”的频率为0.270；等位基因“I”和“D”的频率均大于1％，属于稳定存在的Indel类型。

中国黄牛PPP2R2B基因位点3(L3)中秦川牛的等位基因“I”的频率为0.703，相应的等位基因“D”的频率为0.297；南阳牛的等位基因“I”的频率为0.652，相应的等位基因“D”的频率为0.348；郏县牛的等位基因“I”的频率为0.657，相应的等位基因“D”的频率为0.343；鲁西牛的等位基因“I”的频率为0.628，相应的等位基因“D”的频率为0.372；等位基因“I”和“D”的频率均大于1％，属于稳定存在的Indel类型。

中国黄牛PPP2R2B基因位点4(L4)中秦川牛的等位基因“I”的频率为0.670，相应的等位基因“D”的频率为0.330；南阳牛的等位基因“I”的频率为0.672，相应的等位基因“D”的频率为0.328；郏县牛的等位基因“I”的频率为0.679，相应的等位基因“D”的频率为0.321；鲁西牛的等位基因“I”的频率为0.662，相应的等位基因“D”的频率为0.338；等位基因“I”和“D”的频率均大于1％，属于稳定存在的Indel类型。

6、中国黄牛PPP2R2B基因Indel位点基因效应的关联分析

基因型数据：PCR扩增后根据琼脂糖凝胶电泳判断的基因型。

体尺数据：体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰高、十字部高、臀长、腰角宽、腹围、十字部高、体重、重高比。

关联分析模型：利用SPSS(23.0)软件来分析品种、不同因素与生长性状相关性。首先要对所得数据描述性的统计分析，来确定是不是存在离群值。然后根据数据的特性，利用方差分析、多元线性模型或者t分析进而来分析基因型的效应。在数据处理的过程中，依据影响体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰高等体尺指标的因素的不同，考虑到个体的效应，基因之间的互作以及基因型的效应，采用固定的模型来进行相关分析。此外，根据实际条件来进行取舍，完整模型如下所示：

Y＝p+G+E，其中，Y表示个体表型记录；p表示总体均值；G表示标记基因型效应；E表示随机误差。

结果表明，中国黄牛PPP2R2B基因不同基因型频率与等位基因频率的分布对四种中国黄牛相关生长性状(体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰高等)有显著影响。

由表2A可以看出，中国黄牛PPP2R2B基因20-bp重复缺失多态性对秦川牛的胸宽、腰角高、腹围有显著影响(P<0.05)，对秦川牛的体重、胸围、胸深、腰围高度、体长、臀长、腰角宽有极显著影响(P<0.01)；对南阳牛的腹围有显著影响(P<0.05)，对南阳牛的体高、体长、胸围、臀宽、坐骨节宽、腰角高、体重、重高比有极显著影响(P<0.01)。在这些个体中，ID与DD基因型个体性状显著优于II基因型个体。

结论：中国黄牛PPP2R2B基因上位点1(L1)缺失/缺失(DD)基因型可以作为秦川牛生长性状的遗传标记；插入/缺失(ID)基因型可以作为南阳牛生长性状的遗传标记。

由表2B可以看出，中国黄牛PPP2R2B基因26-bp重复缺失多态性对秦川牛的臀长、胸围、胸宽、胸深、腰角宽、腹围有极显著影响(P<0.01)；对南阳牛的腰角宽有显著影响(P<0.05)，对南阳牛的体长、体重、胸围、腹围、腰角宽、坐骨节宽与重高比有极显著影响(P<0.01)。在这些个体中，ID基因型个体性状显著优于II基因型个体。

结论：中国黄牛PPP2R2B基因上位点2(L2)插入/缺失(ID)基因型作为秦川牛、南阳牛生长性状的分子标记。

由表2C可以看出，中国黄牛PPP2R2B基因25-bp重复缺失多态性对秦川牛腰围高度的有显著影响(P<0.05)，对秦川牛的体高、胸围、胸宽、胸深、腰角高、臀长、腹围、腰角宽有极显著影响(P<0.01)；对南阳牛的胸围、腹围有显著影响(P<0.05)，对南阳牛的体高、体长、体重、腰角宽、坐骨节宽、腰角高与重高比有极显著影响(P<0.01)。在这些个体中，ID基因型个体性状显著优于II与DD基因型个体。

由表2D可以看出，中国黄牛PPP2R2B基因32-bp重复缺失多态性对秦川牛的体高、胸围、胸宽、胸深、腰围高度、腰角高、体长、臀长、腹围、腰角宽有极显著影响(P<0.01)；对南阳牛的体高、体长、体重、胸围、腹围、腰角宽、坐骨节宽、腰角高与重高比有极显著影响(P<0.01)。在这些个体中，ID基因型个体性状显著优于II与DD基因型个体。

结论：中国黄牛PPP2R2B基因上位点4(L4)插入/缺失(ID)基因型作为秦川牛、南阳牛生长性状的分子标记。

总之，本实施例给出的上述中国黄牛PPP2R2B基因20-bp、26-bp、25-bp、32-bp重复缺失多态性的检测方法，为中国黄牛生长性状的标记辅助选择(MAS)应用提供理论和实践支撑。

表1A：对不同品种的中国黄牛PPP2R2B基因的20bp Indel基因型、等位基因频率

表1B：对不同品种的中国黄牛PPP2R2B基因的26bp Indel基因型、等位基因频率

表1C：对不同品种的牛PPP2R2B基因的25bp Indel基因型、等位基因频率

表1D：对不同品种的中国黄牛PPP2R2B基因的32bp Indel基因型、等位基因频率

注：LX为鲁西牛；QC为秦川牛；NY为南阳牛；JX为郏县牛。

表2A：中国黄牛PPP2R2B基因的20bp Indel与两个牛品种的生长性状的关联分析

表2B：中国黄牛PPP2R2B基因的26bp Indel与两个牛品种的生长性状的关联分析

表2C：中国黄牛PPP2R2B基因的25bp Indel与两个牛品种的生长性状的关联分析

表2D：中国黄牛PPP2R2B基因的32bp Indel与两个牛品种的生长性状的关联分析

注：LSM表示最小二乘法；SE表示标准误差；QC为秦川牛；NY为南阳牛；II表示插入/插入基因型；ID表示插入/缺失基因型；DD表示缺失/缺失基因型。

核苷酸序列表

核苷酸或氨基酸序列表

<110>西北农林科技大学

<120>中国黄牛PPP2R2B基因4个重复缺失多态性位点的检测方法及应用

<160>

<210> 1

<211>18

<212>引物对P1的上游引物

<213> DNA

<220>

<400>

5’- GATCCCACCTGACAAACG-3'

<210>2

<211>18

<212>引物对P1的下游引物

<213> DNA

<220>

<400>

5'-CTAGAGCTGCCTCGCACA-3'

<210>3

<211>22

<212>引物对P2的上游引物

<213> DNA

<220>

<400>

5'-AGTCTTAGTTTAGAGGGCTTCC-3'；

<210>4

<211>21

<212>引物对P2的下游引物

<213> DNA

<220>

<400>

5'- GCTTAGTCATTCAGCCATTTT-3'

<210>5

<211>20

<212>引物对P3的上游引物

<213> DNA

<220>

<400>

5'-GCTGATCCCTCAAATATGGC-3'

<210>6

<211>19

<212>引物对P3的下游引物

<213> DNA

<220>

<400>

5'-TGAAAGCGTCAAGAGCAAG-3'

<210>7

<211>19

<212>引物对P4的上游引物

<213> DNA

<220>

<400>

5'-CAACTGGAAAAGCTAAGGC-3'

<210>8

<211>20

<212>引物对P4的下游引物

<213> DNA

<220>

<400>

5'-TGGAATCAGATGGAAGAAAG-3'

<210>9

<211>20

<212>中国黄牛PPP2R2B基因位点1（L1）AC_000164.1：g.60192910_60192929del <213>DNA

<220>

<400>

GCTTGCTATATGTGATTCTG

<210>10

<211>26

<212>中国黄牛PPP2R2B基因位点2（L2）AC_000164.1：g.60117040_60117065del <213>DNA

<220>

<400>

GCCTGAAAAATCCCATGGACAGAGAA

<210>11

<211>25

<212>中国黄牛PPP2R2B基因位点3（L3）AC_000164.1：g. 60254430_60254454del

<213> DNA

<220>

<400>

TCCCCAATCCAGCAATGCTGGATGT

<210>12

<211>34

<212>中国黄牛PPP2R2B基因位点4（L4）AC_000164.1：g.60149610_60149643del

<213> DNA

<220>

<400>

CATCTTTTCAAAATTTCTATAGCATTCTATAGCA

Claims

1.一种中国黄牛PPP2R2B基因4个重复缺失多态性位点的检测方法，其特征在于，该方法以中国黄牛全基因组DNA为模板，用引物对P1、P2、P3和P4通过PCR扩增中国黄牛PPP2R2B基因部分片段；再对PCR扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定中国黄牛PPP2R2B基因上的插入/缺失多态性位点的基因型；其中：

引物对P1为：

上游引物：5'-GCATCAGCCCTAAATCCCA-3'；

下游引物：5'-CAGAAAATATCAAAATGCCAGAA-3'。

引物对P2为：

上游引物：5'-AGTCTTAGTTTAGAGGGCTTCC-3'；

下游引物：5'-GCTTAGTCATTCAGCCATTTT-3'。

引物对P3为：

上游引物：5'-GCTGATCCCTCAAATATGGC-3'；

下游引物：5'-TGAAAGCGTCAAGAGCAAG-3'；

引物对P4为：

上游引物：5'-CAACTGGAAAAGCTAAGGC-3'；

下游引物：5'-TGGAATCAGATGGAAGAAAG-3'。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中国黄牛PPP2R2B基因上的插入/缺失多态性位点是指：

中国黄牛PPP2R2B基因位点4(L4)AC_000164.1：g.60149610_60149643del CATCTTTTCAAAATTTCTATAGCATTCTATAGCA；

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：

95.0℃预变性5min；95.0℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸20s，2个循环；之后每2个循环降退火温2℃-3℃；94.0℃变性30s，53℃退火30s，72.0℃延伸20s，30个循环；最后72.0℃延伸10min，所得的扩增产物4℃条件下保存。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度为2.0-3.0％的琼脂糖凝胶。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中国黄牛选自秦川牛，南阳牛，鲁西牛或郏县牛。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述电泳结果鉴定中国黄牛PPP2R2B基因位点1(L1)的插入/缺失多态性位点的基因型分别为：

插入/插入(II)基因型，表现为197bp一条带纹；

插入/缺失(ID)基因型，表现为197bp和177bp两条带纹；

缺失/缺失(DD)基因型，表现为177bp一条带纹；

其中：

缺失/缺失(DD)基因型作为秦川牛生长性状的分子标记，能够提高中国黄牛体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰高生长性状；

插入/缺失(ID)基因型作为南阳牛、郏县牛生长性状的分子标记，能够提高中国黄牛体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰高生长性状；

插入/插入(II)基因型作为鲁西牛生长性状的分子标记，能够提高中国黄牛体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰高生长性状；

所述电泳结果鉴定中国黄牛PPP2R2B基因位点2(L2)的插入/缺失多态性位点的基因型分别为：

插入/插入(II)基因型，表现为235bp一条带纹；

插入/缺失(ID)基因型，表现为235bp和209bp两条带纹；

其中，插入/缺失(ID)基因型作为秦川牛、南阳牛、鲁西牛、郏县牛生长性状的分子标记，能够提高中国黄牛体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰高生长性状；

所述电泳结果鉴定中国黄牛PPP2R2B基因位点3(L3)的插入/缺失多态性位点的基因型分别为：

插入/插入(II)基因型，表现为284bp一条带纹；

插入/缺失(ID)基因型，表现为284bp和259bp两条带纹；

缺失/缺失(DD)基因型，表现为259bp一条带纹；

其中，插入/缺失(ID)基因型作为秦川牛、南阳牛生长性状的分子标记，能够提高中国黄牛体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰高生长性状；插入/插入(II)基因型作为鲁西牛、郏县牛生长性状的分子标记，能够提高中国黄牛体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰高生长性状；

所述电泳结果鉴定中国黄牛PPP2R2B基因位点4(L4)的插入/缺失多态性位点的基因型分别为：

插入/插入(II)基因型，表现为247bp一条带纹；

插入/缺失(ID)基因型，表现为247bp和213bp两条带纹；

缺失/缺失(DD)基因型，表现为213bp一条带纹；

其中，插入/缺失(ID)基因型作为秦川牛、南阳牛、郏县牛生长性状的分子标记，能够提高中国黄牛体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰高生长性状；插入/插入(II)基因型作为鲁西牛生长性状的分子标记，能够提高中国黄牛体高、体长、胸围、胸宽、胸深、腰高生长性状。

7.一种中国黄牛PPP2R2B基因4个重复缺失多态性位点的检测试剂盒，其特征在于，包括用于PCR扩增中国黄牛PPP2R2B基因上重复缺失多态性位点的引物对P1-P4，其中：

引物对P1为：

上游引物：5'-GCATCAGCCCTAAATCCCA-3'；

下游引物：5'-CAGAAAATATCAAAATGCCAGAA-3'；

引物对P2为：

上游引物：5'-AGTCTTAGTTTAGAGGGCTTCC-3'；

下游引物：5'-GCTTAGTCATTCAGCCATTTT-3'。

引物对P3为：

上游引物：5'-GCTGATCCCTCAAATATGGC-3'；

下游引物：5'-TGAAAGCGTCAAGAGCAAG-3'；

引物对P4为：

上游引物：5'-CAACTGGAAAAGCTAAGGC-3'；

下游引物：5'-TGGAATCAGATGGAAGAAAG-3'。

8.权利要求1所述的中国黄牛PPP2R2B基因4个重复缺失多态性的检测方法得到的中国黄牛PPP2R2B基因上的插入/缺失多态性位点的基因型用于中国黄牛分子标记辅助选择育种中的应用。