CN106498083B - 一种检测牛pcaf基因单核苷酸多态性的rflp方法及试剂盒 - Google Patents

一种检测牛pcaf基因单核苷酸多态性的rflp方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测牛PCAF基因单核苷酸多态性的RFLP方法及试剂盒，以牛基因组DNA为模板，PCR扩增牛PCAF基因片段，用限制性内切酶消化PCR扩增产物，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定牛PCAF基因内含子13和3’UTR区单核苷酸多态性。以GenBank Accession No.AC_000158.1为参考，检测到的PCAF基因第61908位、第62131位和第73406位3个SNPs与牛多种重要生长性状相关。本发明提供的在DNA水平上检测PCAF基因SNP的RFLP方法可用于中国肉牛生长性状的标记辅助选择，以便快速建立遗传资源优良的肉牛种群。

Description

一种检测牛PCAF基因单核苷酸多态性的RFLP方法及试剂盒
技术领域
本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种基于RFLP(限制性片段长度多态性)检测牛PCAF基因第61908位、第62131位和第73406位的单核苷酸多态性的方法。
背景技术
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的变化而引起的多态性，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。SNP属于第三代分子标记，具有密度高、双等位基因、易实现自动化检测等优点。由于SNP具有其它标记无法比拟的优点，所以它作为一种研究工具已经在生命科学的各个领域得到广泛应用。
目前，检测SNPs主要采用以下几种方法，即DNA直接测序法、单链构象多态技术(SSCP)、PCR-RFLP法等。其中，PCR-RFLP方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后使用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、操作繁琐、假阳性的缺点。
分子育种，即分子标记辅助选择(molecular mark-assist selection,MAS)，是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中，通过对生长性状密切相关的、并且与数量性状紧密关联的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。
PCAF又名KAT2B，为p300/CBP相关因子，是一种转录辅助激活因子，具有乙酞基转移酶活性，在基因表达的转录激活、细胞循环阻滞和体外培养细胞的分化中起重要作用。PCAF参与前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的转录调控，提示PCAF可能调控牛的脂肪分化与沉积，影响牛的生长性状。
目前，关于牛PCAF基因遗传变异的研究，在中国牛群中尚未见相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测牛PCAF基因单核苷酸多态性的RFLP方法及试剂盒，可用于牛分子育种中的标记辅助选择，进行早期选择，从而加快良种选育速度。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种检测牛PCAF基因单核苷酸多态性的RFLP方法，包括以下步骤：以包含PCAF基因的待测牛全基因组DNA为模板，以引物对P1、P2和P3为引物，分别PCR扩增含牛PCAF基因第61908位、第62131位和第73406位的单核苷酸多态位点的PCAF基因片段；然后采用限制性内切酶HindIII、ApaI和ApaI分别消化含牛PCAF基因第61908位、第62131位和第73406位的单核苷酸多态位点的PCR扩增产物，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据凝胶成像系统分析结果，鉴定牛PCAF基因在第61908位、第62131位和第73406位三个SNP位点的多态性。所述的牛PCAF基因单核苷酸多态性即包括：第61908位的T>C(g.T61908C)、第62131位的T>C(g.T62131C)、第73406位的C>T(g.C73406T)的碱基多态性。
所述的引物对P1、P2和P3序列信息如表1所示。
表1.PCR反应的引物信息
所述的PCR扩增条件为：25μL反应体系包括12.5μL的2×Taq PCR MasterMix(内含Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、Buffer等)，1μL(50ng/μL)牛血液基因组DNA，10μmol/L的P1、P2或P3对应上、下游引物各0.5μL和灭菌超纯水10.5μL。
所述的PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸30s，退火温度在每个循环降低1℃，共18个循环；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环；72℃延伸10min。
所述的限制性内切酶的酶切体系为：PCR产物5μL，10×T Buffer 1.0μL，0.1％BSA1.0μL，HindIII/ApaI(15U/μL)0.2μL，ddH2O 2.7μL，酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化8～10h。
所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.0％。
所述的根据凝胶成像系统分析结果鉴定牛PCAF基因第61908位多态性为：TT基因型表现为21bp和57bp的条带；CC基因型表现为78bp的条带；TC基因型表现为78bp，57bp和21bp的条带。
所述的根据凝胶成像系统分析结果鉴定牛PCAF基因第62131位的单核苷酸多态性为：CC基因型表现为191bp和27bp的条带；TT基因型表现为218bp的条带；TC基因型表现为218bp的条带，191bp和27bp的条带。
所述的根据凝胶成像系统分析结果鉴定牛PCAF基因第73406位的单核苷酸多态性为：CC基因型表现为287bp和27bp的条带；TT基因型表现为314bp的条带；CT基因型表现为314bp，287bp和27bp的条带。
以GenBank Accession No.AC_000158.1为参考，检测的牛PCAF基因第61908位、第62131位和第73406位3个SNPs与牛多种重要生长性状相关。
一种检测牛PCAF基因单核苷酸多态性的RFLP试剂盒，包括用于分别扩增包含牛PCAF基因第61908位、第62131位和第73406位的SNP位点的PCAF基因片段的引物对P1、P2和P3，如表1所示。
所述试剂盒还包括12.5μL的2×Taq PCR MasterMix(内含Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、Buffer等)和灭菌超纯水10.5μL
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明提供的牛PCAF基因单核苷酸多态性检测方法，针对第61908位的内含子13中T到C的突变，PCR扩增PCAF基因内含子13区78bp的基因片段后，当由T突变成C时，不能形成HindIII识别位点，不能被切开；而没有发生突变时，则含有HindIII识别位点，可以被酶切形成21bp和57bp大小的条带。
本发明提供的牛PCAF基因单核苷酸多态性检测方法，针对第62131位和第73406位的T与C之间的突变，PCR扩增PCAF基因内含子13区和3’UTR的目的片段后，当多态位点为C碱基时，则形成ApaI识别位点，可分别被ApaI酶切形成191bp、27bp大小的条带和287bp、27bp大小的条带；而多态位点为T碱基时，则不能被ApaI酶切，则分别为218bp和314bp大小的条带。
因此，本发明中利用的HindIII、ApaI可快速鉴定3个多态位点，从而简单、快速、成本低、精确地检测牛PCAF基因单核苷酸的多态性，可用于牛的分子育种，便于肉牛生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的肉牛种群。
附图说明
图1是牛PCAF基因第61908位、第62131位和第73406位多态位点的测序图。
图2是牛PCAF基因DNA片段及引物序列图，其中A、B、C分别为第61908位、第62131位、第73406位多态位点。图2A中上游引物中把原序列的G突变成A(加框)引入HindIII酶切位点(A^AGCTT)；斜体加框为第61908位T突变成C的多态位点。图2B中上游引物中把原序列的T突变成G(加框)引入ApaI酶切位点(GGGCC^C)；斜体加框为第62131位T突变成C的多态位点。图2C中上游引物中把原序列的C突变成G(加框)引入ApaI酶切位点(GGGCC^C)；斜体加框为第73406位C突变成T的多态位点。
图3是牛PCAF基因酶切电泳结果图，其中A、B、C分别为第61908位、第62131位、第73406位多态位点PCR产物的酶切电泳结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明首先根据NCBI公布的牛PCAF基因序列(GenBank Accession No.AC_000158.1)设计引物，分别以3个中国牛类群的基因组DNA池为模板，进行PCR扩增，并对其纯化，测序。然后，进行测序图分析和序列比对筛查出SNP位点；其次，利用PCR-RFLP方法对待测群体进行多态位点检测；最后，根据在群体中检测到的基因型，进行群体遗传统计分析和生长性状的关联分析，筛选出与牛生长性状密切相关的分子标记。
1、牛样本采集
本发明具体以3个中国牛类群作为检测对象，具体采集样本见表2，采集时间为2015年10月：秦川牛(69头)、福牛(52头)、牦牛(48头)。福牛是牦牛与柴达木黄牛杂交所产生的雌犏牛，再与安格斯公牛交配所产生的后裔群体；
表2.牛样本的采集
2、基因组DNA的分离、提取、纯化
参考文献Sambrock et al(2002)方法。
3、扩增引物设计
以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牛PCAF基因序列(GenBank Accession No.AC_000158.1)为参考序列，利用Primer 5.0设计PCR引物分别扩增PCAF基因第61908位、第62131位和第73406位多态位点(参见图1)的目的片段，由上海生工生物工程有限责任公司合成PCAF基因3对引物P1、P2、P3，其引物对序列信息见表1。
上游引物F1中，把原序列的G突变成A引入HindIII酶切位点(A^AGCTT)；上游引物F2中，把原序列的T突变成G引入ApaI酶切位点(GGGCC^C)，上游引物F3中，把原序列的C突变成G引入ApaI酶切位点(GGGCC^C)；从而分别人为构建了HindIII、ApaI、ApaI的酶切位点，可使用PCR-RFLP方法进行基因型的判定(参见图2)。
4、PCR扩增
分别以3个品种共169头牛的基因组DNA为模版，用上述设计的引物对其进行PCR扩增，PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；PCR反应体系见表3：
表3.PCR反应体系
PCR反应程序：
5、PCR产物酶切
对含牛PCAF基因第61908位的单核苷酸多态位点的PCR产物进行HindIII酶切，对含牛PCAF基因第62131位的单核苷酸多态位点的PCR产物进行ApaI酶切，对含牛PCAF基因第73406位的单核苷酸多态位点的PCR产物进行ApaI酶切，然后根据电泳结果判定其SNP多态性。
1)酶切体系为10μL：包括5μL PCR产物，10×Buffer 1μL，0.1％BSA 1.0μL，限制性内切酶3U，灭菌超纯水2.7μL；
2)酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化8～10h；
6、琼脂糖凝胶电泳分析
1)制作3.0％的琼脂糖凝胶(已经加入核酸染料)，点样后120V电压电泳40min；
2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统成像；
3)根据凝胶成像系统分析结果，对各样品进行判型、记录其基因型。
牛PCAF基因第61908位的单核苷酸多态性为(参见图3A)：TT基因型表现为21bp和57bp的条带；CC基因型表现为78bp的条带；TC基因型表现为78bp，57bp和21bp的条带。其中由于21bp条带较小，故在琼脂糖电泳分析中不易观察到，但通过78bp和57bp条带还是能够准确的鉴别CC基因型、TC基因型和TT基因型。
牛PCAF基因第62131位的单核苷酸多态性为(参见图3B)：CC基因型表现为191bp和27bp的条带；TT基因型表现为218bp的条带；TC基因型表现为218bp，191bp和27bp的条带。其中由于27bp条带较小，故在琼脂糖电泳分析中不易观察到，但通过218bp和191bp条带还是能够准确的鉴别CC基因型、TC基因型和TT基因型。
牛PCAF基因第73406位的单核苷酸多态性为(参见图3C)：CC基因型表现为287bp和27bp的条带；TT基因型表现为314bp的条带；CT基因型表现为314bp，287bp和27bp的条带。其中由于27bp条带较小，故在琼脂糖电泳分析中不易观察到，但通过314bp和287bp条带还是能够准确的鉴别CC基因型、CT基因型和TT基因型。
7、牛PCAF基因第61908位、第62131位和第73406位SNP位点的频率统计分析
1)基因和基因型频率
基因型频率是指一个群体中某种基因型个体数占总个体数的比率。PAA＝NAA/N，其中PAA代表某一位点的AA基因型频率；NAA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。
基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：PA＝(2NAA+NAa1+NAa2+NAa3+NAa4+……+NAan)/2N，式中PA表示等位基因A频率，NAA表示群体中具有AA基因型的个体数量，NAai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1－an为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。
在3个牛类群PCAF基因的第61908位、第62131位和第73406位SNP中，基因型频率及等位基因频率如表4所示。
表4.牛PCAF基因SNP的基因型和等位基因频率
8、牛PCAF基因SNP效应分析
基因型数据：PCAF基因第61908位、第62131位和第73406位SNPs的基因型。
生长数据：福牛(母)6月龄体长、管围、十字部高；秦川牛(母)24月龄体高、胸宽、腰角宽、十字部高；牦牛(公)24月龄体重。
关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值；再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS 19软件分析各基因型间的生长性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：
Yijk＝μ+Gj+eijk，
其中：Yijk为性状观察值，μ为总体均值，Gj为第j个单SNP标记基因型的固定效应，eijk为随机误差。
关联分析结果表明(见表5)：牛PCAF基因第61908位SNP与福牛体长显著相关(P<0.05)，优势基因型为TT；第62131位SNP与秦川牛胸宽、体高、腰角宽和十字部高显著相关(P<0.05)，CC基因型的表型分别显著低于其他两种基因型，且该SNP与福牛管围极显著相关(P<0.01)，而杂合子TC显著低于纯合子CC和TT；第73406位SNP则与牦牛体重极显著相关(P<0.01)。由此可见，PCAF基因的这3个SNP位点对牛生长发育有重要影响，TT基因型可以作为一个提高牛生长性状的候选分子遗传标记。
表5.PCAF基因3个SNPs与生长性状的关联分析
核苷酸序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种检测牛PCAF基因单核苷酸多态性的RFLP方法及试剂盒
<160> 6
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gggttcccac tgcacaggcc aagct 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gtccatcaga cgcccccaca cagag 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
accttcaagg ccttttacat gcggg 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
tcaaagagga atggacacag gcaga 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ctcttcccag tctcactttt gtggg 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
aggcacactg tttgatgagt ttcta 25

Claims (6)

1.一种检测牛PCAF基因单核苷酸多态性的RFLP方法，其特征在于：包括以下步骤：
以待测牛全基因组DNA为模板，以引物对P1、P2或P3为引物，PCR扩增牛PCAF基因片段，然后利用限制性内切酶HindIII对根据引物对P1扩增得到的产物S1进行酶切或利用限制性内切酶ApaI对根据引物对P2或P3扩增得到的产物S2或S3进行酶切，再对酶切后的产物片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据凝胶成像系统分析电泳后片段大小，鉴定牛PCAF基因上单核苷酸多态性位点的基因型；
所述引物对P1为：
上游引物F1：5`-GGGTTCCCACTGCACAGGCCAAGCT-3`
下游引物R1：5`-GTCCATCAGACGCCCCCACACAGAG-3`；
所述引物对P2为：
上游引物F2：5`-ACCTTCAAGGCCTTTTACATGCGGG-3`
下游引物R2：5`-TCAAAGAGGAATGGACACAGGCAGA-3`；
所述引物对P3为：
上游引物F3：5`-CTCTTCCCAGTCTCACTTTTGTGGG-3`
下游引物R3：5`-AGGCACACTGTTTGATGAGTTTCTA-3`
根据凝胶成像系统分析S1酶切电泳片段大小，鉴定牛PCAF基因上单核苷酸多态性位点存在的三种基因型：TT基因型表现为21bp和57bp的条带，CC基因型表现为78bp的条带，TC基因型表现为78bp、57bp和21bp的条带，所鉴定的牛PCAF基因单核苷酸多态性位点与福牛体长显著相关，其中TT基因型可以作为一个提高牛生长性状的候选分子遗传标记；根据凝胶成像系统分析S2酶切电泳片段大小，鉴定牛PCAF基因上单核苷酸多态性位点存在的三种基因型：CC基因型表现为191bp和27bp的条带，TT基因型表现为218bp的条带，TC基因型表现为218bp、191bp和27bp的条带，所鉴定的牛PCAF基因单核苷酸多态性位点与秦川牛胸宽、体高、腰角宽和十字部高显著相关，与福牛管围极显著相关，其中TT基因型可以作为一个提高牛生长性状的候选分子遗传标记；根据凝胶成像系统分析S3酶切电泳片段大小，鉴定牛PCAF基因上单核苷酸多态性位点存在的三种基因型：CC基因型表现为287bp和27bp的条带，TT基因型表现为314bp的条带，CT基因型表现为314bp、287bp和27bp的条带，所鉴定的牛PCAF基因单核苷酸多态性位点与牦牛体重极显著相关，其中TT基因型可以作为一个提高牛生长性状的候选分子遗传标记。
2.如权利要求1所述的检测牛PCAF基因单核苷酸多态性的RFLP方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系包括12.5μL的2×Taq PCR MasterMix、50ng牛基因组DNA以及10μmol/L的引物对P1、P2或P3的上、下游引物各0.5μL。
3.如权利要求1所述的检测牛PCAF基因单核苷酸多态性的RFLP方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s，共43个循环，其中，前18个循环退火温度自68℃开始每个循环降低1℃，后25个循环，退火温度为50℃；72℃延伸10min。
4.如权利要求1所述的检测牛PCAF基因单核苷酸多态性的RFLP方法，其特征在于：所述酶切在10μL的酶切体系中进行，酶切体系包括PCR产物5μL、10×T Buffer 1.0μL，0.1％BSA1.0μL以及15U/μL限制性内切酶0.2μL，酶切条件为37℃消化8～10h。
5.如权利要求1所述的检测牛PCAF基因单核苷酸多态性的RFLP方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度3.0％的琼脂糖凝胶。
6.一种如权利要求1所述的检测牛PCAF基因单核苷酸多态性的RFLP方法在牛生长性状的标记辅助选择中的应用。
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