CN103468790B - 一组用于检测斑茅多态性的引物组、检测方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一组SSR引物组及其该引物组在检测斑茅多态性中的应用，该SSR引物组的设计方法，和该SSR引物组用于检测斑茅多态性的方法。本发明能够检测到斑茅的一些基因组SSR位点的信息，同时通过对设计引物的多态性研制，其设计的引物能有效的用于斑茅的遗传多样性研究及遗传图谱构建，研制多态性采用了先进的基因分析仪，提高了引物多态性检测的精确度。
Description
技术领域
本发明涉及引物组，特别一组用于检测斑茅多态性的引物组及其用于检测斑茅多态性的方法及用途。
背景技术
斑茅是禾本科蔗茅属高大禾草，具有生物量大、抗逆性强、纤维素含量丰富等特点。由于其抗逆性强，能够与甘蔗进行种间杂交，常作为甘蔗育种中的优良基因来源，是甘蔗育种的主要材料之一。同时由于生物量大、纤维素含量高，已经被视为我国本土优良的生物质能源材料，其能源用潜力巨大。我国热带、亚热带地区分布大量的野生斑茅资源，搞清楚其遗传多样性规律是合理保护利用该资源的前提。在遗传多样性研究及遗传图谱构建中分子标记至关重要。分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，材料间DNA水平上的多态性的直接反映。主要常用的分子标记方法有RAPD、RFLP、AFLP、SRAP、SSR等，目前斑茅遗传多样性的研究并不多，使用的标记有SRAP、ISSR、RAPD和RFLP，未见SSR标记用于斑茅的遗传多样性研究。
在研究斑茅遗传多样性中，使用了RAPD、RFLP、ISSR和SRAP等分子标记。这些标记中RAPD标记是利用一个随机序列的寡核苷酸作引物，以基因组DNA作模板进行PCR扩增反应，经琼脂糖凝胶电泳来检测DNA序列的多态性,其缺点是但其重现性差；RFLP标记利用基因组DNA经特定限制性内切酶酶切后所产生相当多的大小不等的DNA片段，以同位素或生物素标记的DNA片段作探针，用杂交的方法，把与被标记的DNA相关的片段检测出来，从而构建出多态性图谱，简单的说RFLP就是酶切产生的某一特异DNA片段的长度在个体间的差异，该标记的缺点是操作繁琐，检测周期长，成本高昂，不适于大规模；ISSR标记主要是以一条与微卫星(SSRs)序列互补的并在3’或5’端含有2-4个随机碱基的DNA序列为引物对基因组DNA进行PCR扩增的一种分子标记技术，SRAP标记利用引物设计对ORFs(open reading frames，开放阅读框架)进行扩增，上游引物对外显子进行特异扩增，下游引物对内含子区域、启动子区域进行特异扩增，由于内含子、启动子和间隔序列在不同物种甚至不同个体间变异很大,这就使得有可能扩增出基于内含子与外显子的SRAP多态性标记，ISSR标记和SRAP标记虽然一定程度上解决了以上两种标记的缺点，但是他们均为随机的显性遗传标记，不能区分显性纯合基因型和杂合基因型。
发明内容
本发明专利针对斑茅基因组DNA，开发出斑茅遗传多样性研究、遗传图谱构建及分子辅助育种研究中多态性高、重复性好，标记稳定可靠，易于区分纯合基因型和杂合基因型的基因组SSR标记引物。
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。
本发明旨在解决现有技术问题的至少之一。本发明一方面提供一组SSR引物组，其特征在于，所述引物组包括核苷酸序列SEQ ID NO：1-30所示引物。
引物列表见表1
本发明另一方面提供上述SSR引物组在检测斑茅多态性中的应用。
本发明另一方面提供上述SSR引物组的设计方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
A、提取待测斑茅样品基因组DNA；
B、用酶切基因组DNA，回收并纯化,回收的产物用接头连接；
C、将连有接头的DNA片段作为模版进行扩增；
D、将步骤C中扩增产物与生物素探针进行杂交，同时用磁珠对杂交产物进行富集，构建SSR富集文库；
E、将步骤D中产物连接到载体上转入到大肠杆菌感受态细胞中，挑取阳性克隆进行DNA测序分析；
F、利用微卫星DNA位点查找软件对阳性克隆进行搜索，筛选出含微卫星的序列，然后用引物分析软件在微卫星两翼设计引物；
G、用不同斑茅材料对开发的SSR引物进行多态性验证。
根据本发明的具体示例，步骤B中采用内切酶，所述酶为Sau3AI酶。
根据本发明的具体示例，步骤B中酶切后进行纯化，用AxyPrep凝胶回收试剂盒回收，加接头序列缓慢退火连接。
根据本发明的具体示例，步骤C中采用接头引物扩增，然后用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
根据本发明的具体示例，步骤D的杂交过程中平衡磁珠，在杂交产物中加入处理好的磁珠温育，然后用磁力柱吸附，洗涤，加入TBST洗脱磁珠，留上清液，沉降DNA，用接头引物对富集产物进行扩增。
根据本发明的具体示例，步骤E中载体为pEASY-T1Cloning Kit。
本发明的另一方面提供SSR引物的用于检测斑茅多态性的方法，所述方法包括如下步骤：提取斑茅DNA，用所述的SSR引物对斑茅DNA进行PCR扩增，扩增产物用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳完成后银染，再用高分辨率数码相机拍照保存。
本发明的另一方面提供一种检测斑茅多态性的试剂盒，包含表1中所述的引物组。
本发明的另一方面提供所述试剂盒检测斑茅多态性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：提取斑茅DNA，用所述的试剂盒对斑茅DNA进行PCR扩增，扩增产物用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳完成后银染，再用高分辨率数码相机拍照保存。
SSR，简单序列重复又称微卫星，是一类由1-5个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，同一类的微卫星可分布于整个基因组的不同位置上，每个座位上重复单位的数目及至重复单位的序列都有可能不完全相同，因而造成了每个座位上的多态性。基于SSR位点开发的SSR标记所需DNA量少，对DNA质量要求不高，易于PCR检测，适合进行高通量分析，共显性遗传，重复性好，多态性高及在基因组中丰富且分布广泛，这些优点使SSR标记逐渐成为遗传多样性分析的首选标记，已经广泛的应用于质量性状基因的定位以及复杂的数量性状基因的定位。
本发明能够检测到斑茅的一些基因组SSR位点的信息，同时通过对设计引物的多态性研制，其设计的引物能有效的用于斑茅的遗传多样性研究及遗传图谱构建，研制多态性采用了先进的基因分析仪，提高了引物多态性检测的精确度。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1：酶切电泳检测结果。左边亮条为酶切产物，右边亮条为MARKER，亮条从上至下分别为1000bp，700bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp。
图2：序列放大电泳检测结果。左边亮条为序列放大产物1，中间亮条为序列放大产物2，右边亮条为MARKER，从上至下分别为1000bp，700bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp。
图3：文库放大结果。左边亮条为文库放大产物，右边亮条为MARKER，亮条从上至下分别为1000bp，700bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp。
图4：菌株筛选图片。图中有4排电泳样品，其中具有条带的为阳性克隆。
图5：SSR引物组检测斑茅多态性的照片。图中第一版胶的第一泳道和第二版胶的第二泳道为MARKER，凉条从上至下分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
实施例一
（1）DNA提取
将用于开发SSR引物的样本材料和用于引物多态性验证的样本材料的幼嫩叶片为材料，采用Plant Gneomic DNA Kit（北京天根生化科技有限公司）方法提取斑茅总DNA，DNA浓度用NanoDrop ND-1000Spectrophotometer（美国NanoDrop公司）检测。用0.1×TE缓冲液[1mmol/L Tris-HC1，0.1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸，ethylene diami-netetraacetic acid)，pH值8.0分别将用于开发SSR引物的样本DNA稀释至100ng/μL，用于引物多态性验证的样本DNA稀释至25ng/μL，储存于-20℃冰箱内，供下一步使用。
（2）DNA酶切与检测
利用限制性内切酶Sau3AI对用于开发SSR引物的样本DNA进行酶切，酶切在37℃水浴4h，酶切反应体系如下：
| 试剂 | 50μL反应体系 |
| 10×buffer（ABI公司，货号：4335613） | 5μL |
| 100×BSA | 0.5μL |
| Sau3AI（4U/L） | 1μL |
| DNA | 1.5g |
| ddH2O | 至50μL |
酶切反应终止终止后，在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳，观察酶切是否完全以及片段是否集中在所需范围内(200bp-1000bp)。
（3）切胶纯化
按AxyPrep凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司生产）说明回收300bp～1000bp之间片段，并纯化。
（4）接头连接
利用以下连接体系，在16℃水浴过夜进行连接。
注：接头引物的序列为（包含酶切位点加粗斜体部分）：5’GATCGTCGACGGTACCGAATTCT；3’CAGCTGCCATGGCTTAAGAACTG
用DNA纯化试剂盒（北京天根生化科技有限公司）纯化连接产物，20L洗脱回收。
（5）接头文库扩增
利用以下扩增体系进行扩增：
| 试剂 | 50μL反应体系 |
| 2.5×Multiplex Buffer | 20μL |
| 接头（50M） | 0.8μL |
| Fast Taq酶 | 0.5μL |
| DNA | 5μL |
| ddH2O | 23.7μL |
接头文库的扩增程序为：
利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，条带呈smear且片段大小在200bp～1000bp之间。
（6）磁珠杂交富集微卫星序列
解链15L接头文库扩增的PCR产物，解链条件为：98℃沸煮5-10min，迅速冰浴1min，48℃水浴1-5min，98℃沸煮1-5min，迅速冰浴1min。
利用如下的杂交体系在60-70℃进行60min探针与解链后的PCR产物进行杂交
| 试剂 | 38μL反应体系 |
| 2×杂交液（LabKit HyB高效杂合液） | 19μL |
| 探针（3’-biotin-(AC)15杂交北京阅微基因技术有限公司） | 1.5μL |
| DNA | 15μL |
| ddH2O | 2.5μL |
以下流程进行磁珠富集
A轻悬磁珠，吸取磁珠悬液30L至硅化管，静置于磁力架上2min，弃上清液。
B加入50L TBST平衡磁珠3次。
C加入720L TBST和38L杂交液37℃温浴1小时。
D14000rpm离心1min，静置于磁力架上2min，弃上清液。
E加入500L TBST洗涤磁珠，55℃温浴30min/次。
F加入100L ddH2O溶解DNA，90℃沸煮5min，快速回收上清液。
（7）杂交文库扩增
用以下体系进行杂交文库扩增：
| 试剂 | 50μL反应体系 |
| 2.5×Multiplex Buffer | 20μL |
| 50M接头 | 0.7μL |
| Fast Taq（5U/μl） | 0.5μL |
| DNA | 5μL |
| ddH2O | 23.8μL |
用以下程序进行扩增：
用1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，条带呈smear且片段大小在200bp～1000bp之间。
按DNA纯化试剂盒说明纯化文库，20L洗脱回收。检测结果如图3。
（8）克隆测序
按全式金pEASY-T1Cloning Kit连接转化，取100L复苏菌液涂于Amp+筛选培养基，37℃恒温培养箱培养过夜。
用以下体系进行菌落鉴定
用以下程序对菌落鉴定
琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，挑选条带呈smear且片段长度在200bp以上的菌落送宝生物公司测序。
（9）引物设计
筛选测序结果，保留重复次数大于等于6次的序列。剔除载体序列，使用PrimerPremier5.0设计引物。
（10）筛选引物多态性
用3个斑茅居群检测验证设计的15对SSR引物，每个居群10个单株，对设计出的引物进行扩增，利用TP-M13-SSR体系进行引物多态性进行筛选
| 试剂 | 20μL反应体系 |
| 2.5×Multiplex Buffer | 8μL |
| TP-M13（5μM） | 0.4μL |
| 开发的SSR引物（5μM） | 2μL |
| Taq酶 | 0.2μL |
| DNA | 2μL |
| ddH2O | 7.6μL |
TP-M13-SSR程序如下：
利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，挑选有目的条带的产物上3730xl基因分析仪检测。共筛选出15对具有多态性的引物，筛选结果见表1。
实施例二
将用于开发SSR引物的样本材料和46份野生斑茅的幼嫩叶片为材料，采用Plant Gneomic DNA Kit（北京天根生化科技有限公司）方法提取斑茅总DNA，DNA浓度用NanoDrop ND-1000Spectrophotometer（美国NanoDrop公司）检测。用0.1×TE缓冲液[1mmol/L Tris-HC1，0.1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸，ethylenediami-netetraacetic acid)，pH值8.0分别将用于开发SSR引物的样本DNA稀释至100ng/μL，用于引物多态性验证的样本DNA稀释至25ng/μL，储存于-20℃冰箱内，供下一步使用。
用所述的SSR引物对斑茅DNA进行PCR扩增，扩增的反应体系和pcr反应程序同实例一的第10步，扩增产物用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳完成后银染，再用高分辨率数码相机拍照保存。结果如图5所示，图5为用正向引物NO25和反向引物NO25对46份野生斑茅材料的扩增图。
以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例索描述的技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，已达到相同技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一组SSR引物组，其特征在于，所述引物组包括核苷酸序列SEQ ID NO：1-30所示引物。
2.如权利要求1所述SSR引物组在检测斑茅多态性中的应用。
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