CN112795577B - 一种高粱籽粒单宁新基因tan1-d及高通量检测标记 - Google Patents
一种高粱籽粒单宁新基因tan1-d及高通量检测标记 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了调控高粱籽粒单宁有无基因Tannin1编码区内一个新型的功能性等位变异，特定区域12碱基的缺失(TCGTCTACGAGA)，命名为tan1‑d变异类型。这种功能性等位变异导致高粱籽粒单宁丧失；根据这个新型功能性等位变异开发的适宜于高通量标记分子标记检测的KASP分子标记，可快速、高效、高通量检测这种变异类型，不仅可以高效检测这种变异在高粱品种中的分布情况，筛选含有及不含有这等位变异的高粱种质资源，同时还可以在育种群体中进行标记辅助选择，选育含有及不含单宁的高粱新品种，用于酿酒、食品及饲料等不同用途。
Description
技术领域
本发明涉及作物分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种高粱籽粒单宁新基因tan1-d及高通量检测标记。
背景技术
高粱（Sorghum bicolor L. Moench）是世界上继小麦、玉米、水稻和大麦之后的第五大作物。在我国，高粱生产的经济意义和国家需求主要体现在杂粮食品、酿酒工业、饲料工业、色素工业和生物质能源等几个方面。高粱曾是中国北方地区的主要粮食作物，近年来种植面积却呈下降趋势，而且用来代替玉米用于饲料的高粱多靠进口。这其中一个重要原因就是我国高粱籽粒的营养品质低，适口性差。具体表现为单宁含量偏高，淀粉结构欠佳、氨基酸组成不平衡。
不同于水稻、小麦和玉米等作物，高粱的籽粒中含有单宁。当籽粒中的单宁含量超过0.5%，会严重影响食用和饲用价值。单宁不但使高粱产生涩味，适口性变差，而且可以与蛋白质、碳水化合物，酶和金属离子等结合形成难以消化吸收的复合物，还会降低一些消化酶的活性，从而影响蛋白质的消化吸收，降低了营养价值。但在酿酒行业中，适量的单宁含量是高粱成为名酒酿原料的主要原因。此外，单宁具有高抗氧化作用、抗炎症和UV防护作用，对人体健康有益。这些需求对高梁籽粒中单宁有无及含量提出了不同要求。因此针对不同用途，有效控制不同品种籽粒中的单宁含量是提高其应用价值、扩大应用范围应首要解决的问题。因此鉴定并利用控制单宁形成基因培育具有不同单宁含量的品种是高粱籽粒单宁含量改良的最经济有效的途径。
单宁（Proanthocyanidins）又称为缩合单宁（condensed tannins）,是类黄酮或花青素生物合成代谢的末端产物聚合体。在高粱中，单宁主要存在于籽粒的外种皮中。不同品种中单宁含量受遗传背景影响差异很大，几乎所有的野生高粱都含有单宁，由于单宁主要存在于高粱籽粒的外种皮，致使单宁的遗传又受种皮中其他遗传因子的影响而变得更加复杂。经典遗传学和连锁研究通过种子颜色及外种皮层的有无鉴定了一些控制高粱籽粒颜色及多酚化合物的位点。但是籽粒颜色并不是判断高粱是否含有单宁的可靠指标，不同高粱品种中单宁含量随籽粒颜色变化很大。禾谷类作物单宁形成、调控等分子基础的研究还处于初始阶段，除Tannnin1 基因外，其他与单宁有关的基因还没有鉴定，更缺乏用于单宁育种的高通量分子标记。
发明内容
为解决以上技术上的不足，本发明提供了一种高粱籽粒单宁新基因tan1-d及高通量检测标记。
通过QTL（quantitative trait locus数量性状基因座）精细作图技术，已经图位克隆了位于高粱第4号染色体上的QTL，将其命名为Tannin1，将含有单宁的高粱与不含单宁的高粱Tannin1基因测序并进行序列比对，发现Tannin1在+580位点、+923位点、+1054位点的三个功能性等位变异位点，造成Tannin1编码的氨基酸序列发生了变化，是造成部分高粱品种单宁丧失的根本原因。但是，我们在对大量来自中国及非洲的高粱品种单宁有无及含量鉴定及以上三个关键SNP进行检测时发现，部分品种虽然籽粒丧失单宁，但Tannin1基因型与野生型（有单宁类型）相同。说明这些品种资源中可能含有其他的变异类型。
在此基础上，本发明利用Tannin1基因的序列特异引物，对这些品种的基因序列进行测序、比对，最终在品种“干刷糙”Tannin1编码区+659位点（220aa）处发现一个12bp(TCGTCTACGAGA)的缺失，而含有单宁的野生型品种含有这12个碱基。该缺失导致Tannin1基因编码的蛋白第3个与第4个WD40结构域之间少了4个氨基酸，从而造成Tannin1基因功能的丧失。以上缺失是该基因内另外调控单宁丧失的关键变异，将这个位点命名为tan1-d 。利用以上插入/缺失突变设计适合在育种中进行标记辅助选择的高通量KASP标记，对高粱品种中Tannin1基因编码区内造成单宁有无变化的关键变异进行检测，可以辅助筛选出不含单宁的种质材料，并在育种群体中用该标记进行标记辅助选择，选育单宁含量不同的新品种，对于利用Tannin1选育单宁含量不同高粱品种具有重要利用价值。
现有技术相比，本发明提供了一个高粱调控单宁有无基因Tannin1的一种新型功能性等位变异类型，还提供了在育种中有重要利用价值的高通量检测高粱不含单宁的KASP分子标记，可以快速、高效、高通量检测Tannin1基因编码区导致中国高粱单宁有无发生改变的关键SNP变异，广泛应用于检测这个关键SNP在中国高粱种质资源中的分布情况，及高效筛选不含单宁基因的高粱种质资源并应用于高粱分子标记辅助选择育种，对利用Tannin1提高高粱单宁育种效率，具有重要利用价值。
本发明所采用的技术方案是：
本发明提供了高粱控制单宁有无基因Tannin1的一种新型功能性等位变异，这种新型变异是位于Tannin1基因编码区的659碱基处12bp的缺失，将这个位点命名为tan1-d。
研究中意外发现，在含有单宁的品种（九叶）中的基因型是TCGTCTACGAGA，不含单宁的品种（干刷糙）基因型是12bp（TCGTCTACGAGA）的缺失。
本发明提供了高粱单宁有无基因Tannin1的一种新型变异tan1-d的SNP分子标记用于诊断功能性等位变异，其特征在于，分子标记包含2个KASP正向引物和一个共同的反向引物。tan1-d-KASP正向引物为tan1-d-KASP-FAM和tan1-d-KASP-HEX；反向引物为tan1-d-KASP-R；分子标记检测位点处的基因型分别为T和G；引物序列分别如SEQ ID NO.3-5所示。
本发明提供了高粱单宁有无基因Tannin1的一种新型变异tan1-d的最优单体型，其特征分别在于单体型为12 bp (CGACATACGT)缺失。本发明提供了高粱单宁有无基因Tannin1的一种新型变异检测方法，用于检测单宁有无基因Tannin1编码区内单宁丧失变异，包括如下步骤：
（1）提取待测高粱样品的DNA；
（2）取浓度为20-40ng/μl的模板DNA 3μl， SEQ ID NO.3-5所示的混合引物0.0825μl，2×Master Mix 3μl，分别进行PCR扩增；
（3）采用荧光检测仪检测PCR扩增产物的荧光信号，进行基因分型。
优选的，步骤（2）中，PCR扩增的条件为：
1）94℃预变性5min；
2）94℃变性20s；
3）60℃退火30s，步骤2）-3）循环10次，每个循环退火温度降低0.5℃；
4）94℃变性20s；
5）55℃退火30s，步骤4）-5）循环40次；
6）4℃保存。
本发明还提供了所述的新型变异、分子标记、最优单体型或检测方法在高粱单宁育种中的应用。
本发明提供的高粱Tannin1基因的一种新型变异是导致中国高粱单宁有无发生改变的关键SNP变异，挖掘该变异位点的引物序列如下：
Tan1_1 F:
5'CACCAAGCTCCAGTTCAACC 3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
Tan1_1 R:
5'CAATGTGCACGATCGTCTTT 3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
在获得引物之后，发明人进一步提供了具体的检测方法如下：
1.利用CTAB法提取高粱基因组DNA；
2.利用上述设计合成的引物和提取的基因组DNA在PCR仪（T100TMThermal Cycler）进行PCR扩增，并进行测序；
3.利用DNAMAN对序列进行比对以及ClustalX2进行氨基酸多态性分析。
具体方法如下：
利用CTAB法提取待检测的高粱基因组DNA：
（a）取高粱幼嫩叶片置于2ml离心管中，利用液氮冷冻并于组织粉碎器上磨成粉末；（b）加800ul CTAB提取液于2ml离心管中，置于65℃水浴60min，期间轻晃5-8次使得DNA充分裂解；（c）加入800ul 氯仿异戊醇（体积比24:1）轻晃10min；（d）3000g条件下离心10min中后取500ul上清液置于洁净的96孔深孔板中（注意对应序号）；（e）加500ul异丙醇（提前-20℃冷冻）及50ul 3M醋酸钠（pH=5.2）轻晃摇匀，即可看到白色DNA絮状物产生，置于-20℃20min增加DNA产量。（f）3000g离心10min后倒掉上清液，将沉淀用70％乙醇（提前放入-20℃冰箱冷冻）清洗2-3次后风干至无酒精味；（g）加入300ul ddH2O溶解DNA，置于-20℃冰箱保存备用；
PCR扩增体系和程序如下:
20ulPCR体系配制
依表1配制体系，模板DNA2ul，2×Taq Mix10ul，上游引物1ul，下游引物1ul，ddH2O6ul。
表1 PCR体系表
| 药品 | 体积 |
| 模板DNA | 2uL |
| 2×Taq Mix | 10uL |
| Primer F | 1uL |
| Primer R | 1uL |
| ddH<sub>2</sub>O | 6uL |
PCR程序如下：
1）95℃预变性5min；
2）95℃变性30s；
3）55℃退火30s；
4）72℃延伸1min，步骤2-4循环35次；
5）72℃彻底延伸10min；
6）12℃保存
Tannin1成功扩增后，进行测序。
利用DNAMAN软件对测序结果进行序列比对，利用ClustalX2软件进行氨基酸多态性分析。
本发明提供的高粱单宁KASP分子标记，可快速、高效、高通量检测Tannin1基因编码区导致中国高粱单宁有无发生改变的关键SNP变异，该标记为KASP高通量SNP标记，包括2条正向引物，1条反向引物；
标记tan1-d-KASP的引物序列如下：
tan1-d-KASP-FAM T-Tan1:
5' GGACAAGGAACACTCCACCAT3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
tan1-d-KASP-HEX G-tan1-d:
5' GGACAAGGAACACTCCACCAG 3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
tan1-d-KASP-R:
5' GCACGTATGTCGAGCACGA 3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在获得引物之后，发明人进一步提供了具体的检测方法如下：
1.利用上述设计合成的标记和上步提取的基因组DNA在Q-Cycler 96 PCR仪（HainLifescience UK 1td. UK）进行PCR扩增，并在LGC SNPline荧光信号检测系统上进行SNP检测；
判定的标准以点的颜色和聚集在横轴或纵轴的位置决定：信号为红色，聚集在纵轴附近且与tan1-d对照聚集在一起，判定为tan1-d基因型；信号为蓝色，与横轴和野生型Tan1对照聚集在一起，判定为Tan1基因型；
2.分析上述得到Tannin1基因关键SNP在高粱中的分布情况。
具体方法如下：
引物稀释与化验引物混合：
将每组中的三条引物用超纯水稀释到100μM后按照体积比
按照体积比正向引物FAM：正向引物HEX：反向引物：Buffer=6:6:15:23的比例进行混合，混匀后保存至-20℃备用；
所采用的PCR扩增体系和程序如下：
6ul PCR体系配制：
依下表在冰上配制体系，模板DNA 3μL（20ng/ul左右），2×Master mix 3ul（LGCGroup UK），KASP化验引物0.0825ul（北京睿博兴科生物公司合成）
表2 PCR体系配制
| 药品 | 体积 |
| 模板DNA | 3uL（20ng/uL左右） |
| 2×Master Mix | 3uL |
| KASP化验引物 | 0.0825uL |
| 总和 | 6.0825uL |
PCR程序如下：
1）94℃预变性15min；
2）94℃变性20s；
3）65℃退火1min（每个循环降低0.8℃），步骤2-3循环10次；
4）94℃变性20s；
5）57℃退火1min，步骤4-5循环40次；
6）10℃保存。
本发明所提供的上述检测标记和检测方法均针对普通高粱种质和品种。
综上所述，本发明的有益效果在于：本发明提供了一个高粱调控单宁有无基因Tannin1的一种新型变异，还提供了一个在育种中有重要利用价值的高通量检测高粱不含单宁的分子标记，可以快速、高效、高通量检测Tannin1基因编码区导致中国高粱单宁有无发生改变的关键SNP变异，可用于检测关键功能性等位变异在中国高粱种质资源中的分布情况，可高效筛选不含单宁的高粱种质资源并应用于高粱单宁含量不同分子标记辅助选择育种，对利用Tannin1提高高粱单宁育种效率，具有重要利用价值。
附图说明
图1是高粱籽粒单宁有无表型鉴定图。
图2是 tan1-a-KASP(A),tan1-b-KASP(B),tan1-c-KASP(C), SNP检测结果图,其中靠近纵轴的圆点分别代表A(A),G(B),T(C)（不含单宁）基因型,靠近横轴的圆点代G(A),C(B),A(C)（含有单宁）基因型;●是所设ddH2O空白对照。
图3A是Tannin1基因的结构及编码区的变异位点tan1-d（T/G）；图3B为tan1-d氨基酸多态性分析。
图4是tan1-d-KASP的SNP检测结果图。其中靠近纵轴的圆点分别代表G(D)（不含单宁）基因型,靠近横轴的圆点代T(D)（含有单宁）基因型;●是所设ddH2O空白对照。
具体实施方式
实施例1 不同来源高粱品种籽粒单宁有无的鉴定
NO.1.1 实验材料
籽粒单宁有无鉴定采用的实验材料包括193份的高粱品种（表3）。
表3 193份的高粱品种及其表型和基因型
注：表型中N表示没有单宁，Y表示有单宁。
NO.1.2 单宁有无鉴定
对以上材料的种子进行单宁有无鉴定。将15gKOH溶于20ml漂白剂及20ml水中，制成漂白溶液。将10粒高粱种子放入1.5ml离心管中，加入1ml的漂白溶液保持3min，期间轻微晃动三次，后将种子置于过滤网中，用流水去除种子表面的漂白溶液，于培养皿中静置晾干水分。观察种子颜色变化确定单宁有无，含有单宁的种子呈现黑红色，不含单宁的种子颜色不变。
NO.1.3 结果分析
通过Bleach test 对来自中国和非洲的193份高粱品种进行单宁有无鉴定，44个品种含有单宁，149份不含单宁（图1.）。
实施例2 不含单宁品种Tannin1基因内变异类型鉴定（揭示有几个品种不含现有的变异类型）
NO.2.1 实验材料
所用材料为193 份来自中国和非洲的高粱品种。
1）DNA提取叶片的收集
取高粱苗期幼嫩叶片，按编号放入对应的2ml离心管中，并放在冰盒上低温保存，防止DNA降解。
2）利用CTAB法提取高粱基因组DNA；置于-20℃保存备用：
上述步骤具体如下：
（a）取高粱幼嫩叶片置于2ml离心管中，利用液氮冷冻并于组织粉碎器上磨成粉末；（b）加800ul CTAB提取液于2ml离心管中，置于65℃水浴60min，期间轻晃5-8次使得DNA充分裂解；（c）加入800ul 氯仿异戊醇（体积比24:1）轻晃10min；（d）3000g条件下离心10min中后取500ul上清液置于洁净的96孔深孔板中（注意对应序号）；（e）加500ul异丙醇（提前-20℃冷冻）及50ul 3M醋酸钠（pH=5.2）轻晃摇匀，即可看到白色DNA絮状物产生，置于-20℃20min增加DNA产量。（f）3000g离心10min后倒掉上清液，将沉淀用70％乙醇（提前放入-20℃冰箱冷冻）清洗2-3次后风干至无酒精味；（g）加入300ul ddH2O溶解DNA，置于-20℃冰箱保存备用；
NO.2.2 引物稀释与化验引物混合
现有研究发现野生型高粱均能合成单宁，而在Tannin1基因中发现的三种功能性等位变异：tan1-a、tan1-b以及tan1-c，可使其功能丧失，导致单宁缺失的表型。我们针对上述Tannin1基因的3个变异位点tan1-a（G -/ G/T）、tan1-b（insert:GCAGCGGCGG）以及tan1- c(A/T/G-/C/T)开发了KASP标记：KASP-tan1-a、KASP-tan1-b及KASP-tan1-c。
该标记为KASP高通量SNP标记，包括2条正向引物，1条反向引物；
标记tan1-a-KASP的引物序列如下：
tan1-a-KASP-FAM G-Tan1:
5' TCCACGACATCGCCTGGGGGG 3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
tan1-a-KASP-HEX A-tan1-a:
5' TCCACGACATCGCCTGGGGGA 3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
tan1-a-KASP-R:
5' GCTCTCGTAGACGATGGTGGA 3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
标记tan1-b-KASP的引物序列如下：
tan1-b-KASP-FAM C-Tan1:
5' CTGCCCGAGACGGCGGCGGC 3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
tan1-b-KASP-HEX G-tan1-b:
5' CTGCCCGAGACGGCGGCGGG 3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
tan1-b-KASP-R:
5' CCTTGTTCTCAAAGGCGATG 3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
标记tan1-c-KASP的引物序列如下：
tan1-c-KASP-FAM A-Tan1:
5' GAACAAGGTCCAGCTTCTTA 3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
tan1-c-KASP-HEX T-tan1-c:
5' GAACAAGGTCCAGCTTCTTT 3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；
tan1-c-KASP-R:
5' CAATGTGCACGATCGTCTTT 3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
将以上三个变异位点的KASP标记引物按照体积比正向引物FAM：正向引物HEX：反向引物：Buffer=6:6:15:23的比例进行混合，混匀后保存至-20℃备用。
NO.3.3 所采用的PCR扩增体系和程序如下:
6ul PCR体系配制
依表3在冰上配制体系，模板DNA（20ng/ul左右），2×Master mix 3ul（LGC GroupUK），KASP化验引物0.0825ul（北京睿博兴科生物公司合成）。
表4 PCR体系配制
| 药品 | 体积 |
| 模板DNA | 3uL（20ng/uL左右） |
| 2×Master Mix | 3uL |
| KASP化验引物 | 0.0825uL |
| 总和 | 6.0825uL |
PCR程序如下：
1.94℃预变性15min；
2.94℃变性20s；
3.65℃退火1min（每个循环降低0.8℃），步骤2-3循环10次；
4.94℃变性20s；
5.57℃退火1min，步骤4-5循环40次；
6.10℃保存。
NO.2.3 结果分析
现有研究发现野生型高粱均能合成单宁，而在Tannin1基因中发现的三种功能性等位变异：tan1-a、tan1-b以及tan1-c，可使其功能丧失，导致单宁缺失的表型。
利用ABI Quant StudioTM12K Flex实施荧光定量PCR系统对扩增好的PCR体系进行SNP及Indel分型结果的收集，如图2所示，纵轴为tan1-a基因型，横轴为Tan1及其他基因型，在193份高粱品种中，24个品种含有tan1-a基因型，57个品种含有tan1-b基因型和29 个品种含有tan1-c基因型。另外39份品种具有野生型含有单宁的基因型，但不含单宁。● 是所设ddH2O空白对照。
实施例3 不含现有变异类型品种Tannin1基因测序与变异类型鉴定
NO.3.1 实验材料
所用的实验材料为39份籽粒不含单宁但基因型为野生型的高粱品种。
高粱基因组提取参照实施例2。
NO.3.2 Tannin1测序
1）设计用于Tan1扩增的引物（北京睿博兴科生物公司合成）：
Tan1_1 F:CACCAAGCTCCAGTTCAACC SEQ ID NO.1所示
Tan1_1 R:CAATGTGCACGATCGTCTTT SEQ ID NO.2所示
2）PCR扩增体系和程序如下
20ulPCR体系配制
依表5配制体系，模板DNA2ul，2×Taq Mix10ul，上游引物1ul，下游引物1ul，ddH2O6ul。
表5 PCR体系配制
| 药品 | 体积 |
| 模板DNA | 2uL |
| 2×Taq Mix | 10uL |
| Primer F | 1uL |
| Primer R | 1uL |
| ddH<sub>2</sub>O | 6uL |
PCR程序如下：
① 95℃预变性5min；
② 95℃变性30s；
③ 55℃退火30s；
④ 72℃延伸1min，步骤2-4循环34次；
⑤ 72℃彻底延伸10min；
⑥ 12℃保存
3）Tannin1成功扩增后，进行测序（北京睿博兴科生物公司）。
4）利用DNA MAN软件对测序结果进行序列比对，比对结果如图3所示。
NO.3.3 Tannin1基因克隆与测序、变异挖掘
利用克隆Tannin1基因的两对特异引物对DNA序列进行扩增、测序、拼接，获得基因的DNA序列。通过不含单宁高粱品种与含有单宁高粱品种中Tannin1基因序列比对，找到Tannin1中可能引起单宁丧失的功能性等位变异位点。
NO.3.4 Tannin1基因内的关键变异
经克隆、测序，从不同品种中获得了Tannin1基因的DNA序列，共918bp。通过序列比对发现，品种“干刷糙”在编码区+659位点（220aa）处发现一个12bp(TCGTCTACGAGA)的缺失，导致编码区缩短，在第3个与第4个WD40结构域之间缺少了4个氨基酸。两缺失是该基因内另外一个调控单宁丧失的关键变异。将这个位点命名为tan1-d （图3）。Tannin1野生型的核苷 酸序列见SEQ ID NO.15，Tannin1野生型的氨基酸序列见SEQ ID NO.16；tan1-d 的核苷酸 序列见SEQ ID NO.17，tan1-d 的氨基酸序列见SEQ ID NO.18.
实施例4 tan1-d位点的KASP标记开发
NO.4.1 实验材料
所用的实验材料包括10份高粱品种，其中4份含有单宁；6份包含小白粘和干刷糙等不含单宁的品种。
NO.4.2 tan1-d-KASP分子标记的开发
将tan1-d位点进一步转化为KASP标记，首先在鲁7715、2738、132-2、干刷糙、小白粘、鲁6141、九叶、一壳二粒、二马尾、七叶子等已知该位点基因型的品种中进行基因分型，验证该标记的准确性（图4）。
以上所述仅是本专利的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本专利的保护范围。
序列表
<110> 山东农业大学
<120> 一种高粱籽粒单宁新基因tan1-d及高通量检测标记
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caccaagctc cagttcaacc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caatgtgcac gatcgtcttt 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggacaaggaa cactccacca t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggacaaggaa cactccacca g 21
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcacgtatgt cgagcacga 19
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tccacgacat cgcctggggg g 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tccacgacat cgcctggggg a 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gctctcgtag acgatggtgg a 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctgcccgaga cggcggcggc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctgcccgaga cggcggcggg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccttgttctc aaaggcgatg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaacaaggtc cagcttctta 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gaacaaggtc cagcttcttt 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caatgtgcac gatcgtcttt 20
<210> 15
<211> 1062
<212> DNA
<213> 高粱序列(Sorghum bicolor)
<400> 15
atggacctac ccaagccgcc gtcgacggcc gcctcgtcgt cgggggcgga gacgccgaac 60
ccgcacgcct tcacctgcga gctcccgcac tcgatctacg cgctcgcctt ctcccccggc 120
gcgcccgtcc tcgcctccgg cagcttcctc gaggacctcc acaaccgcgt ctccctgctc 180
tccttcgacc ccgtccgccc ctccgccgcc tccttccgcg ccctcccggc gctctccttc 240
gaccacccct acccacccac caagctccag ttcaacccgc gcgccgccgc gccgtccctc 300
ctcgcctcct ccgccgacac gctccgcatc tggcacgccc cgctcgacga cctctccgcc 360
accgcctccg cgcccgagct ccgctccgtt ctcgacaacc gcaaggccgc ctccgagttc 420
tgcgcgcccc tcacctcctt cgattggaac gaggtcgagc cccgccgtat cgggaccgcc 480
tccatcgaca ccacctgcac cgtctgggac atcgatctcg gcgtcgtgga gacgcagctc 540
atcgcgcacg acaaggccgt ccacgacatc gcctgggggg aggccggggt cttcgcctcc 600
gtgtcggccg acggctccgt ccgcgtcttc gacctccggg acaaggaaca ctccaccatc 660
gtctacgaga gcccccgccc cgacacgccg ctcctcaggc tggcgtggaa ccgctctgac 720
ctccgctata tggccgcgct gctcatggac agcagcgccg tcgtcgtgct cgacatacgt 780
gcgcccgggg tgccggtggc cgagctgcac cggcaccggg cgtgcgccaa cgcagtcgcg 840
tgggcgccgc aggccactag gcacctctgc tcggctgggg acgacgggca ggcactgatc 900
tgggaactgc ccgagacggc ggcggctgtg cccgccgagg ggattgatcc tgtgctagtg 960
tacgacgcag gtgccgaaat aaaccaactt cagtgggcgg ccgcccaccc ggactggatg 1020
gccatcgcct ttgagaacaa ggtccagctt cttagggtct ga 1062
<210> 16
<211> 353
<212> PRT
<213> 高粱序列(Sorghum bicolor)
<400> 16
Met Asp Leu Pro Lys Pro Pro Ser Thr Ala Ala Ser Ser Ser Gly Ala
1 5 10 15
Glu Thr Pro Asn Pro His Ala Phe Thr Cys Glu Leu Pro His Ser Ile
20 25 30
Tyr Ala Leu Ala Phe Ser Pro Gly Ala Pro Val Leu Ala Ser Gly Ser
35 40 45
Phe Leu Glu Asp Leu His Asn Arg Val Ser Leu Leu Ser Phe Asp Pro
50 55 60
Val Arg Pro Ser Ala Ala Ser Phe Arg Ala Leu Pro Ala Leu Ser Phe
65 70 75 80
Asp His Pro Tyr Pro Pro Thr Lys Leu Gln Phe Asn Pro Arg Ala Ala
85 90 95
Ala Pro Ser Leu Leu Ala Ser Ser Ala Asp Thr Leu Arg Ile Trp His
100 105 110
Ala Pro Leu Asp Asp Leu Ser Ala Thr Ala Ser Ala Pro Glu Leu Arg
115 120 125
Ser Val Leu Asp Asn Arg Lys Ala Ala Ser Glu Phe Cys Ala Pro Leu
130 135 140
Thr Ser Phe Asp Trp Asn Glu Val Glu Pro Arg Arg Ile Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ser Ile Asp Thr Thr Cys Thr Val Trp Asp Ile Asp Leu Gly Val Val
165 170 175
Glu Thr Gln Leu Ile Ala His Asp Lys Ala Val His Asp Ile Ala Trp
180 185 190
Gly Glu Ala Gly Val Phe Ala Ser Val Ser Ala Asp Gly Ser Val Arg
195 200 205
Val Phe Asp Leu Arg Asp Lys Glu His Ser Thr Ile Val Tyr Glu Ser
210 215 220
Pro Arg Pro Asp Thr Pro Leu Leu Arg Leu Ala Trp Asn Arg Ser Asp
225 230 235 240
Leu Arg Tyr Met Ala Ala Leu Leu Met Asp Ser Ser Ala Val Val Val
245 250 255
Leu Asp Ile Arg Ala Pro Gly Val Pro Val Ala Glu Leu His Arg His
260 265 270
Arg Ala Cys Ala Asn Ala Val Ala Trp Ala Pro Gln Ala Thr Arg His
275 280 285
Leu Cys Ser Ala Gly Asp Asp Gly Gln Ala Leu Ile Trp Glu Leu Pro
290 295 300
Glu Thr Ala Ala Ala Val Pro Ala Glu Gly Ile Asp Pro Val Leu Val
305 310 315 320
Tyr Asp Ala Gly Ala Glu Ile Asn Gln Leu Gln Trp Ala Ala Ala His
325 330 335
Pro Asp Trp Met Ala Ile Ala Phe Glu Asn Lys Val Gln Leu Leu Arg
340 345 350
Val
<210> 17
<211> 1050
<212> DNA
<213> 高粱序列(Sorghum bicolor)
<400> 17
atggacctac ccaagccgcc gtcgacggcc gcctcgtcgt cgggggcgga gacgccgaac 60
ccgcacgcct tcacctgcga gctcccgcac tcgatctacg cgctcgcctt ctcccccggc 120
gcgcccgtcc tcgcctccgg cagcttcctc gaggacctcc acaaccgcgt ctccctgctc 180
tccttcgacc ccgtccgccc ctccgccgcc tccttccgcg ccctcccggc gctctccttc 240
gaccacccct acccacccac caagctccag ttcaacccgc gcgccgccgc gccgtccctc 300
ctcgcctcct ccgccgacac gctccgcatc tggcacgccc cgctcgacga cctctccgcc 360
accgcctccg cgcccgagct ccgctccgtt ctcgacaacc gcaaggccgc ctccgagttc 420
tgcgcgcccc tcacctcctt cgattggaac gaggtcgagc cccgccgtat cgggaccgcc 480
tccatcgaca ccacctgcac cgtctgggac atcgatctcg gcgtcgtgga gacgcagctc 540
atcgcgcacg acaaggccgt ccacgacatc gcctgggggg aggccggggt cttcgcctcc 600
gtgtcggccg acggctccgt ccgcgtcttc gacctccggg acaaggaaca ctccaccagc 660
ccccgccccg acacgccgct cctcaggctg gcgtggaacc gctctgacct ccgctatatg 720
gccgcgctgc tcatggacag cagcgccgtc gtcgtgctcg acatacgtgc gcccggggtg 780
ccggtggccg agctgcaccg gcaccgggcg tgcgccaacg cagtcgcgtg ggcgccgcag 840
gccactaggc acctctgctc ggctggggac gacgggcagg cactgatctg ggaactgccc 900
gagacggcgg cggctgtgcc cgccgagggg attgatcctg tgctagtgta cgacgcaggt 960
gccgaaataa accaacttca gtgggcggcc gcccacccgg actggatggc catcgccttt 1020
gagaacaagg tccagcttct tagggtctga 1050
<210> 18
<211> 349
<212> PRT
<213> 高粱序列(Sorghum bicolor)
<400> 18
Met Asp Leu Pro Lys Pro Pro Ser Thr Ala Ala Ser Ser Ser Gly Ala
1 5 10 15
Glu Thr Pro Asn Pro His Ala Phe Thr Cys Glu Leu Pro His Ser Ile
20 25 30
Tyr Ala Leu Ala Phe Ser Pro Gly Ala Pro Val Leu Ala Ser Gly Ser
35 40 45
Phe Leu Glu Asp Leu His Asn Arg Val Ser Leu Leu Ser Phe Asp Pro
50 55 60
Val Arg Pro Ser Ala Ala Ser Phe Arg Ala Leu Pro Ala Leu Ser Phe
65 70 75 80
Asp His Pro Tyr Pro Pro Thr Lys Leu Gln Phe Asn Pro Arg Ala Ala
85 90 95
Ala Pro Ser Leu Leu Ala Ser Ser Ala Asp Thr Leu Arg Ile Trp His
100 105 110
Ala Pro Leu Asp Asp Leu Ser Ala Thr Ala Ser Ala Pro Glu Leu Arg
115 120 125
Ser Val Leu Asp Asn Arg Lys Ala Ala Ser Glu Phe Cys Ala Pro Leu
130 135 140
Thr Ser Phe Asp Trp Asn Glu Val Glu Pro Arg Arg Ile Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ser Ile Asp Thr Thr Cys Thr Val Trp Asp Ile Asp Leu Gly Val Val
165 170 175
Glu Thr Gln Leu Ile Ala His Asp Lys Ala Val His Asp Ile Ala Trp
180 185 190
Gly Glu Ala Gly Val Phe Ala Ser Val Ser Ala Asp Gly Ser Val Arg
195 200 205
Val Phe Asp Leu Arg Asp Lys Glu His Ser Thr Ser Pro Arg Pro Asp
210 215 220
Thr Pro Leu Leu Arg Leu Ala Trp Asn Arg Ser Asp Leu Arg Tyr Met
225 230 235 240
Ala Ala Leu Leu Met Asp Ser Ser Ala Val Val Val Leu Asp Ile Arg
245 250 255
Ala Pro Gly Val Pro Val Ala Glu Leu His Arg His Arg Ala Cys Ala
260 265 270
Asn Ala Val Ala Trp Ala Pro Gln Ala Thr Arg His Leu Cys Ser Ala
275 280 285
Gly Asp Asp Gly Gln Ala Leu Ile Trp Glu Leu Pro Glu Thr Ala Ala
290 295 300
Ala Val Pro Ala Glu Gly Ile Asp Pro Val Leu Val Tyr Asp Ala Gly
305 310 315 320
Ala Glu Ile Asn Gln Leu Gln Trp Ala Ala Ala His Pro Asp Trp Met
325 330 335
Ala Ile Ala Phe Glu Asn Lys Val Gln Leu Leu Arg Val
340 345
Claims (3)
1.一种高粱籽粒单宁基因tan1-d，其特征在于：位于高粱第4号染色体上的基因Tannin1编码区+659核苷酸位点，即220aa处发现一个12bp的缺失，所述12bp的缺失是缺少TCGTCTACGAGA，而含有单宁的野生型品种含有上述12个碱基；所述12bp的缺失导致Tannin1基因编码的蛋白第3个与第4个WD40结构域之间少了4个氨基酸，从而造成Tannin1基因功能的丧失，高粱籽粒没有单宁；
所述tan1-d的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
2.根据权利要求1所述基因在检测高粱籽粒中有无单宁控制基因Tannin1编码区内单宁丧失变异的应用，其特征在于：利用分子标记和提取的基因组DNA进行PCR扩增，并在LGCSNPline荧光信号检测系统上进行SNP检测；判定的标准以点的颜色和聚集在横轴或纵轴的位置决定：信号为红色，聚集在纵轴附近且与tan1-d对照聚集在一起，判定为tan1-d基因型；信号为蓝色，与横轴和野生型Tan1对照聚集在一起，判定为Tan1基因型；
所述扩增分子标记的引物包含2个KASP正向引物和一个共同的反向引物，所述正向引物为tan1-d-KASP-FAM和tan1-d-KASP-HEX；反向引物为tan1-d-KASP-R，引物序列分别如SEQ ID NO.3-5所示；所述分子标记检测位点处的基因型分别为T和G。
3.根据权利要求1所述基因在高粱单宁育种中的应用。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110331651.9A CN112795577B (zh) | 2021-03-29 | 2021-03-29 | 一种高粱籽粒单宁新基因tan1-d及高通量检测标记 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202110331651.9A CN112795577B (zh) | 2021-03-29 | 2021-03-29 | 一种高粱籽粒单宁新基因tan1-d及高通量检测标记 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family
ID=75815903
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110331651.9A Active CN112795577B (zh) | 2021-03-29 | 2021-03-29 | 一种高粱籽粒单宁新基因tan1-d及高通量检测标记 |
Country Status (1)
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| CN (1) | CN112795577B (zh) |
Families Citing this family (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN113265407A (zh) * | 2021-05-26 | 2021-08-17 | 广西壮族自治区农业科学院 | 水稻花青素生物合成调控基因OsTTG1及其应用 |
| CN114752699B (zh) * | 2022-04-22 | 2023-07-28 | 山东农业大学 | 一种高粱籽粒单宁基因Tannin2内的等位变异体tan2-d及其分子标记和应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN112535179B (zh) * | 2019-09-20 | 2021-11-09 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | Tannin1基因及其参与合成的次级代谢产物在抗雀科鸟类危害上的应用 |
| CN111607660B (zh) * | 2020-06-28 | 2023-12-08 | 辽宁省农业科学院 | 一种鉴别高粱单宁Tan1等位变异基因的分子标记的引物及鉴别方法和应用 |
-
2021
- 2021-03-29 CN CN202110331651.9A patent/CN112795577B/zh active Active
Also Published As
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