CN112176082B - 小麦粒重相关基因的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种小麦粒重相关基因的SNP分子标记及其应用，所述小麦SNP位点在鉴定或辅助鉴定小麦千粒重性状中的应用，所述小麦SNP位点位于中国春小麦的TaFLO2‑2A的基因编码区的第2209位，所述SNP位点的核苷酸为C或T。本发明能够实现对高粒重小麦的筛选，为小麦的后续培养和育种提供指导。

Description

小麦粒重相关基因的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及一种小麦粒重相关基因的SNP分子标记及其应用，具体的说，涉及一种检测小麦粒重基因TaFLO2-2A编码区自然等位变异的分子标记及其应用。

背景技术

小麦是世界三大粮食作物之一，如何进一步提高小麦的产量具有重要的生产实践意义。普通小麦即面包小麦(Triticum aestivum)是由四倍体小麦Triticum turgidum(AABB)和二倍体山羊草Aegilops tauschii(DD)经自然杂交，及染色体加倍而形成的异源六倍体小麦(AABBDD)。由于其基因组巨大，因而产量与粒重相关研究长期落后于其它作物。最近，随着小麦基因组参考序列的公布(IWGSC，2018)，为进一步解析小麦产量相关基因并最终提高小麦的产量提供了新的有效的工具。

产量性状属于数量性状，受众多基因调控，其中既包括一些直接影响产量的主效基因，也包括大量对产量存在影响的微效基因。如在模式作物水稻中，已有近60个基因被证明同水稻的粒重与产量相关(曾博虹等，2016；刘喜等，2018)。在以往的常规育种过程中，育种家对育种材料的基因组合并不清楚，因而对优势高产基因的选用与组合较为盲目，全凭经验。分子标记辅助育种则利用开发的分子标记，对各产量相关基因的不同单倍型进行有效区分，从而帮助育种家在育种过程中高效选择各产量相关基因的优势单倍型，来有针对性的对高产优势基因进行聚合，并最终实现对作物产量的有效提高。

在小麦中，目前已在十几个与小麦千粒重相关的基因中发掘到了优异单倍型并开发了分子标记，包括TaCWI基因(Ma et al.，2012；Jiang et al.，2015)、TaSus基因(Jianget al.，2011；Hou et al.，2014)、Ta-6-SFT基因(Yue et al.，2015)、TaGW2基因(Su etal.，2011；Yang et al.，2012；Jaiswal et al.，2015；Zhai et al.，2018)、TaGS3基因(Zhang et al.，2014)、TaGS5基因(Wang et al.，2015；Ma et al.，2016；Wang et al.，2016)、TaGL3基因(Yang et al.，2019)、TaTGW6基因(Hanifet al.，2016；Hu et al.，2016)、TaCKX基因(Zhang et al.，2012；Lu et al.，2015；Chang et al.，2015)、TaGASR7基因(Ling et al.，2013；Dong et al.，2014)、TaSAP基因(Chang et al.，2013；Chang etal.，2014)、TaSnRK2基因(Zhang et al.，2017)、TaGS1基因(Guo et al.，2013)、TaFLO2基因(Sajjad et al.，2017)。这些优异等位变异的发掘及分子标记的开发，为小麦高产育种领域提供了重要的指导意义。

分子标记随着实验技术的进步已演化出三代：早期的第一代分子标记基于DNA-DNA杂交原理，如限制性片段多态性标记(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)，其通过限制性核酸内切酶对DNA进行酶切消化并将产物与DNA探针进行杂交来显示生物体的DNA多态性差异，由于该方法多态性较少且操作繁琐，如今已很少使用；第二代分子标记主要基于PCR技术，如简单序列重复标记(Simple sequence repeats，SSR)，其原理是不同遗传材料微卫星片段重复的次数不同可使PCR产物呈现出片段长度差异，该方法简单稳定，多态性适中，目前仍被广泛使用；第三代分子标记主要是单核苷酸多态性(Singlenucleotide polymorphism，SNP)标记，该标记在基因组中多态性最高，也适合高通量检测。酶切扩增多态性序列(Cleaved amplified polymorphism sequences，CAPS)标记是检测SNP的一种方法，其原理是一些SNP位点连同附近的若干核苷酸构成了特定的限制性酶切位点，从而使携带不同SNP类型的扩增产物通过限制性酶切后能够产生DNA条带长度差异。

FLO2(FLOURYENDOSPERM2)是一个生化功能未知的粒重相关基因，该基因最早在水稻中通过正向遗传学图位克隆得到，并发现该基因正向调控水稻胚乳积累贮藏物和籽粒大小；该基因的功能缺失突变体种子胚乳中的蛋白与淀粉积累都减少，且种子也变小，而过表达FLO2基因则会明显增大水稻籽粒(She et al.，2010)。在模式植物拟南芥中的研究表明，AtFLO2基因与叶绿体室的形态、功能及大小的建立有关(Larkin et al.，2016)，并参与调控光合同化物由源器官向库器官的转运(Kihira et al.，2017)。在小麦中，TaFLO2基因已被克隆并定位在小麦第二同源群上，同时发现在TaFLO2-2A基因的启动子区存在8-bp的插入/缺失等位变异，关联分析表明在TaFLO2-2A基因启动子区存在8-bp插入的单倍型其基因的表达水平较低，为低千粒重的劣势单倍型，并根据这处自然等位变异开发了一个分子标记TaFlo2-Indel8(Sajjad et al.，2017)。在中国春参考基因组序列中TaFLO2-2A基因全长为12184bp，其中编码序列长为5139bp，共编码1712个氨基酸。目前，在小麦中尚无TaFLO2-2A基因编码序列中的SNP位点及优异自然等位变异被报导。

发明内容

本发明的目的在于如何实现小麦粒重性状的鉴定或辅助鉴定。

本发明提供一种用于检测SNP位点的引物对，所述SNP位点用于鉴定或辅助鉴定小麦粒重，所述引物对具有如序列2和序列3所示的核苷酸序列，所述SNP位点位于中国春小麦的TaFLO2-2A的基因编码区的第2209位，其核苷酸为C或T。所述SNP位于小麦染色体上如序列1所示序列的第97bp处，其中第97位的Y表示C或T。

本发明还提供一种鉴定或辅助鉴定小麦千粒重性状的方法，包括：检测待测小麦群体的基因，根据SNP位点的基因型确定待测小麦性状：

所述SNP位点位于中国春小麦的TaFLO2-2A的基因编码区的第2209位；

SNP位点的核苷酸为CC时的小麦群体千粒重小于所述SNP位点的核苷酸为TT时的小麦群体的千粒重。

其中，所述检测待测小麦群体基因组的SNP位点的基因型的方法包括如下步骤：对待测小麦的基因组DNA中任意一段包括所述SNP位点在内的DNA片段进行PCR扩增，并将PCR扩增产物酶切鉴定，得到包括SNP位点在内的DNA片段酶切产物，根据酶切产物片段大小确定所述待测小麦群体基因组的SNP位点的基因型。

其中，所述对待测小麦的基因组DNA中任意一段包括所述SNP位点在内的DNA片段进行PCR扩增的引物对由序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子组成；所述包括所述SNP位点在内的DNA片段的酶切所用的酶为HaeIII。

其中，根据所述酶切产物片段大小确定所述待测小麦群体基因组的SNP位点的基因型为如下：若所述酶切产物仅为481bp的DNA片段，则所述待测小麦在SNP位点的基因型为TT；若所述酶切产物为123bp、358bp的DNA片段，则所述待测小麦在SNP位点的基因型为CC。

本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定待测小麦性状的产品，为检测待测小麦群体基因组SNP位点的基因型的物质。

其中，所述物质包括由序列2和序列3所示核苷酸序列组成的引物对和HaeIII酶；

所述产品可以为试剂盒。

上述检测待测小麦群体基因组的SNP位点的基因型的产品在鉴定或辅助鉴定待测小麦千粒重性状中的应用也应在本发明的保护范围之内。

上述的鉴定或辅助鉴定小麦千粒重性状的方法在培育千粒重高的小麦种的应用也应在本发明的保护范围之内。所述培育千粒重高的小麦种的方法包括：筛选或培育SNP位点的基因型为TT的小麦群体。

本发明通过发掘小麦粒重基因TaFLO2-2A基因编码区的优异自然等位变异、确定其SNP位点，并提供用于检测基于TaFLO2-2A基因编码区SNP位点所划分基因型的分子标记。通过检测所述的SNP，即可找到千粒重相对较高的小麦。进而为高效筛选TaFLO2-2A基因的目标单倍型、构建高产近等基因系提供辅助手段，并为进一步研究小麦中TaFLO2-2A基因的功能奠定基础。本发明为小麦分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，在培育高产小麦品种或研究中具有重要意义。

附图说明

图1为TaFLO2-2A基因编码区第2209bp处SNP的发掘，其中，图1A为MY5122的TaFLO2-2A基因编码区第2209bp处SNP位点的测序结果；图1B为该SNP位点造成的氨基酸序列改变同YZ4110及中国春参考基因组序列对应位置的比较；图1C为TaFLO2-2A的蛋白结构预测；

图2为FLO2AS分子标记开发示意图，其中竖线代表SNP的位置，FLO2AS-F和FLO2AS-R为FLO2AS分子标记上下游引物的位置示意，M为D2000DNA Marker，HZ代表杂合(Heterozygous)；

图3为用FLO2AS标记对部分小麦品种进行单倍型检测的结果示例，其中，M为D2000DNAMarker，YZ4110为Hap-A的对照，MY5122为Hap-B的对照，各小麦品种依序分别为中国春(Chinese Spring)、莱州953(Laizhou 953)、矮抗58(Aikang 58)、中农28(Zhongnong28)、台中23(Taizhong 23)、苏麦3号(Sumai 3)、和浦头(Heputou)、扬麦1号(Yangmai 1)、品春16号(Pinchun 16)、宁春10号(Ningchun 10)、大红麦(Dahongmai)、阿夫(Afu)、土麦(Tumai)、双吉4号(Shuangji 4)、黑辐(Heifu)、晋麦33(Jinmai 33)、肯庆2(Kenqing 2)、绵阳82(Mianyang 82)、AC Reed、SIRMIONE、鲁资08744(Luzi 08744)、品冬29(Pindong 29)、商洛81(Shangluo 81)、三颗寸(Sankecun)、高原338(Gaoyuan 338)、冀麦30(Jimai 30)、丰抗8号(Fengkang 8)、西农511(Xinong 511)、克旱9号(Kehan 9)、洋麦(Yangmai)、郑引4号(Zhengyin 4)、胜利麦(Shenglimai)、水源86(Shuiyuan 86)、咸农39(Xiannong 39)、安农1124(Annong 1124)、宁春4号(Ningchun 4)、白麦子(Baimaizi)、鲁资0896231(Luzi0896231)；

图4为TaFLO2-2A基因两种单倍型同千粒重的关系，其中，图4A为2017年YZ4110导入系近等基因系群体(2017 NIL population)274个家系不同单倍型的千粒重统计；图4B为F2亚群1(Sub-group 1 of the F2 population)不同单倍型的千粒重统计；图4C为F2亚群2(Sub-group 2 of the F2 population)不同单倍型的千粒重统计；图4D为218份小麦品种不同单倍型(Different haplotypes in 218 varieties)的千粒重统计，HZ代表杂合(Heterozygous)。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

一.TaFLO2-2A基因编码区SNP的发掘

在中国春参考基因组序列网站(http://202.194.139.32)中可以下载到中国春小麦各基因的基因序列。在DNAMAN中，根据中国春参考序列TaFLO2-2A(TraesCS2A01G517100.3)、TaFLO2-2B(TraesCS2B02G545600.2)、TaFLO2-2D(TraesCS2D02G518700.2)三个同源基因编码区之间的序列差异，设计了引物FLO2A2-F和FLO2A3-R，所述FLO2A2-F为5’-TTTGAGGAACGTGTTGGGGACTTGT-3’其下划线为基因组特异性SNP位点的位置，所述FLO2A3-R为5’-AACCTTGCTGCAAAGGCCTCTT-3’其下划线为基因组特异性SNP位点的位置，用这两个引物可以扩增出TaFLO2-2A基因编码区中间位置1347bp长的一段序列。用不同的小麦材料成熟叶片cDNA作为模板，扩增这段序列并测序，再同中国春参考基因组序列中的相应位置进行比较，找到一处位于TaFLO2-2A基因编码区第2209bp处的SNP位点。所述SNP位于基因第13外显子上子第97bp处，所述第13外显子长102bp，其核苷酸序列如序列1所示，其中自5’端起第97位的Y表示C或T。(对于TaFLO2-2A基因编码区，自起始密码子第1位碱基算起，前12个外显子总长2112-bp，所述SNP位于第13外显子第97bp处，相当于位于TaFLO2-2A基因编码区第2209bp处。)

具体操作过程如下：

1.小麦RNA的提取

用Biomiga公司的植物总RNA提取试剂盒进行小麦RNA的提取，具体步骤如下：

(1)将小麦新鲜叶片在研钵中加液氮进行冷冻研磨，取少于100mg磨碎的组织于2.0mL离心管中，立即加入1mLBiozol试剂并涡旋震荡混匀，于室温下孵育2min。

(2)向上述匀浆中加入氯仿，加入量为每1mL Biozol试剂需对应加入0.5mL的氯仿，并剧烈涡旋震荡15sec，于12000g/min 4℃条件下离心3min。

(3)吸取不超过上层水相80％体积的液体转移到新的2.0mL离心管中，并加入0.5倍体积的异丙醇，剧烈涡旋震荡15sec，得到混合液。将不超过700μL的混合液加入到ezBindRNA离心柱中，将离心柱插入2mL套管，室温下10000g/min离心1min，弃去套管内废液并保留离心柱。

(4)将离心柱放入新的2mL收集管中，加入400μL Buffer RB，10000g/min离心1min，弃去套管内的废液。

(5)DNase I消化，包括如下步骤A-D，需注意的是，消解混合液不能涡旋，各组分在加入时要小心，消解混合液需要现配现用，在提取RNA前应备好。

A.为每个样品准备如下DNase I消解混合液(50μL)：10×DNase I Buffer(5μL)、RNase-free DNaseⅠ(2U/μL)(6μL)、RNase Inhibitor(40U/μL)(0.5μL)、DEPC ddH₂O(38.5μL)。

B.向每个ezBindRNA离心柱中加入50μL消解混合液，室温孵育15min。

C.加入200μLDNase Stop Buffer，至少等待5min，10000g/min离心1min，弃去套管内的废液。

D.将柱子放回2mL收集管中，向离心柱内加入400μL Buffer RB，10000g/min离心1min，弃去套管内的废液。

(6)将离心柱放入相同的2mL收集管中，加入600μLRNAWash Buffer，于10000g/min离心1min，弃去套管内的废液。重复该步骤一次。

(7)将离心柱置于新的2mL收集管中，13000g/min离心2min，并干燥离心柱20-30min。

(8)将离心柱插入到干净的1.5mL离心管中，加入30-50μL预热到70℃的DEPCddH₂O，静置2min，于13000g/min离心1min，即得RNA溶液。

2.反转录与PCR扩增

将RNA反转录为cDNA，并以cDNA为模板用引物对FLO2A2-F和FLO2A3-R扩增出TaFLO2-2A基因编码区1347-bp长的片段。具体步骤如下：

(1)RNA变性反应体系：小麦总RNA(2μg)、Oligo dT(1μg/μL)(1μL)，用DEPC ddH₂O补齐至15μL。于PCR仪上70℃孵育5min，孵育结束后迅速置于冰上冰浴2min。

(2)反转录反应体系：变性体系(15μL)、M-MLV 5×buffer(5μL)、dNTP(10mM)(1.25μL)、RRI(40U/μL)(0.625μL)、M-MLV反转录酶(1μL)、DEPC ddH₂O(2.125μL)。混匀后于PCR仪上42℃反应1hr。

(3)将反转录产物直接稀释20倍后，取2μL为模板进行PCR扩增。10μL的PCR反应体系包括DNA模板(2μL)、10×PCRbuffer(1μL)、2.5mM dNTP(1μL)、Taq酶(0.1μL)、10μM正向引物FLO2A2-F(0.3μL)、10μM反向引物FLO2A3-R(0.3μL)、ddH₂O(5.3μL)。PCR反应程序为，先94℃预变性4min后进入PCR循环，循环包括94℃变性30s→56℃复性30s→72℃延伸1.5min，40个循环后在72℃继续延伸5min。

3.DNA片段的回收与测序

用1％的琼脂糖凝胶，对上述PCR反应产物通电电泳25min，将对应位置处的胶块切出，并仔细将胶块上不含有DNA的部位去除。用Vigorous公司的DNA凝胶回收与纯化试剂盒进行DNA片段的回收，具体步骤如下：

(1)将含有DNA的琼脂糖胶块装入1.5mL离心管中，并估算其体积，加入500μL(<150μL凝胶)或3-4倍(>150μL凝胶)凝胶体积的Buffer PS。将离心管置于60℃水浴锅中水浴5-10min，期间每隔2-3min混悬震荡10sec，至胶块完全溶解后，于室温下放置5min冷却。

(2)在溶胶同时，对离心柱进行平衡处理：向插入套管中的离心柱内加入300μL的BufferPEA，12000g/min离心30sec，弃去套管内废液，再将离心柱插回套管。

(3)将少于700μL的融化胶液转移至已经平衡处理好的离心柱内，12000g/min离心1min，弃去套管内的废液，将离心柱插回套管。

(4)向离心柱内加入700μLBufferPW，12000g/min离心1min，弃去套管内的废液，再将离心柱插入套管。再次向离心柱内加入200μLBufferPW，12000g/min离心1min，弃去套管内的废液，再将离心柱插入套管。

(5)12000g/min离心2min后，小心取下离心柱，注意不要沾上套管内残存的废液，弃去套管。

(6)将离心柱插入一个新的1.5mL离心管中，在离心柱内硅胶膜的中心位置加入30-50μL Elution Buffer，小心不要触及硅胶膜；室温放置2-5min后，12000g/min离心1min，离心管内即得纯化的DNA溶液。

以FLO2A3-R为引物，对回收得到的DNA片段进行测序，测序结果用DNAMAN软件进行分析，同中国春参考基因组中TaFLO2-2A基因相应位置处的序列进行比较后，即可发现TaFLO2-2A基因编码区第2209bp处的SNP位点。

二.分子标记FLO2AS的开发和使用

在DNAMAN中，根据中国春参考序列中TaFLO2-2A(即TraesCS2A01G517100.3)、TaFLO2-2B(即TraesCS2B02G545600.2)、TaFLO2-2D(即TraesCS2D02G518700.2)三个同源基因之间的基因序列差异，设计如下引物：位于TaFLO2-2A基因第12内含子上的FLO2AS-F即序列2(5’-ACTTTTCTCTGGGACTGATTTT-3’，下划线为基因组特异性SNP位点的位置)，位于TaFLO2-2A基因第14外显子上的FLO2AS-R即序列3(5’-AATTCATCTTTCAGTTTCCAAC-3’，下划线为基因组特异性SNP位点的位置)。用该CAPS分子标记可以以各小麦材料的总DNA为模板，快速的对TaFLO2-2A基因进行单倍型检测，具体使用方法如下：

1.小麦总DNA的提取

使用CTAB法提取小麦的总DNA，具体步骤如下：

(1)配制2×CTAB缓冲液：NaCl(81.81g)、0.5M EDTA(pH 8.0)(40mL)、1M Tris-HCl(pH 8.0)(100mL)、CTAB(20g)，加水定容至1000mL。配制1×TE缓冲液：0.5M EDTA(pH 8.0)(200μL)、1M Tris-HCl(pH 8.0)(1mL)，加水定容至100mL。将异丙醇提前放置于-20℃预冷，氯仿/异戊醇(24:1)提前放置于4℃预冷，2×CTAB缓冲液放置于65℃水浴锅中预热。

(2)取小麦新鲜叶片在研钵中加液氮研磨，取约0.1g研磨破碎的小麦组织放入2mL离心管中，加入800μL预热到65℃的2×CTAB缓冲液，于震荡仪上涡旋混匀。65℃水浴30min，期间上下颠倒混匀3次。

(3)加入700μL预冷到4℃的氯仿/异戊醇(24:1)试剂，水平放置于摇床上60r/min抽提30min，期间上下颠倒混匀3次。13500g/min离心10min。

(4)小心吸取上清液至新的2mL离心管中，加入2/3体积预冷到-20℃的异丙醇，颠倒混匀后于-20℃沉淀30min以上。

(5)13500g/min离心10min，倒去上清，加入1mL 70％乙醇并上下震荡数次洗涤沉淀。13500g/min离心5min后，倒去上清，于室温下晾干。

(6)加入100μL含有RNaseA的1×TE缓冲液(每1mL 1×TE缓冲液加入5μL 100mg/mL的RNaseA)，于37℃恒温箱中消化1hr。测定浓度后，将DNA溶液稀释至50ng/μL，在10μLPCR扩增体系下，可取2μL作为模板。

2.FLO2AS标记的检测方法

(1)PCR扩增：10μL的PCR反应体系包括DNA模板(2μL)、10×PCRbuffer(1μL)、2.5mMdNTP(1μL)、Taq酶(0.1μL)、10μM正向引物FLO2AS-F(0.3μL)、10μM反向引物FLO2AS-R(0.3μL)、ddH₂O(5.3μL)。PCR反应程序为，先94℃预变性4min后进入PCR循环，循环包括94℃变性30s→56℃复性30s→72℃延伸40s，40个循环后在72℃继续延伸5min。

(2)酶切反应：10μL的酶切混合液包括10×NEB Cut SmartBuffer(2μL)、Hae III(0.1μL)、ddH₂O(7.9μL)。向10μL的PCR产物中加入10μL酶切混合液，于37℃酶切消化8hr以上。

(3)电泳检测：用1％的琼脂糖凝胶，对上述酶切产物通电电泳25min，即可检测出TaFLO2-2A基因相应的单倍型。

三.TaFLO2-2A基因两种单倍型同千粒重的关系统计

小麦材料的田间种植方法：每年10月上旬人工点播，播种前每亩地施复合肥50kg作为基肥，播种行长2.0m，株距5cm，行距25cm，大田常规管理。小麦生长期内灌溉浇水三次，分别为10月上旬播种后浇水一次，4月初浇水一次，5月小麦灌浆期间浇水一次，生长期内不再追肥。

千粒重的测量方法：待籽粒自然干燥后，随机取100粒进行称重，重复一次后若两次结果相差不超过5％则取平均值进行记录，并将结果换算为千粒重。

在小麦拔节期进行挂牌编号，取新鲜叶片提取总DNA，用FLO2AS进行基因型鉴定。小麦收获后，测量千粒重，并用Excel软件统计各单倍型对应的平均千粒重，并计算误差值。

实施例1

小麦YZ4110(国审麦2003032，可由种业公司获取)是我国黄淮冬麦区主推麦种之一，小麦MY5122则是自国外引种的优良小麦材料(可由中国农业科学院作物种质资源库获取，统一编号MY005122)。取这两种小麦材料的新鲜叶片，液氮研磨并提取总RNA，对RNA进行反转录。在中国春参考基因组序列网站中可以下载到中国春小麦TaFLO2-2A(TraesCS2A01G517100.3)、TaFLO2-2B(TraesCS2B02G545600.2)、TaFLO2-2D(TraesCS2D02G518700.2)三个同源基因的基因序列，在DNAMAN中对三个同源基因进行比较，可以根据三个同源基因间的SNP差异设计出基因组特异性引物，来特异性的扩增TaFLO2-2A基因片段。通过该方法，在TaFLO2-2A基因编码区中间位置设计了基因组特异性引物FLO2A2-F与FLO2A3-R。

以YZ4110和MY5122的cDNA为模板，用上述引物组合可以特异性扩增YZ4110和MY5122的TaFLO2-2A基因编码区1347-bp长的片段，以FLO2A3-R为引物进行测序，发现YZ4110的序列同中国春参考基因组序列一致，而MY5122在该段序列上存在一处SNP差异，如图1A所示，图1A为MY5122的TaFLO2-2A基因编码区第2209bp处SNP位点的测序结果。用DNAMAN同参考序列进行比对发现，这处SNP位于TaFLO2-2A基因编码区第2209bp位置，并会引起TaFLO2-2A蛋白第737位氨基酸残基由精氨酸变为半胱氨酸，如图1B中方框内圈出的部分所示。在NCBI的蛋白质保守结构域预测网站上对TaFLO2-2A蛋白进行分析发现，该蛋白自第715位氨基酸残基到第856位氨基酸残基构成一个保守的CLU-central结构域，如图1C所示，因而该SNP位点会造成TaFLO2-2A蛋白保守结构域上出现氨基酸改变。

为了在其它材料中对这处SNP位点进行有效检测，开发了一个CAPS标记FLO2AS。该标记的开发原理为，在YZ4110的TaFLO2-2A基因编码区第2209bp处连同附近区域，构成一处HaeIII限制性核酸内切酶的特异性酶切位点GGCC，而在MY5122中由于SNP的存在使该区域不存在此酶切位点。第2209bp处的SNP位于TaFLO2-2A基因第13外显子上，在该外显子上游的内含子区域和第14外显子上分别设计基因组特异性引物FLO2AS-F和FLO2AS-R，使其上分别带有3个和2个基因组特异性SNP位点，来保证扩增得到的481-bp的DNA片段仅来自于TaFLO2-2A基因，并只携带一处HaeIII的特异性酶切位点。经HaeIII特异性酶切，来自YZ4110的DNA片段可以被酶切为123-bp和358-bp的两条小片段，而来自MY5122的DNA片段不会被酶切降解从而保持为481-bp的DNA片段，杂合基因型经酶切处理后则可以得到三条DNA条带，经琼脂糖凝胶电泳后，三种基因型均易于区分，如图2所示。将YZ4110的基因型命名为单倍型A(Hap-A)，将MY5122的基因型命名为单倍型B(Hap-B)。

在其它小麦品种中用FLO2AS标记进行检测，该标记检测结果均稳定可靠(如图3示)。图3为用FLO2AS标记对部分小麦品种进行单倍型检测的结果示例，其中，M为D2000DNAMarker，YZ4110为Hap-A的对照，MY5122为Hap-B的对照，各小麦品种依序分别为中国春、莱州953、矮抗58、中农28、台中23、苏麦3号、和浦头、扬麦1号、品春16号、宁春10号、大红麦、阿夫、土麦、双吉4号、黑辐、晋麦33、肯庆2、绵阳82、AC Reed、SIRMIONE、鲁资08744、品冬29、商洛81、三颗寸、高原338、冀麦30、丰抗8号、西农511、克旱9号、洋麦、郑引4号、胜利麦、水源86、咸农39、安农1124、宁春4号、白麦子、鲁资0896231。同时用FLO2AS标记和文献中报导的用于检测TaFLO2-2A基因启动子区8-bp的插入/缺失等位变异的TaFlo2-Indel8标记对218份小麦品种进行检测发现，有51份小麦品种为Hap-A且不含有启动子区的8-bp插入，23份小麦品种为Hap-A且含有启动子区的8-bp插入，1份小麦品种为Hap-B且不含有启动子区的8-bp插入，143份小麦品种为Hap-B且含有启动子区的8-bp插入。该结果表明TaFLO2-2A基因启动子区和编码区的这两处自然等位变异位点是相互独立的，可能分别起着不同的功能。

以YZ4110为轮回亲本，MY5122为供体亲本，通过三轮回交与八轮自交，得到了YZ4110高代粒重导入系BC3F9近等基因系群体，该群体种植于中国农科院网室环境，大田常规管理。用FLO2AS对该近等基因系群体的274个家系进行检测发现，91个家系为Hap-A，140个家系为Hap-B，43个家系为杂合(此时91个家系为Hap-A对应的SNP位点的基因型为CC，140个家系为Hap-B对应的SNP位点的基因为TT，43个家系为杂合对应的SNP位点的基因型为CT)，Hap-B家系的平均千粒重比Hap-A高9g(结果如图4A所示)。Hap-B与Hap-A和杂合的千粒重均存在极显著差异(P<0.01)，P值分别为2.37E-16和2.29E-8(Student’s t-test)，表明Hap-B单倍型与导入系群体的千粒重存在显著关联。

表2 274家系的小麦千粒重与SNP位点处基因型对照表

用两个Hap-B家系同YZ4110回交一次并自交，得到了两个F2次级分离群体亚群，两个亚群均种植于中国科学院植物研究所香山育种基地，大田常规管理。经标记检测，在亚群1的474株样本中有161株为Hap-A、94株为Hap-B、219株为杂合(此时161个家系为Hap-A对应的SNP位点的基因型为CC，94个家系为Hap-B对应的SNP位点的基因为TT，219个家系为杂合对应的SNP位点的基因型为CT)，其中Hap-B单倍型的植株平均千粒重比Hap-A高0.75g(结果如图4B所示)；亚群2中有120株为Hap-A、81株为Hap-B、200株为杂合，其中Hap-B单倍型的植株平均千粒重比Hap-A高约5g(结果如图4C所示)。在亚群1中，Hap-B与Hap-A和杂合基因型的千粒重差异均不显著，P值分别为0.670和0.397(Student’s t-test)；而在亚群2中，Hap-B与Hap-A的千粒重存在极显著差异(P<0.01)，与杂合基因型的千粒重差异则不显著，P值分别为0.005和0.154(Student’s t-test)。

因此，通过进一步回交并结合FLO2AS标记的筛选，能够将TaFLO2-2A基因的优异单倍型导入到YZ4110材料中，从而实现对YZ4110的增产改良。对上述方法得到的218份小麦样品进行千粒重统计，在218份小麦品种中，带有Hap-B单倍型的品种平均千粒重比带有Hap-A单倍型的小麦品种高1.6g(图4D)。两种单倍型的平均千粒重间无显著差异，P值为0.216(Student’s t-test)。上述结果表明FLO2AS标记能够很好的在小麦高产育种中获得应用。

本发明通过发掘小麦粒重基因TaFLO2-2A基因编码区的优异自然等位变异、确定其SNP位点，并提供用于检测基于TaFLO2-2A基因编码区SNP位点所划分基因型的分子标记。通过检测所述的SNP，即可找到千粒重相对较高的小麦。进而为高效筛选TaFLO2-2A基因的目标单倍型、构建高产近等基因系提供辅助手段，并为进一步研究小麦中TaFLO2-2A基因的功能奠定基础。本发明为小麦分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，在培育高产小麦品种或研究中具有重要意义。

序列表

<110> 中国科学院植物研究所

<120> 小麦粒重相关基因的SNP分子标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 102

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<400> 1

gtggctgatt ttgcttccct tgaactttct ccagtggatg gaagaacgat gactgatttc 60

atgcatacaa ggggactaaa tatgtgctca ttaggcygtg tg 102

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acttttctct gggactgatt tt 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aattcatctt tcagtttcca ac 22

Claims (7)

1.一种小麦SNP位点在鉴定或辅助鉴定小麦千粒重性状中的应用，所述小麦SNP位点位于中国春小麦的TaFLO2-2A的基因编码区的第2209位，所述SNP位点的核苷酸为C或T。

2.一种检测小麦SNP位点的基因型的物质在制备用于鉴定或辅助鉴定小麦千粒重性状产品中的应用，所述SNP位点位于中国春小麦的TaFLO2-2A的基因编码区的第2209位，所述SNP位点的核苷酸为C或T；

所述检测小麦SNP位点的基因型的物质为扩增包括SNP位点在内的基因组DNA片段的PCR引物；

所述PCR引物为序列表中SEQ ID No.2所示的单链DNA和序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA。

3.一种鉴定或辅助鉴定小麦千粒重性状的方法，其特征在于，包括：检测待测小麦的基因组DNA的SNP位点基因型，根据SNP位点基因型鉴定待测小麦千粒重性状；所述SNP位点位于中国春小麦的TaFLO2-2A的基因编码区的第2209位。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法中，Hap-B基因型的待测小麦的千粒重高于Hap-A基因型的待测小麦的千粒重；Hap-A基因型是小麦基因组中权利要求1中所述小麦SNP位点为C的纯合型，Hap-B基因型是小麦基因组中权利要求1中所述小麦SNP位点为T的纯合型。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述检测待测小麦群体基因组的SNP位点的基因型的方法包括如下步骤：对待测小麦的基因组DNA中任意一段包括所述SNP位点在内的DNA片段进行PCR扩增，并将PCR扩增产物酶切鉴定，得到包括SNP位点在内的DNA片段酶切产物，根据酶切产物片段大小确定所述待测小麦群体基因组的SNP位点的基因型；

所述对待测小麦的基因组DNA中任意一段包括所述SNP位点在内的DNA片段进行PCR扩增的引物对由序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子组成；所述包括所述SNP位点在内的DNA片段的酶切所用的酶为HaeIII；

所述根据所述酶切产物片段大小确定所述待测小麦群体基因组的SNP位点的基因型为如下：若所述酶切产物仅为481bp的DNA片段，则所述待测小麦在SNP位点的基因型为TT；若所述酶切产物为123bp、358bp的DNA片段，则所述待测小麦在SNP位点的基因型为CC。

6.权利要求3-5任一所述的鉴定或辅助鉴定小麦千粒重性状的方法在培育千粒重高的小麦种的应用。

7.一种鉴定或辅助鉴定待测小麦性状的产品，为检测待测小麦群体基因组SNP位点的基因型的物质；所述物质包括权利要求2所述的引物对或者权利要求2所述的引物对与HaeIII的混合物。

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