CN108611428A

CN108611428A - Tgfb3基因多态性作为猪体长和乳头数的遗传标记及应用

Info

Publication number: CN108611428A
Application number: CN201810435058.7A
Authority: CN
Inventors: 左波; 徐在言; 聂光伟; 刘军; 王国水
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2018-05-09
Filing date: 2018-05-09
Publication date: 2018-10-02
Anticipated expiration: 2038-05-09
Also published as: CN108611428B

Abstract

本发明属于动物遗传标记筛选技术领域，具体涉及TGFB3基因多态性作为猪体长和乳头数的遗传标记及应用。该标记从猪TGFB3基因中筛选得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1和图2所示，在该序列139位碱基处发生一个T/A碱基突变，导致Hinf I‑RFLP多态性。筛选方法为：从猪血液中提取基因组DNA，设计引物，进行PCR扩增，PCR产物克隆、测序，序列比对分析，SNP检测，标记与表型性状间相关性分析。公开了猪TGFB3基因第6外显子区的SNP分型检测技术，发现该T/A突变位点与猪的体长、乳头数性状显著相关。本发明为猪标记辅助选择提供了新的遗传标记资源。

Description

TGFB3基因多态性作为猪体长和乳头数的遗传标记及应用

技术领域

本发明属于动物遗传标记筛选技术领域，具体涉及TGFB3基因多态性作为猪体长和乳头数的遗传标记及应用。所述的遗传标记分离自TGFB3基因的第6外显子区域。本发明还包括该遗传标记在猪标记辅助选择关联分析中的应用。

背景技术

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A、T、C或G)的突变而引起的多态性，包括单碱基的插入、缺失、转换和颠换等。由于分布的广泛性和稳定性，在动物分子标记辅助选择(Marker-assisted Selection，MAS)育种上发挥着重要作用。成为加快猪重要经济性状尤其是那些限性性状遗传改良的可行性技术。基于此，进一步鉴定与猪经济性状相关的遗传标记，进而借助MAS将大大提高选种的准确性。

体长和乳头数是评估种猪性能高低参与选种的重要参数，前者影响其体型性状，后者对保证母猪哺乳能力、带仔头数具有直接作用。据报道，猪乳头数的遗传力在0.32～0.39(Lundeheim et al 2013)，体长性状的遗传力在0.29～0.55(de Sevilla et al2009)，皆为中等以上遗传力。相关研究表明，影响猪乳头数变化定位的QTL与肋骨数及体长具有一定相关性，说明这些性状可能是由相同基因所调控(RohrerandDan 2017)。到目前为止，猪7号染色体上的VRTN基因第1内含子g.20311-20312ins291多态性位点是鉴定的已知影响猪肋骨数变异的一个主效位点，且与乳头数、体长性状显著相关(Mikawa et al 2011；Yang et al 2016)。Verardo等通过对猪乳头数进行全基因组关联分析(Genome-WideAssociation Study,GWAS)，在猪的7号染色体105224235bp位置定位到一个新的候选基因转化生长因子β3(transforming growth factor beta3,TGFB3)(Verardo et al 2016)。与此报道的QTL相一致的是，Zhu等在7号染色体105.38Mb基因组区域定位的候选基因TGFB3与肋骨数相关(Zhu et al 2015)。因此，猪7号染色体105.22Mb～105.38Mb所在的QTL，与猪肋骨数、体长和乳头数具有潜在相关的遗传效应。

TGFB3基因的生物学功能主要涉及骨骼发育调控。人TGFB3基因具有促进其骨髓或者脂肪组织来源的间充质干细胞形成软骨的能力，在该过程中BMP2基因增强TGFB3基因的生物学功能，共同发挥着调控作用(Rui et al 2010)。Wang等利用全层软骨病变猪模型分离骨髓间充质干细胞，通过腺病毒包装TGFB3和BMP2基因转染该细胞，检测结果表明这两个基因的表达量升高对全层软骨病变具有良好的修复及愈后能力(Wang et al 2014)。另外，在小鼠模型上研究表明，同时双敲除TGFB2和TGFB3基因的小鼠，与野生鼠对比出现肋骨数减少，说明TGFB3可能是影响肋骨数变异的一个候选基因。因此，本研究选择该基因进行SNPs的检测，并鉴定与猪重要经济性状相关的分子标记。

发明内容

本发明的目的是筛选一种与猪体长和乳头数性状关联的遗传标记。通过克隆猪TGFB3基因第6内含子序列，运用直接测序法寻找SNP位点，并建立了相应的SNP检测方法，分析该突变位点与猪经济性状的关联性。从而为猪育种建立新的标记辅助选择位点。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明获得了大白猪TGFB3基因第6外显子序列在内片段，该片段长度为557bp，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1(见图2)所述，通过在NCBI网站对上述序列进行blast比对，在该扩增片段内发现一处核苷酸多态性(SNP)位点，该SNP位点如SEQ ID NO:1和图2所示。其突变位点具体在第6外显子96bp位置，rs序列号为：rs340551552。申请人将该突变位点命名为g.96T>A。

选择大白猪为试验材料，从大白猪血液中提取基因组DNA，根据NCBI数据库公布的猪TGFB3基因序列设计引物对，该引物对的序列如下所示：

正向引物F：5'-ACCCGCCCTCCTTA-3'，

反向引物R：5'-CTGCCTGAATCTCCC-3'；

利用该引物对进行PCR扩增、PCR产物的纯化、克隆测序和序列比对分析。筛选得到一种与猪生长性状关联的遗传标记，该遗传标记的直观的核苷酸序列如下所示：

ACCCGCCCTCCTTAAACAGGGGACCGTCACCTTCCACCCTTCTGCAGGTGTGGACAGTGAGGATGATCCGGGCCGTGGAGACCTGGGGCGACTTAAGAAGAAGAAGGAACACAGCCCTCATCTAATCCTCATGATGATR(T/A)CCTCCAGACCGGCTAGACAACCCAGGCCTGGGGGCTCAGAGGAAGAAGCGGGCCCTGGACACCAACTACTGCTTCCGGTAAGCCTGGGCCCACCTGGCCCCCGTGACCTCCTACACAATGCTGACTGTGTGCCTCCTGGGGGTCAGGCCCCGGGCTAGGCTGTGCCCAGCTGAGGGTCCCTGATGCGTTTCGCAGAAATCCCAATGCCGATTTAGCATCTCTTACAAGTCTCTTTCTGTTGTTCTGGGAGCACCGCTGTTTTTCCGCAGCTCAACTCTGGAAGGGTCTAGACAAAGCAGAGGAGGAGGAGGAGGATGCTGCTAAAGTGCTTTGGATTGGAGAGGCTTGGCCTCTCCATGGTTTTCATGGTTGAAAGTGACTTGTAGGGTATGTTTGTGTGGCGGGGAGATTCAGGCAG

上述序列的139位碱基处的R是T或A，该突变导致Hinf I-RFLP多态性。

本发明提供了一种筛选猪体长、乳头数性状相关联的遗传标记方法，包括以下步骤：

从猪血液中提取全因组DNA，根据猪TGFB3基因序列设计引物对，该引物对的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，用该引物对在猪基因组DNA中进行PCR扩增，将所得的PCR扩增片段用限制性内切酶Hinf I酶切分型，得到Hinf I-RFLP多态性核苷酸序列(见SEQID NO：1)，在所述的SEQ ID NO：1序列的第139个碱基位点处存在一个T/A的碱基突变，利用该位点可以作为遗传标记与猪的重要经济性状进行关联分析。

本发明提供了检测上述序列g.96T>A变异的Hinf I-RFLP基因型分型方法。

本发明进一步提供了利用Hinf I-RFLP方法确定不同基因型个体与猪重要经济性状之间关联分析的应用。

更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是大白猪TGFB3基因的核苷酸序列，即作为本发明遗传标记的核苷酸序列。其中在该序列的第139个碱基处，产生一个等位基因的突变位点，即由“T”突变为“A”。

序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3是扩增TGFB3基因的引物对序列，该引物对序列也是检测本发明遗传标记的引物。

图1：本发明的技术流程图。

图2：大白猪TGFB3基因的核苷酸序列。在所示序列的第139位碱基处T/A突变位点是导致Hinf I-RFLP多态性的特异性位点。

图3：本发明对TGFB3基因Hinf I-RFLP的检测结果。琼脂糖凝胶浓度为2﹪。附图标记说明：图中泳道：M为DL2000Maker；泳道1为AA基因型(557bp)；泳道2和泳道3为TT基因型(136bp+421bp)；泳道4、泳道5和泳道6为AT基因型(136bp+421bp+557bp)。

具体实施方式

实施例1：猪TGFB3基因第6外显子区域DNA片段的获得及SNP检测方法的建立

试验选择国外血缘猪种“大白猪”，以美系和法系两种类型猪种(大白猪)为材料，根据猪TGFB3基因组序列(登陆号Gene ID：397400)设计如下引物对，具体序列如下：

正向引物F：5'-ACCCGCCCTCCTTA-3'，

反向引物R：5'-CTGCCTGAATCTCCC-3'；

利用上述引物对在“大白猪”基因组DNA中进行PCR扩增。

PCR反应体系见表1所示。

表1 PCR反应体系

PCR反应条件见表2所示。

表2 PCR反应条件

将所得的PCR产物进行纯化和克隆后进行测序，测序工作委托上海生工生物工程技术服务有限公司完成。经blast比对分析，发现在该序列中第139位碱基处存在一个T/A碱基突变(同义突变)，该突变引起限制性内切酶Hinf I酶切位点多态性。

取10uL PCR产物加入0.5uL限制性内切酶Hinf I(20U/uL)、2uL 10×buffer和7.5uL ddH₂O，37℃酶切1小时，酶切产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下观察并记录酶切结果。当此突变处碱基都为T时存在酶切位点，酶切结果检测到两条带记为TT基因型(136bp+421bp)；当此突变处碱基都为A时不识别该位点，酶切结果检测到一条带记为AA基因型(557bp)；当T和A都存在时，酶切结果为三条带记为AT基因型(136bp+421bp+557bp)。结果如图3所示。

实施例2：本发明的遗传标记与猪重要经济性状的关联分析及应用

为了确定猪TGFB3基因第6外显子区域内的SNP与猪表型差异是否相关，选择美系大白猪(600头)和法系大白猪(816头)为试验材料，样本采集及其数据收集于浙江开盛生态农业发展有限公司。采用常规Hinf I-RFLP方法进行多态性检测，并分析猪TGFB3基因外显子6区域不同基因型与猪重要经济性状的相关性。采用SAS统计软件中的混合线性模型(Mixed)进行基因型和表型值之间的关联分析，分析模型为：

Y_ijkl＝u+G_i+M_j+X_k+S_l+e

式中，Y_ijkl为性状观察值；u为性状总平均值；G_i为基因型效应(包括基因加性效应和显性效应)；M_j为年-季度效应；X_k为性别效应及固定效应；S_l为父本效应及随机效应；e为随机误差，假定服从(0，σ²)分布。

对大白猪TGFB3基因第6外显子区域g.96T>A位点的多态性检测，在这两个群体中均检测到三种基因型，基因型频率及分布情况如表2所示。

表3大白猪TGFB3基因Hinf I-RFLP基因型频率和等位基因频率

注：表3括号外的为个体数，括号内的为基因型频率。

从表3中可以看出，在两个群体中T等位基因频率明显大于A等位基因频率。基因型频率统计结果显示，TT基因型个体分别占美系及法系大白猪群体数量的85％和81％，而AA基因型个体均只占群体总数的1％，数量很少。通过对TGFB3基因外显子6多态性位点g.96T>A在大白猪群体中进行哈代-温伯格平衡检验，结果显示该多态性位点在美系(χ²＝2.86，P＝0.09>0.05)和法系大白猪群体(χ²＝0.07，P＝0.80>0.05)中均处于遗传平衡状态。

表4美系大白猪TGFB3基因多态性位点g.96T>A与其重要经济性状的关联分析

表5法系大白猪TGFB3基因多态性位点g.96T>A与其重要经济性状的关联分析

注：1)以上数值为最小二乘均值±标准误；同行含有相同字母表示差异不显著，字母不同时，小写字母表示差异显著(P<0.05)，大写字母表示差异极显著(P<0.01)，未标注者表示差异不显著(P>0.05)。

2)加性效应a＝(AA-TT)/2；显性效应d＝AT-(AA+TT)/2。

结合表4和表5可看出，在美系大白猪中，TGFB3基因多态性位点g.96T>A显著影响猪的体长性状(P<0.05)，与其它性状未达到显著水平。TT基因型个体的体长显著高于AA和AT基因型个体，且TT基因型个体的左乳头数、右乳头数和总乳头数要高于另外两个基因型，但未达到显著水平。因此，在该群体中TT基因型为优势基因型，通过对TT基因型的选留将有助于提高美系大白猪的体长。在法系大白猪中，TGFB3基因g.96T>A多态性位点与猪的左乳头数及总乳头数性状达到显著水平(P<0.05)，其它性状则不显著。TT基因型个体与AA基因型个体相比，具有较高的左乳头数、总乳头数和体长，但体长性状未达到显著水平。因此，在法系大白猪群体中，通过对TT基因型个体的选留，将有助于提高总乳头数。综合以上结果，推测该位点可作为增加猪乳头数和体长性状的分子遗传标记。

参考文献

1.de Sevilla XF,Fàbrega E,Tibau J,Casellas J.Genetic background andphenotypic characterization over two farrowings of leg conformation defectsin Landrace and Large White sows.Journal of Animal Science,2009,87(5):1606-1612；

2.Lundeheim N,Chalkias H,Rydhmer L.Genetic analysis of teat numberand litter traits in pigs.Acta AgriculturaeScandinavica,2013,63(3):121-125；

3.Mikawa S,Sato S,Nii M,Morozumi T,Gou Y,Imaeda N,Yamaguchi T,HayashiT,Awata T.Identification of a second gene associated with variation invertebral number in domestic pigs.Bmc Genetics,2011,12(1):5；

4.Rohrer GA,Dan JN.Genetic analysis of teat number in pigs revealssome developmental pathways independent of vertebra number and several lociwhich only affect a specific side.Genetics Selection Evolution,2017,49(1):4；

5.Rui YF,Lin DU,Wang Y,Wang Y,Po-Yee LP,Tang TT,Chan KM,Dai KR.Bonemorphogenetic protein 2promotes transforming growth factorβ3-inducedchondrogenesis of human osteoarthritic synovium-derived stem cells.中华医学杂志(英文版),2010,123(21):3040-3048；

6.Verardo LL,Silva FF,Lopes MS,Madsen O,Bastiaansen JWM,Knol EF,KellyM,Varona L,Lopes PS,SEF.Revealing new candidate genes forreproductive traits in pigs:combining Bayesian GWAS and functionalpathways.Genetics Selection Evolution,2016,48(1):9；

7.Wang L,Zhang L,Yan H,Liu X,Li N,Liang J,Pu L,Zhang Y,Shi H,ZhaoK.Genome-wide association studies identify the loci for 5 exterior traits ina Large White×Minzhu pig population.Plos One,2014,9(8):e103766；

8.Yang J,Huang L,Yang M,Fan Y,Li L,Fang S,Deng W,Cui L,Zhang Z,AiH.Possible introgression of the VRTN mutation increasing vertebral number,carcass length and teat number from Chinese pigs into European pigs.Sci Rep,2016,6:19240；

9.Zhu J,Chen C,Yang B,Guo Y,Ai H,Ren J,Peng Z,Tu Z,Yang X,Meng Q.Asystems genetics study of swineillustrates mechanisms underlying humanphenotypic traits.BMC Genomics,2015,16(1):88。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> TGFB3基因多态性作为猪体长和乳头数的遗传标记及应用

<141> 2018-05-07

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 557

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(557)

<220>

<221> mutation

<222> (139)..(139)

<400> 1

acccgccctc cttaaacagg ggaccgtcac cttccaccct tctgcaggtg tggacagtga 60

ggatgatccg ggccgtggag acctggggcg acttaagaag aagaaggaac acagccctca 120

tctaatcctc atgatgatac ctccagaccg gctagacaac ccaggcctgg gggctcagag 180

gaagaagcgg gccctggaca ccaactactg cttccggtaa gcctgggccc acctggcccc 240

cgtgacctcc tacacaatgc tgactgtgtg cctcctgggg gtcaggcccc gggctaggct 300

gtgcccagct gagggtccct gatgcgtttc gcagaaatcc caatgccgat ttagcatctc 360

ttacaagtct ctttctgttg ttctgggagc accgctgttt ttccgcagct caactctgga 420

agggtctaga caaagcagag gaggaggagg aggatgctgc taaagtgctt tggattggag 480

aggcttggcc tctccatggt tttcatggtt gaaagtgact tgtagggtat gtttgtgtgg 540

cggggagatt caggcag 557

<210> 2

<211> 14

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(14)

<400> 2

acccgccctc ctta 14

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(15)

<400> 3

ctgcctgaat ctccc 15

Claims

1.一种筛选的与猪体长和乳头数性状显著关联的遗传标记，其特征在于，该遗传标记的核苷酸序列如下所示：

ACCCGCCCTCCTTAAACAGGGGACCGTCACCTTCCACCCTTCTGCAGGTGTGGACAGTGAGGATGATCCGGGCCGTGGAGACCTGGGGCGACTTAAGAAGAAGAAGGAACACAGCCCTCATCTAATCCTCATGATGATR(T/A)CCTCCAGACCGGCTAGACAACCCAGGCCTGGGGGCTCAGAGGAAGAAGCGGGCCCTGGACACCAACTACTGCTTCCGGTAAGCCTGGGCCCACCTGGCCCCCGTGACCTCCTACACAATGCTGACTGTGTGCCTCCTGGGGGTCAGGCCCCGGGCTAGGCTGTGCCCAGCTGAGGGTCCCTGATGCGTTTCGCAGAAATCCCAATGCCGATTTAGCATCTCTTACAAGTCTCTTTCTGTTGTTCTGGGAGCACCGCTGTTTTTCCGCAGCTCAACTCTGGAAGGGTCTAGACAAAGCAGAGGAGGAGGAGGAGGATGCTGCTAAAGTGCTTTGGATTGGAGAGGCTTGGCCTCTCCATGGTTTTCATGGTTGAAAGTGACTTGTAGGGTATGTTTGTGTGGCGGGGAGATTCAGGCAG，

上述序列中的R是T或A，导致Hinf I-RFLP多态性。

2.扩增如权利要求1所述的遗传标记的引物对，其核苷酸序列如下所述：

正向引物：ACCCGCCCTCCTTA，

反向引物：CTGCCTGAATCTCCC。

3.一种筛选的与猪体长、乳头数性状关联的遗传标记方法，其特征包括以下步骤：

从猪血液中提取基因组DNA，根据猪TGFB3基因的基因组序列设计引物，该引物的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；用所述的引物对在猪基因组DNA中进行PCR扩增，对PCR扩增的片段进行Hinf I酶切分型，得到导致Hinf I-RFLP多态性的核苷酸序列，所述的多态性的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在该序列的139bp处存在一个T/A的等位基因突变，利用所述的突变位点作为遗传标记对猪体长和乳头数性状进行关联分析。

4.权利要求1所述的遗传标记在猪体长、乳头数性状辅助选择中的应用。

5.权利要求2所述的引物对在猪体长、乳头数性状辅助选择中的应用。