CN105441567A - 一种耗牛foxo1基因单核苷酸多态性的检测方法及其试剂盒 - Google Patents
一种耗牛foxo1基因单核苷酸多态性的检测方法及其试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及基因多态性检测技术领域，具体涉及一种耗牛FOXO1基因单核苷酸多态性的检测方法及其试剂盒，包括以下步骤：步骤一：制备牦牛FOXO1基因扩增产物；步骤二：合成高低温内标；步骤三：制备HRM-PCR扩增产物；步骤四：收集荧光信号。本发明所设计的基因探针比现有技术中的HRM法检测多态性位点定位更加准确、灵敏，且分型准确不需要PCR后处理，工作效率高、重复性好对样本的质和量要求不高，尤其对DNA模板的浓度要求可低至0.1ng/μL，尤其样本量大时，既省时又省力。同时本发明检测试剂盒敏感度高，检测快速，稳定性好。
Description
技术领域
本发明涉及基因多态性检测技术领域，具体涉及一种耗牛FOXO1基因单核苷酸多态性的检测方法及其试剂盒。
背景技术
FOXO1是FOXO家族的成员之一，作为转录因子，其通过翻译后修饰等方式调节下游靶基因转录，参与氧化应激、凋亡、DNA损伤修复、细胞周期阻滞等生物学过程，。目前FOXO1基因作用机制尚未完全阐明，针对FOXO1基因研究已成为当今研究热点。对FOXO1基因进行定性分析有助于对FOXO1基因的进一步研究。
单核苷酸多态性(SNP)是基因组中发生频率最高的变异种类。研究SNP可促进人们对基因组结构、基因的进化历史及疾病发生根源的了解。SNP是种群遗传分析、疾病发生机理和药物研发等领域的重要研究对象。目前，针对SNP研究所建立的数据库和高效、精确、方便操作的工具，对于展现SNP在引领遗传分析、疾病诊治等领域发展方面的重要性具有很高的利用价值。
单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)是指相同或不同物种个体的基因组DNA序列同一位置上的单个核苷酸存在差别的现象。其中多态性(polymorphism)指的是形态多样性和状态多样性，在这里是基因水平上的多态性，指一个基因座位上存在多个等位基因，它是基因组中发生频率最高的点突变，在已知DNA的多态性中占了大约90％。同时，也发现每1000个碱基中就有一个会发生变异，它在一个种群中的发生率至少在1％水平。因此，具体地说，SNP指的是基因组序列中单核苷酸(A、T、C和G)改变时所发生的DNA序列的多态性变化，即基因组内特定的核苷酸位置上存在2种或更多不同的碱基，其中最少一种在群体中的频率不低于1％。
多态性(SNP)位点的经典方法是一大类以凝胶电泳为基础的一系列传统方法，包括：限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)，此方法应用的前提是SNP位点必须含有限制性内切酶的识别位点，但此方法是SNP位点筛查中最经典的方法之一；单链构象多态性法(PCR-SSCP)，该方法简单快速，被广泛运用与未知基因突变的检测，但这种方法对温度要求严格且不能确定突变的类型及突变的具体位置，因而带有一定的盲目性。变性梯度凝胶电泳(DGGE)，多用于分析自然环境中细菌类和、真核生物和病毒等生物的多样性。此方法具有可重复和操作简单等特点，但此法会受到DNA分子互补链中氢键的含量的影响，因此很少用于SNP位点的检测分析；等位基因特异性PCR法(ASPCR)。
而现有的一些新型SNPs高通量检测方法包括：高效液相色谱法(DHPLC)法；基因芯片法及DNA直接测序法。其中DHPLC法检测效率高便于自动化的优点，且准确率高，但DHPLC对所用试剂和环境要求高，易产生误差。基因芯片法具有信息量大、自动化程度高的特点，但芯片造价成本昂贵，所需设备贵重，所以不利于普及应用。而DNA直接测序法突变位点检出率高、速度快，摆脱了传统的凝胶电泳所对温度的要求，且对其类型和位置分析准确，带有目的性，成本相对低，利于广泛应用于检测SNP位点。
目前现有技术中针对FOXO1基因遗传变异的研究较少，该基因位点的功能研究及其遗传变异与经济性状关联的研究仍是空白，且现有针对FOXO1基因单核苷酸多态性的检测多存在探针与目标序列存在错配碱基的问题，这样，就会大大减少探针与目标序列结合的紧密度，影响探针的荧光释放量，导致检测结果不准确。由此可见能否提供一种耗牛FOXO1基因单核苷酸多态性的检测方法，有效实现耗牛FOXO1基因单核苷酸多态性的检测，且具有灵敏度高、特异性好、成本低、快速、高通量检测等优点，成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明为了解决上述技术问题，提供一种耗牛FOXO1基因单核苷酸多态性的检测方法及其试剂盒，该方法具有灵敏度高、特异性好、成本低、快速、高通量检测等优点。
为了达到上述技术效果，本发明包括以下技术方案：
一种耗牛FOXO1基因单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤：
步骤一：制备牦牛FOXO1基因扩增产物：首先提取耗牛血液基因组DNA，将其稀释后，以基因组DNA为模版，以牦牛FOXO1基因序列设计特异性引物对A和特异性引物对B，进行PCR扩增耗牛FOXO1基因，得到PCR扩增产物后纯化；取纯化后PCR扩增产物测序，找出单核苷酸位点；
步骤二：合成高低温内标：通过高分辨率熔解曲线分析耗牛FOXO1基因单核苷酸多态位点的DNA探针，进行基因型分析，合成高低温内标，并对熔解曲线进行校正；
步骤三：制备HRM-PCR扩增产物：取FOXO1基因的基因组DNA，加入步骤二所述的耗牛FOXO1基因单核苷酸多态位点的DNA探针，进行HRM-PCR扩增，得到HRM-PCR扩增产物；
步骤四：收集荧光信号：将步骤二合成的高低温内标稀释，并与步骤三制备的HRM-PCR扩增产物混合，于高分辨率熔解曲线分析系统中收集荧光信号，通过不同的荧光检测结果确定检测SNP位点处碱基突变的基因型。
进一步的，所述特异性引物对A为：
上游引物：5′AGAGGGAGGCAAGAGTGG3′；
下游引物：5′ATGTCGTTGTGCGGAGGA3′；
所述特异性引物对B为：
上游引物：5′ATCCAGAGGGAGGCAAGA3′；
下游引物：5′GGACAGACTAGGCAGAGTAGAA3′。
进一步的，所述特异性引物对A扩增长度为702bp，其PCR扩增位置为165-866，所述特异性引物对B扩增长度为371bp，其PCR扩增位置为161-531。
进一步的，所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min，94℃变性30s，复性30s，特异性引物对A扩增退火温度为61℃，特异性引物对B扩增退火温度为62℃，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
进一步的，所述步骤二中的耗牛FOXO1基因单核苷酸多态位点的DNA探针核苷酸序列为：针对FOXO1基因720C/T位点的上游探针：5′CCCTGCTACTCCTTTGC3′；针对FOXO1基因720C/T位点的下游探针：5′CATGCCTCCATAACTCG3′。
进一步的，所述步骤三的HRM-PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性20s，复性20s退火温度55℃，72℃延伸20s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
进一步的，所述步骤四中的高低温内标稀释的方法包括以下步骤：1OD内标单链加400μL双蒸水，退火体系为：饱和氯化钠1μL内标互补双链各1μL，补水至10μL，95℃水浴3min，温度降至室温，得到稀释后的高低温内标。
进一步的，所述高低温内标的核苷酸序列为：
退火温度为57℃的低温I内标：
5′GTATTATATTTATATATATATAATTAATATTATAAATATTTTATAATTTAA-C3-3′；
退火温度为53℃的低温II内标：
5′TTAAATTATAAAATATTTATAATATTAATTAATATATAAATATAATAC-C3-3′；
退火温度为86℃的高温I内标：
5′GCCCGCCCCTCCGCTTCCGCACCTCCAGCAGCCGCTCAGAGTCTCGGGTCAGTGCCGGCCGCGC-C3-3′；
退火温度为86℃的高温II内标：
5′GCGCGGCCGGCACTGACCCGAGACTCTGAGCGGCTGCTGGAGGTGCGGAAGCGGAGGGGCGGGC-C3-3′。
进一步的，所述步骤四中的收集荧光信号的步骤包括：将稀释好的高低温内标各1μL，加入HRM-PCR扩增产物单孔中，于95℃水浴30s；25℃水浴30s；放入高分辨率熔解曲线分析系统中收集荧光信号。
一种耗牛FOXO1基因单核苷酸多态性的检测试剂盒，包括10pmol/μL权利要求1所述的特异性引物对A和特异性引物对B各1μL、18-22ng/μLFOXO3基因组DNA1μL、2XTaqPCRMasterMix12.5μL、灭菌的超纯水9.5μL。
采用上述技术方案，包括以下有益效果：
1、本发明设计了基因探针比现有技术中的HRM法检测多态性位点定位更加准确、灵敏，且分型准确不需要PCR后处理，工作效率高、重复性好对样本的质和量要求不高，尤其对DNA模板的浓度要求可低至0.1ng/μL，尤其样本量大时，既省时又省力。
2、由于FOXO1基因对生长发育性状具有重要生物学功能，为该基因的SNPs与生长性状关联的奠定了基础。FOXO1基因单核苷酸多态性对牦牛、体高、体斜长、胸围、和管围有显著影响，可用于牦牛肉用和生长性状的分子标记辅助选择，进而快速建立遗传资源优良的经济型牦牛种群。
3、本发明方法与其他遗传分型技术相比，操作简单，具有灵敏度高、特异性好、成本低、快速、高通量检测等优点，结果准确。
附图说明
图1为本发明牦牛FOXO1基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；
图2为本发明PCR扩增产物测序峰图；
图3为本发明FOXO1基因单核苷酸多态位点的HRM分型曲线图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例并结合附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例一：一种耗牛FOXO1基因单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤：
制备牦牛FOXO1基因PCR扩增产物：首先提取耗牛血液基因组DNA，将其稀释后，以FOXO1基因的待测牦牛全基因组DNA为模板，以特异性引物对A和特异性印务B为引物，用PCR法扩增牦牛FOXO1基因，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后用纯化试剂盒纯化PCR扩增产物，进行测序并根据测序结果鉴定牦牛FOXO1基因第720位的单核苷酸多态性(发生了C-T的突变)。
具体步骤如下：
步骤一：制备牦牛FOXO1基因扩增产物：首先提取耗牛血液基因组DNA，将其稀释后，采用1％的琼脂糖凝胶电泳和分光光度计双重检测DNA的质量，使用已检测提取的DNA并抽取20μL稀释到18-22ng/μL，作为PCR扩增模板，其余保存于-80℃，随机抽取200份稀释后的DNA样品，每个样品各取1μL，混合均匀，构成基因组DNA混合池参考GenBank中发表的牦牛的FOXO1基因序列(登录号分别为：M91_10071)运用PrimerPrimer5.0与Oligo7等引物设计软件设计2对引物，即特异性引物对A和特异性引物对B，对部分外显子区域进行扩增，引物由上海生工生物有限公司合成；
PCR反应体系25μL：基因组DNA(18-22ng/μL)1μL，上、下游引物(10pmol/μL)各1μL，2XTaqPCRMasterMix12.5μL，灭菌的超纯水9.5uL。PCR反应程序：95℃预变性3min，94℃变性30s，复性30s，退火温度见表1，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。将得到的PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化；取纯化后PCR扩增产物测序，找出单核苷酸位点；
所述特异性引物对A为：
上游引物：5′AGAGGGAGGCAAGAGTGG3′；
下游引物：5′ATGTCGTTGTGCGGAGGA3′；
所述特异性引物对B为：
上游引物：5′ATCCAGAGGGAGGCAAGA3′；
下游引物：5′GGACAGACTAGGCAGAGTAGAA3′。
述特异性引物对A长度为702bp，其PCR扩增位置为165-866，所述特异性引物对B长度为371bp，其PCR扩增位置为161-531。
表1FOXO1CDS区引物信息
步骤二：合成高低温内标：取步骤一纯化后PCR扩增产物测序，测序结果经过DNAman、DNAstar和Chromas软件进行对比分析，利用LightScannerprimerdesignsoftware设计出用于高分辨率熔解曲线(Highresolutionmelting，HRM)分析高分辨率熔解曲线分析耗牛FOXO1基因单核苷酸多态位点的DNA探针，进行基因型分析，合成高低温内标，并对熔解曲线进行校正，提高分型的精确度；耗牛FOXO1基因单核苷酸多态位点的DNA探针核苷酸序列见表2；
表2HRM分析多态位点的探针信息
高低温内标的核苷酸序列件表3；
表3高低温内标序列
步骤三：制备HRM-PCR扩增产物：取FOXO1基因的基因组DNA，加入耗牛FOXO1基因单核苷酸多态位点的DNA探针，进行HRM-PCR扩增，HRM-PCR扩增体系11μL：基因组DNA(18-22ng/μL)1μL，上、下游引物(10pmol/μL)各1μL，2XTaqPCRMasterMix5μL，LCgreen饱和染料1μL，灭菌的超纯水2μL。HRM-PCR反应程序：95℃预变性5min，94℃变性20s，复性20s退火温度55℃，72℃延伸20s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存，得到HRM-PCR扩增产物；
步骤四：收集荧光信号：将步骤二合成的高低温内标稀释，稀释方法为：高低温内标稀释方法：1OD内标单链加400μL双蒸水。退火体系：饱和氯化钠1μL，内标互补双链各1μL，补水至10μL，95℃水浴3min，然后缓慢降至室温；
将稀释好的高低温内标各1μL，加入HRM-PCR扩增产物单孔中95℃水浴30s；25℃水浴30s；放入LightScanner96高分辨率熔解曲线分析系统中收集荧光信号，通过不同的荧光检测结果确定检测SNP位点处碱基突变的基因型。
一种耗牛FOXO1基因单核苷酸多态性的检测试剂盒，包括10pmol/μL权利要求1所述的特异性引物对A和特异性引物对B各1μL、18-22ng/μLFOXO3基因组DNAlμL、2XTaqPCRMasterMix12.5μL、灭菌的超纯水9.5μL。
实施例二：数据统计
据群体遗传学理论计算得到基因型和等位基因频率，统计牦牛群体FOXO1基因多态位点的纯和度(Ho)、杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)和多态信息含量(PIC)。进行Hardy-Weinberg平衡定律进行平衡检验，采用SHEsis软件进行配对连锁不平衡分析。采用SPSS17.0软件对FOXO1基因多态性位点在牦牛群体中的基因型分布进行卡方检验，并对不同基因型与体尺性状间的关联性进行分析。
实施例三：结果分析
PCR扩增产物：以牦牛血液基因组DNA为模板，用所设计的引物进行PCR特异性扩增，结果见图1，图1中：图1中1，2分别代表引物FOXO1、FOXO2；M代表Mark。由图1可知，PCR扩增产物均为单一特异性条带，与预期大小基本一致。对上述特异性引物对A和特异性引物对B进行测序，结果显示如图2所示，FOXO1基因的部分CDS区序列存在720(C/T)1个多态位点。
牦牛FOXO1基因HRM方法的分型：通过构建的DNA池对牦牛的FOXO1基因测序后，应用Chromas软件分析拼接得到CDS区的序列，突变位点的位置及编码氨基酸的改变结果见表4；应用高分辨率熔解曲线对1个多态位点进行基因型分析结果见图3。
表4FOXO1碱基改表导致氨基酸的改变
| 位点 | 碱基的改变 | 氨基酸改变 |
| 720(C/T) | TAC-TAT | 酪氨酸-酪氨酸 |
720(C/T)基因型的判定，扩增包含多态性位点在内的89bp的DNA片段，通过熔解曲线分析仪(HRM)分析得出有3种基因型：CC、CT和TT三种型，如图所示，统计分析发现CC型属于优势基因型，个体数量明显多于其它基因型。TT型属于略势基因型。
牦牛FOXO1基因多态性的分析：根据分型结果进行基因型频率和基因频率以及相关遗传特性指标计算，结果显示，牦牛群体中FOXO1基因(C/T)优势等位基因C，基因频率分别在0.5以上。见表5，1个多态位点表现为中度多态(0.5＞PIC＞0.25)，经Hardy-Weinberg平衡检验发现，此位点未达到Hardy-Weinberg平衡(P＜0.01)，结果见表6。
表5FOXO1基因突变位点的基因型频率及基因频率
表6FOXO1基因突变位点的遗传多态性
FOXO1基因型与体尺性状的关联性分析：对牦牛FOXO1基因各多态位点突变个体进行HRM分型统计后，运用SPSS17.0软件分析牦牛个体各位点基因型与体尺性状的关联性分析。
基因型与体尺性状的关联性分析：由表7可知，720(C/T)位点不同基因型在体斜长、胸围、体高和管围方面差异显著，总体趋势是CT基因型个体均值高于CC和TT基因型个体。720(C/T)位点中，CT基因型在体长、胸围和管围方面均显著高于GG基因型和AG基因型(P＜0.05)，但在体高方面CT基因型与TT基因型和CC基因型差异不显著(P＞0.05)。
表7FOXO1基因各多态位点不同基因型与体尺性状关联分析
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种耗牛FOXO1基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：制备牦牛FOXO1基因扩增产物：首先提取耗牛血液基因组DNA，将其稀释后，以基因组DNA为模版，以牦牛FOXO1基因序列设计特异性引物对A和特异性引物对B，进行PCR扩增耗牛FOXO1基因，得到PCR扩增产物后纯化；取纯化后PCR扩增产物测序，找出单核苷酸位点；
步骤二：合成高低温内标：通过高分辨率熔解曲线分析耗牛FOXO1基因单核苷酸多态位点的DNA探针，进行基因型分析，合成高低温内标，并对熔解曲线进行校正；
步骤三：制备HRM-PCR扩增产物：取FOXO1基因的基因组DNA，加入步骤二所述的耗牛FOXO1基因单核苷酸多态位点的DNA探针，进行HRM-PCR扩增，得到HRM-PCR扩增产物；
步骤四：收集荧光信号：将步骤二合成的高低温内标稀释，并与步骤三制备的HRM-PCR扩增产物混合，于高分辨率熔解曲线分析系统中收集荧光信号，通过不同的荧光检测结果确定检测SNP位点处碱基突变的基因型。
2.根据权利要求1所述的一种耗牛FOXO1基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述特异性引物对A为：
上游引物：5′AGAGGGAGGCAAGAGTGG3′；
下游引物：5′ATGTCGTTGTGCGGAGGA3′；
所述特异性引物对B为：
上游引物：5′ATCCAGAGGGAGGCAAGA3′；
下游引物：5′GGACAGACTAGGCAGAGTAGAA3′。
3.根据权利要求2所述的一种耗牛FOXO1基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述特异性引物对A扩增长度为702bp，其PCR扩增位置为165-866，所述特异性引物对B扩增长度为371bp，其PCR扩增位置为161-531。
4.根据权利要求2所述的一种耗牛FOXO1基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min，94℃变性30s，复性30s，特异性引物对A的PCR扩增退火温度为61℃，特异性引物对B的PCR扩增退火温度为62℃，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
5.根据权利要求2所述的一种耗牛FOXO1基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述步骤二中的耗牛FOXO1基因单核苷酸多态位点的DNA探针列为：针对FOXO1基因720C/T位点的上游探针：5′CCCTGCTACTCCTTTGC3′；针对FOXO1基因720C/T位点的下游探针：5′CATGCCTCCATAACTCG3′。
6.根据权利要求2所述的一种耗牛FOXO1基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述步骤三的HRM-PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性20s，复性20S退火温度55℃，72℃延伸20s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
7.根据权利要求2所述的一种耗牛FOXO1基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述步骤四中的高低温内标稀释的方法包括以下步骤：1OD内标单链加400μL双蒸水，退火体系为：饱和氯化钠1μL，内标互补双链各1μL，补水至10μL，95℃水浴3min，温度降至室温，得到稀释后的高低温内标。
8.根据权利要求7所述的一种耗牛FOXO1基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述高低温内标的核苷酸序列为：
退火温度为57℃的低温I内标：
5′GTATTATATTTATATATATATAATTAATATTATAAATATTTTATAATTTAA-C3-3′；
退火温度为53℃的低温II内标：
5′TTAAATTATAAAATATTTATAATATTAATTAATATATAAATATAATAC-C3-3′；
退火温度为86℃的高温I内标：
5′GCCCGCCCCTCCGCTTCCGCACCTCCAGCAGCCGCTCAGAGTCTCGGGTCAGTGCCGGCCGCGC-C3-3′；
退火温度为86℃的高温II内标：
5′GCGCGGCCGGCACTGACCCGAGACTCTGAGCGGCTGCTGGAGGTGCGGAAGCGGAGGGGCGGGC-C3-3′。
9.根据权利要求2所述的一种耗牛FOXO1基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述步骤四中的收集荧光信号的步骤包括：将稀释好的高低温内标各1μL，加入HRM-PCR扩增产物单孔中，于95℃水浴30s；25℃水浴30s；放入高分辨率熔解曲线分析系统中收集荧光信号。
10.一种耗牛FOXO1基因单核苷酸多态性的检测试剂盒，其特征在于，包括10pmol/μL权利要求1所述的特异性引物对A和特异性引物对B各1μL、18-22ng/μLFOXO3基因组DNA1μL、2XTaqPCRMasterMix12.5μL、灭菌的超纯水9.5μL。
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