CN107130025A - 一种同时检测黄牛FoxO1基因两个插入缺失位点的方法及其应用 - Google Patents

一种同时检测黄牛FoxO1基因两个插入缺失位点的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时检测黄牛FoxO1基因两个插入缺失位点的方法及其应用。该检测方法以待测黄牛全基因组DNA为模板，通过Touch‑down PCR程序同时扩增黄牛FoxO1基因第二内含子区插入缺失位点，根据琼脂糖凝胶电泳结果，同时鉴定黄牛FoxO1基因存在的2个插入缺失位点(Indel3：rs383545622；Indel4：rs525318770)的基因型。本发明提供的检测方法为FoxO1基因的2个Indel位点多态性与中国黄牛生长性状关系的建立奠定了基础，以便FoxO1基因的两个插入缺失突变可用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

Description

一种同时检测黄牛FoxO1基因两个插入缺失位点的方法及其 应用
技术领域
本发明涉及家畜分子生物学检测领域，具体涉及一种同时检测黄牛FoxO1基因两个插入缺失位点的方法和应用。
背景技术
插入缺失多态性(Insertion/deletion polymorphism,Indel)是指在近缘种或同一物种不同个体之间基因组同一位点的序列发生了不同大小核苷酸片段的插入或缺失，即一个序列上某一位点相比同源的另一个序列插入或缺失了一个或多个碱基。Indel是同源序列比对产生空位(gap)的现象，但大多数情况下无法获知祖先序列，很难判断空位位点是发生了插入突变还是缺失突变，所以一般统称它们为插入缺失突变。Indel与单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)同属于二等位基因遗传标记。
通过对Indel位点序列分析将Indel分成5大类：(1)单碱基对插入/缺失；(2)单碱基插入/缺失；(3)2-15bp重复单元的多碱基对插入/缺失；(4)转座子插入；(5)随机DNA序列插入/缺失。
Indel在基因组中分布广泛、密度大、数目众多。就分布密度而言仅次于SNP，但远高于SSR(Simple sequence repeats)。但其分布并不均匀，在不同染色体上分布的密度有所差异，在同一染色体上分布密度也有偏倚性，因编码区序列相对保守，Indel大部分分布于非编码区。
Indel标记基于PCR扩增技术，本质上属于长度多态性标记，即基于基因组中插入/缺失位点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增的标记。目前大多是利用电泳平台进行分型，该分型平台快捷经济，不需要复杂的实验设备，可操作性强。电泳分型平台包括琼脂糖凝胶电泳、变性或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳以及毛细管电泳。
Indel标记因其稳定性好、多态性高、分型系统简单，逐渐应用于动植物群体遗传分析、分子育种以及人类法医遗传学、医学诊断等领域。
分子标记辅助选择(molecular mark-assist selection,MAS)是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，加快对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中，通过对生长性状和数量性状紧密关联的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。
FoxO1基因是FoxO家族中发现最早的成员，具有4个外显子，3个内含子，3个α螺旋形成螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix)结构，两侧各一个环状的“翼”，即“forhead"区或“wing helix区”，该区域大部分氨基酸序列高度保守，其DNA结合区大约跨越15～17bp，呈非对称结构。
FoxO1基因在脂肪细胞分化信号通路与转录级联反应中具有重要作用，其与脂肪细胞代谢及成肌细胞分化有很大关系，能促进脂肪细胞的分化、负调控骨骼肌的生成和I型肌纤维基因的表达，且对肝细胞、胰岛β细胞及脂肪细胞中胰岛素作用的发挥起重要作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时检测黄牛FoxO1基因两个插入缺失位点的方法及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明提供了与黄牛生长性状相关的Indel标记，具体是指黄牛FoxO1基因(GenBank:AC_000169.1)第二内含子区的两个Indel变异。更具体地，所述的两个Indel是rs383545622(Indel3)和rs525318770(Indel4)。
本发明还提供用于检测与黄牛生长性状相关的Indel标记(Indel3和Indel4)的引物对，如下所示：
所述的引物对E3为：
上游引物Indel3-F：5’-CGCCCTCAAATCTGTGGTGT-3’(SEQ.ID.NO.1)
下游引物Indel3-R：5’-TGCTTGCCAGGACAAGGTTA-3’(SEQ.ID.NO.2)
所述的引物对E4为：
上游引物Indel4-F：5’-TATTACAGCGCAGCTTGGGAT-3’(SEQ.ID.NO.3)
下游引物Indel4-R：5’-TTCAGTGAGCTCAGGCATTCA-3’(SEQ.ID.NO.4)。
对每个牛品种随机个体，以基因组DNA为模板，用引物对E3和E4同时进行PCR分型，具体利用Touch Down PCR程序，一次PCR程序后，将扩增产物在同一个电泳的结果中进行分析，从而对Indel3和Indel4位点进行分型。
同时分型两个位点的扩增体系为10μL，其中：50ng/μL模板DNA 0.3μL，10pmol的两对上、下游引物各0.3μL，2×Taq PCR Master Mix 5μL，去离子水3.5μL。
Touch-down PCR程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，-1℃每循环，72℃延伸30s，共18个循环；然后94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共25个循环；最后72℃延伸10min。
所述Indel3不同基因型的电泳结果为：插入型(II)为236bp的一个条带，缺失型(DD)为225bp的一个条带，杂合型(DI)为225bp和236bp的两个条带；所述Indel4不同基因型的电泳结果为：插入型(II)为127bp的一个条带，缺失型(DD)为118bp的一个条带，杂合型(DI)为118bp和127bp的两个条带。
本发明进一步提供所述Indel标记在黄牛分子标记辅助选择中的应用。
前述的应用包括以下步骤：
(1)利用PCR和电泳技术对不同个体的两个Indel位点进行分型；
(2)利用SPSS软件将Indel基因型与黄牛生长性状进行关联分析；
(3)根据关联分析结果将生长性状优异的黄牛个体进行选育。
本发明的实施例中，以黄牛FoxO1基因(GenBank:AC_000169.1)的rs383545622和rs525318770两个Indel为候选位点，通过测序技术、PCR技术和电泳技术检测不同Indel基因型在2个中国黄牛品种(南阳牛和柴达木黄牛)中的变异情况，并与体重、体高等生长性状进行关联分析，结果表明，本发明提供的所述Indel标记的检测方法可在早期分子标记辅助选择生长性状优秀的牛品种中应用。
与现有技术相比，本发明有以下优点：
(1)本发明提供的黄牛FoxO1基因插入缺失变异检测方法，可同时检测多个Indel位点，且不受年龄的限制，可用于黄牛的早期选育，甚至在刚出生时就可进行选择。
(2)检测黄牛FoxO1基因插入缺失变异的方法准确可靠、操作简便、成本低廉、省时省力。
(3)黄牛FoxO1基因Indel变异位点的检出，为牛生长发育的分子标记辅助选择提供科学依据。
附图说明
图1为中国黄牛FoxO1基因rs383545622(Indel3)位点测序(反向)及序列对比图；图中三角代表插入位置，实线代表插入序列。
图2为中国黄牛FoxO1基因rs525318770(Indel4)位点测序及序列对比图；图中三角代表插入位置，实线代表插入序列。
图3为中国黄牛FoxO1基因Indel分型电泳图；其中左侧为单独分型Indel3，中间为一次PCR同时分型Indel3和Indel4，右侧为单独分型Indel4。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
1.黄牛样本采集
本发明具体以2个中国黄牛品种的种群作为检测对象，具体采集样本见表1。
表1黄牛样本的采集
2.基因组DNA的分离、提取、纯化
参考文献Sambrock et al(2002)方法。
3.目标序列的扩增及测序
(1)提取待测中国黄牛2个品种共250头个体的基因组DNA；
(2)每个牛品种随机选择50个个体构建DNA池，分别以2个DNA池为模板，利用TouchDown PCR程序进行扩增，对PCR产物进行3.5％琼脂糖凝胶电泳。根据电泳结果，选取在2个牛品种中均存在的Indel位点进行后续试验。
选取每个位点的纯合DD(Delation/Delation，缺失型)和II(Insertion/Insertion，插入型)基因型各3个个体进行测序。测序PCR所用的扩增体系(50μL)：50ng/μL模板DNA 1.5μL，10pmol的上、下游引物各1.5μL，2×Taq PCR Master Mix 25μL，去离子水20.5μL。
最终确认中国黄牛FoxO1基因的两个Indel位点的插入序列为rs383545622(Indel3)，ATTCTGTCTGC(SEQ.ID.NO.5)；rs525318770(Indel4)，CCTGGTGGT(SEQ.ID.NO.6)；插入位置和序列见图1和图2。
(3)以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牛FoxO1基因序列(GenBank:AC_000169.1)为参考序列，利用Primer 5.0设计PCR引物，其引物序列信息以及插入缺失引起的片段长度变异如表2所示。
(a)同时分型Indel3和Indel4两个位点的扩增体系为10μL，其中：50ng/μL模板DNA0.3μL，10pmol的两对上、下游引物各0.3μL，2×Taq PCR Master Mix 5μL，去离子水3.5μL。
(b)分别分型Indel3和Indel4位点的扩增体系为10μL，其中：50ng/μL模板DNA 0.3μL，10pmol的上、下游引物各0.3μL，2×Taq PCR Master Mix 5μL，去离子水4.1μL。
(c)PCR反应程序(Touch Down PCR)：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，-1℃每循环，72℃延伸30s，18个循环；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环；72℃最终延伸10min；12℃保持。
表2.中国黄牛FoxO1基因Indel分型信息表
注：II为插入型，DD为缺失型，DI为杂合型。
4.Indel3和Indel4位点的PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析
(1)制作3.5％的琼脂糖凝胶(已经加入溴化乙锭核酸染料)，点样后100V电压电泳60min；
(2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统成像；
(3)根据琼脂糖凝胶电泳结果分析多态性。黄牛FoxO1基因2个Indel位点的分型电泳结果如图3所示。对每个牛品种随机个体，用表2中引物对E3和E4分别进行扩增、电泳，完成PCR分型，电泳结果见图3左图和右图，将分别分型结果和同时分型结果(图3中间图)进行比较，结果表明同时在一次PCR程序中用两对引物进行扩增，并对产物进行电泳分析，可以快速、准确的完成2个Indel位点的同时分型。
5.黄牛FoxO1基因Indel位点的遗传多态性分析
(1)基因频率：指一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率。实际上就是纯合子基因型频率加上包含该基因的各种杂合子频率之和的1/2。公式如下：
Pi＝[2(ii)+(ij1)+(ij2)+…+(ijn)]/2N
其中：Pi：第i个等位基因的频率；
ii：第i个等位基因纯合的个体数；
ijn：i与jn共显性等位基因的个体数；
N：群体中的个体数。
(2)基因型频率：指一个群体中某一性状的各种基因型之间的比率。
PAA＝NAA/N
其中：PAA代表某一位点的AA基因型频率；
NAA表示群体中具有AA基因型的个体数；
N为检测群体的总数。
(3)哈代温伯格(Hardy-Weinberg)平衡检验：即χ2独立性检验，指在一个随机交配的孟德尔群体中，先根据基因频率计算各种基因型频率的理论值，然后计算χ2值。χ2检验可用下列公式：
其中：Oi表示实际观察值；
Ei表示理论值；
n表示等位基因数。
(4)纯合度(Homozygosity,Ho)：用来度量某一群体中特定位点上等位基因纯合程度的指标。计算公式如下：
(5)杂合度(Heterozygosity,He)：与纯合度是相对而言的，可用来度量一个群体中某一基因座上等位基因间杂合的程度。计算公式如下：
(6)有效等位基因数(effective number of alleles,Ne)：是基因纯合度的倒数，反映了等位基因间的相互影响，是衡量基因纯合度的另一指标。计算公式如下：
(7)多态信息含量(Polymorphism Information Content,PIC)：衡量位点变异程度高低的一个指标；当PIC＜0.25为低度多态，0.25＜PIC＜0.5为中度多态，PIC＞0.5为高度多态。公式如下：
不同黄牛品种中FoxO1基因不同基因型的遗传学参数如表3所示。
表3.中国黄牛FoxO1基因遗传变异参数表
注:HWE,Hardy-Weinberg equilibrium,哈代温伯格平衡；
6.黄牛FoxO1基因Indel位点的单倍型分析
单倍型指在同一染色体上进行共同遗传的多个基因座上等位基因的组合。
不同黄牛品种中FoxO1基因的单倍型分析结果如表4所示。
表4.中国黄牛FoxO1基因单倍型分析表
7.黄牛FoxO1基因Indel位点基因效应分析
FoxO1基因两个Indel位点与2个黄牛品种生长性状的关联分析结果如表5和表6所示。
关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值；再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS 23软件分析各基因型间的生长性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：
Yijk＝μ+Gj+eijk，
其中：Yijk为性状观察值，μ为总体均值，Gj为第j个单SNP标记基因型的固定效应，eijk为随机误差。
表5.南阳牛FoxO1基因Indel位点与生长性状关联分析表
注：H1＝D3D4,H2＝I3D4,H3＝D3I4,H4＝I3I4；标有不同小写字母(a,b)表示差异显著，标有不同大写字母(A,B)表示差异极显著
表6.柴达木黄牛FoxO1基因Indel位点与生长性状关联分析表
注：H1＝D3D4,H2＝I3D4,H3＝D3I4,H4＝I3I4；标有不同小写字母(a,b)表示差异显著，标有不同大写字母(A,B)表示差异极显著
分析结果显示：在南阳牛中，Indel3与体高和管围显著相关、与十字部高呈极显著相关，Indel4与体高和体斜长显著相关、与十字部高呈极显著相关，Indel3和Indel4的组合基因型与体高和体斜长显著相关、与十字部高呈极显著相关；在柴达木黄牛中，Indel3与体重和胸围显著相关、与体高和体斜长呈极显著相关，Indel4与体高、胸围和管围显著相关，Indel3和Indel4的组合基因型与体重、体高和胸围显著相关、与体斜长呈极显著相关。
上述分析结果说明：FoxO1基因的两个Indel突变可以作为一个黄牛生长性状的候选分子遗传标记。
核苷酸序列表
<110> 西北农林科技大学
<120>一种同时检测黄牛FoxO1基因两个插入缺失位点的方法及其应用
<160> 6
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 1
cgccctcaaa tctgtggtgt 20
<210> 2
<211>20
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 2
tgcttgccag gacaaggtta 20
<210> 3
<211>21
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 3
tattacagcg cagcttggga t 21
<210> 4
<211>21
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 4
ttcagtgagc tcaggcattc a 21
<210> 5
<211>11
<212> DNA
<213> Bos taurus domestica
<400> 5
attctgtctg c 11
<210> 6
<211>9
<212> DNA
<213> Bos taurus domestica
<400> 6
cctggtggt 9

Claims (8)

1.一种同时检测黄牛FoxO1基因两个插入缺失位点的方法，其特征在于：包括以下步骤：
以黄牛的基因组DNA为模板，以引物对E3和E4为引物，通过一次Touch-down PCR程序扩增FoxO1基因上两个Indel位点：Indel3和Indel4，将两个Indel位点所对应的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳结果同时分型鉴别黄牛个体存在的两个与生长性状显著关联的Indel位点的基因型；
所述的引物对E3为：
上游引物Indel3-F：5’-CGCCCTCAAATCTGTGGTGT-3’
下游引物Indel3-R：5’-TGCTTGCCAGGACAAGGTTA-3’
所述的引物对E4为：
上游引物Indel4-F：5’-TATTACAGCGCAGCTTGGGAT-3’
下游引物Indel4-R：5’-TTCAGTGAGCTCAGGCATTCA-3’。
2.如权利要求1所述的同时检测黄牛FoxO1基因两个插入缺失位点的方法，其特征在于：所述的两个Indel位点定位于牛FoxO1基因第二内含子区。
3.如权利要求1所述的同时检测黄牛FoxO1基因两个插入缺失位点的方法，其特征在于：所述的两个Indel位点中，Indel3的插入缺失序列为ATTCTGTCTGC，Indel4的插入缺失序列为CCTGGTGGT。
4.如权利要求1所述的同时检测黄牛FoxO1基因两个插入缺失位点的方法，其特征在于：所述的Touch-down PCR的扩增体系包括50ng/μL模板DNA 0.3μL、10pmol的两引物对的上、下游引物各0.3μL，2×Taq PCR Master Mix 5μL以及去离子水3.5μL。
5.如权利要求1所述的同时检测黄牛FoxO1基因两个插入缺失位点的方法，其特征在于：所述的Touch-down PCR程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s且-1℃每循环，72℃延伸30s，共18个循环；然后94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共25个循环；最后72℃延伸10min。
6.如权利要求1所述的同时检测黄牛FoxO1基因两个插入缺失位点的方法，其特征在于：所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.5％。
7.如权利要求1所述的同时检测黄牛FoxO1基因两个插入缺失位点的方法，其特征在于：所述Indel3不同基因型的电泳结果为：插入型为236bp的一个条带，缺失型为225bp的一个条带，杂合型为225bp和236bp的两个条带；所述Indel4不同基因型的电泳结果为：插入型为127bp的一个条带，缺失型为118bp的一个条带，杂合型为118bp和127bp的两个条带。
8.如权利要求1-7中任意一项权利要求所述的同时检测黄牛FoxO1基因两个插入缺失位点的方法在黄牛分子标记辅助选择中的应用。
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