CN113151345B

CN113151345B - 创制水稻低糊化温度新种质的方法及其应用

Info

Publication number: CN113151345B
Application number: CN202010059233.4A
Authority: CN
Inventors: 王维鹏; 王文舒; 丁琦; 谭超; 陈雅; 徐念; 潘燕林; 成雄峰; 柯贞进; 马崇烈
Original assignee: China National Seed Group Co Ltd
Current assignee: China National Seed Group Co Ltd
Priority date: 2020-01-19
Filing date: 2020-01-19
Publication date: 2022-10-11
Anticipated expiration: 2040-01-19
Also published as: CN113151345A

Abstract

本申请公开了创制水稻低糊化温度新种质的方法，其包括修饰水稻中的ALK基因，使其第八外显子发生缺失或插入突变。本申请还公开了通过所述方法创制的水稻用于育种或改良种质资源的用途，能够靶向水稻ALK基因的sgRNA，以及能够靶向水稻ALK基因的CRISPR/Cas9编辑载体。本申请为水稻精米糊化温度新种质的创制及培育高米质水稻的育种实践提供一种行之有效的操作方式。

Description

创制水稻低糊化温度新种质的方法及其应用

技术领域

本申请涉及基因编辑技术领域，尤其涉及一种以CRISPR/Cas9基因编辑技术创制ALK基因突变体来提高水稻淀粉碱消值、降低水稻淀粉糊化温度的方法。

背景技术

水稻作为我国乃至全球最重要的粮食作物之一，其产量不断提高。随着人们生活水平的日益提高，市场对大米的要求逐渐转向优质化和专业化。大米的蒸煮食味品质是优质化的主要评价指标。米粉糊经过加热，淀粉粒开始迅速吸水膨胀，大多数淀粉粒丧失其特有的偏振十字图形，变得更透明，黏滞性上升，有更多的可溶性物质进入水中, 此现象称为糊化(Gelatinization)，此时的温度称为糊化温度 (Gelatinization temperature，GT)。糊化后的淀粉，在黏度、强度、韧性等方面更加适口，因此GT是影响大米蒸煮和食用品质的一个重要参数。GT依品种而异，糯稻低，籼稻高，一般分为低(55～69.5℃), 中(70～74℃)和高(74.5～79℃)三等。

在审定中，由于大米的蒸煮食味品质难以量化，一般通过相应的理化指标来评价大米的蒸煮食味品质。目前，本行业公认的5种稻米理化性状指标为：直链淀粉含量、胶稠度、蛋白质、碱消值(alkali spreading value，ASV)和粒型。其中，碱消值是衡量糊化温度的指标，也是国家评价优质食用稻的关键性指标。通常，碱消值与GT呈反向相关，碱消值越高GT越低。在农业部新标准NY/T 593-2013食用稻品质定级指标中，籼稻的一级二级米都要求碱消值大于6。由于碱消值无法在大田中进行筛选，利用常规育种手段改良碱消值耗时长、成本高且效率低。利用生物技术快速改良碱消值对于水稻育种优质化的目标有重大意义，也具有很大的商业前景。

发明内容

为解决上述技术问题，本申请提出一种改变水稻碱消值或糊化温度的新思路，同时提供一种简便有力的实施方案，即利用CAS9基因编辑技术对水稻ALK基因的第八外显子进行定点编辑，快速地获得不同突变类型的ALK突变体，并从中筛选出碱消值升高的突变体材料，创制消费市场上更受亲睐的新种质。为实现上述目的，本申请采用如下技术方案。

在第一方面，本申请提供了创制水稻低糊化温度新种质的方法，其包括修饰水稻中的ALK基因，使其第八外显子发生缺失或插入突变。

在优选的实施方案中，所述修饰使ALK基因的第八外显子的单核苷酸多态性位点发生缺失或插入突变。

在一些实施方案中，所述修饰通过基因编辑进行。

在一些实施方案中，所述ALK基因包含以下序列或由以下序列组成： SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性并编码相同功能的蛋白质的活性变体序列，或者编码 SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列的核苷酸序列。

在优选的实施方案中，所述水稻为籼稻或粳稻。

在一些实施方案中，所述基因编辑通过选自以下的序列特异性核酸酶中的一种或多种进行：CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、CRISPR/Cas12a、 TALEN、大范围核酸酶和ZFN。优选地，所述基因编辑通过CRISPR/Cas9 进行。

在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas9包含Cas9，其中所述Cas9 包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性并编码相同功能的蛋白质的活性变体序列。

在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas9包含导向RNA(sgRNA)，其中所述sgRNA靶向ALK基因的第八外显子。

在一些具体的实施方案中，所述sgRNA靶向SEQ ID NO:3或4所示的核苷酸序列。

在一些具体的实施方案中，所述sgRNA包含SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列。

在一些具体的实施方案中，所述修饰导致所述ALK基因仍表达功能正常的蛋白质。

在第二方面，本申请提供了通过第一方面所述的方法创制的水稻用于育种的用途。

在第三方面，本申请提供了通过第一方面所述的方法创制的水稻用于改良种质资源的用途。

在第四方面，本申请提供了通过第一方面所述的方法获得的水稻的种子制成的制品，其选自食品、饮品、饲料或工业原料。

在第五方面，本申请提供了能够靶向水稻ALK基因的sgRNA，其包含SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列或由SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列组成。

在第六方面，本申请提供了能够靶向水稻ALK基因的CRISPR/Cas9 编辑载体，其包含表达Cas9的第一表达盒和表达sgRNA的第二表达盒，其中所述Cas9包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列或与其具有至少 90％、95％、99％或更高的序列同一性并编码相同功能的蛋白质的活性变体序列，并且所述sgRNA包含SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列。

在第七方面，本申请提供了创制水稻低糊化温度新种质的方法，其包括将第六方面所述的CRISPR/Cas9编辑载体导入含有ALK基因的水稻中。

在优选的实施方案中，所述水稻为籼稻或粳稻。

本申请提出了一种使水稻精米碱消值升高、糊化温度降低的探索性思路，以期为水稻稻米品质育种提供有益探索。同时借助基因编辑技术的运用，通过定向编辑功能基因ALK来快速获得具有不同alk突变体的水稻种质，该方法系统简单易行、高效低耗。本申请利用基因组编辑技术成功地获得了能适当提高精米碱消值的籼稻和粳稻品种，为水稻精米糊化温度新种质的创制及培育高米质水稻的育种实践提供一种行之有效的操作方式。

附图说明

图1显示了本申请实施例1中构建的编辑载体pZZT000603的图谱。

图2显示了本申请实施例1中构建的编辑载体pZZT000603的图谱。

图3显示了ALK基因的结构示意图、编辑靶序列设计以及编辑株系ALK基因的DNA序列。其中，黑色框表示编码区外显子；间断线表示内含子；灰色框表示上下游非编码区；SNP为单核苷酸多态性位点；WT表示野生型水稻X32；alk1-027、alk2-031为编辑株系；PAM 所对应的带下划线的三个碱基表示PAM序列；SNP1和SNP2所对应的带下划线的碱基表示SNP在靶标中的位置；黑色三角形所对应的碱基T表示插入的碱基。

图4显示了野生型ALK基因和编辑株系突变基因alk翻译的氨基酸序列。WT表示野生型水稻X32；alk1-027、alk2-031为编辑株系。

图5显示了野生型水稻X32和ALK基因编辑水稻精米碱消值和米质检测。每一横排为同一株系精米；最左侧一列使用灭菌去离子水处理；中间三列使用1.7％氢氧化钾溶液处理；最右侧一列为米质对比，刻度线为5mm。

详细描述

提供以下定义和方法以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，本申请的术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。

定义

本文使用的术语“基因编辑(gene editing)”或“基因组编辑(genome edting)”，是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术。基因编辑指能够对目标基因进行定点“编辑”，实现对特定DNA片段的修饰。基因编辑依赖于经过基因工程改造的核酸酶，也称“分子剪刀”，在基因组中特定位置产生位点特异性双链断裂 (DSB)，诱导生物体通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR) 来修复DSB，因为这个修复过程容易出错，从而导致靶向突变。

本文使用的术语“CRISPR/Cas9”是指使用RNA引导链靶向内切核酸酶切割位点的内切核酸酶。参见，Jinek等人，Science 337:816-821(2013)； Cong等人，Science(2013年1月3日)；和Mali等人，Science(2013 年1月3日)。目前发现的CRISPR/Cas9系统有三种不同类型即I型、II 型和III型，它们存在于大约40％已测序的真细菌和90％已测序的古细菌中。其中II型的组成较为简单，以Cas9蛋白以及向导RNA(gRNA)为核心组成，也是目前研究得最深入的类型。当细菌抵御噬菌体等外源DNA 入侵时，在前导区的调控下，CRISPR被转录为长的RNA前体 (pre-crRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA，最终识别并结合到与其互补的外源DNA序列上发挥剪切作用。CRISPR/Cas9的剪切位点位于crRNA互补序列下游临近的PAM区 (Protospacer Adjacent Motif)的5’-GG-N18-NGG-3’特征区域中的NGG 位点，而这种特征的序列在每128bp的随机DNA序列中就重复出现一次。

本文使用的术语“CRISPR/Cas12a”是一类新型的CRISPR-Cas系统。相较于Cas9蛋白来说，Cas12a蛋白更具准确度，同时也更安全。 CRISPR/Cas9工作时，Cas9蛋白识别PAM序列(RNA编写的遗传密码)，通过gRNA解开部分双螺旋，在这个过程中，Cas9蛋白一旦找到匹配较好的序列时，便会紧密贴合在该段DNA上，而在这个过程中，也许会出现一些错配的现象，但这种结合是不可逆的。而在这一方面，Cas12a就显得机智许多，它在寻找“靶标”时，会对沿途的DNA序列进行单碱基的识别，如若发现有匹配不好的碱基，便会离开重新寻找，在寻找到PAM 序列时，Cas12a蛋白会与PAM序列形成一种半封闭的R-环(R-loop)，当识别到正确的序列时，才会完全结合成封闭的R-环，所以这种结合是可逆的，这也体现出了它更安全的一面。

本文使用的术语“转录激活子样效应器核苷酶”或“TAL效应器核苷酶”或“TALEN”是指一类通过使TAL效应器DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而产生的人工限制内切核酸酶。

本文使用的术语“锌指核酸酶(ZFN)”由一个DNA识别域以及一个DNA剪切域组成。DNA识别域为3～4个ZF串联结构，每个ZF约含30个氨基酸，被1个锌离子所固定，可识别并结合1个特异的三联体碱基，DNA剪切域由非特异性核酸内切酶Fok I羧基端的96个氨基酸残基组成。每个Fok I单体与1个ZFP相连构成1个ZFN，并识别特定的位点，当2个识别位点相距恰当的距离时(6～8bp)，2个单体ZFN相互作用产生酶切功能，形成双链断裂，从而介导DNA定点剪切。

本文使用的术语“大范围核酸酶(meganuclease)”是指能够识别14-40 碱基长度的核酸序列的归巢核酸内切酶。一些大范围核酸酶可以容忍小的归巢位点序列差异，大的识别区域仍然能够保证这些酶的高度特异性，而这反过来又可保持低水平的基因组内非特异性裂解和较低的毒性。大范围核酸酶由自我剪接RNA内含子或自我剪接蛋白内含子序列的移动序列内的开放阅读框架编码。

本文使用的术语“单核苷酸多态性位点(SNP)”主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每300个碱基对中就有1个，估计其总数可达300 万个甚至更多。SNP是一种二态的标记，由单个碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。SNP既可能在基因序列内，也可能在基因以外的非编码序列上。

本文使用的术语“同一性”，在两个或更多个核酸或多肽的情况下，指相同或具有相同核苷酸或氨基酸的指定百分比(即在指定区域内，当在比较窗或指定区域内比较和比对最大一致性时，约60％的同一性，优选 65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或更高的同一性)的两条或更多条序列或亚序列，如利用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法以默认参数或通过手工比对和可视检查(参阅如NCBI网站等)所测量的。

本文使用的术语“糊化温度(gelatinization temperature，GT)”是影响大米蒸煮和食用品质的一个重要参数。本文使用的术语“碱消值 (alkali spreading value，ASV)”是衡量糊化温度的指标，也是国家评价优质食用稻的关键性指标。通常，碱消值与GT呈反向相关，碱消值越高GT越低。在农业部新标准NY/T 593-2013食用稻品质定级指标中，籼稻的一级二级米都要求碱消值大于6。

本文使用的术语“精米”是指精磨后的精白大米，去掉了糠皮和糊粉层。相对于普通大米，“精米”含糠更少，含其他杂质也更少，“精米”的外观亮度更高，制成的米饭更白，口感一般好于普通大米。但是，由于加工精度更高，富含蛋白质、脂肪、维生素和矿物质的米胚和皮层去掉的更多。因此“精米”的营养含量要明显低于普通大米。

具体实施方式

本申请提供了一种改善水稻稻米品质的新思路。并提出了一种以 CRISPR/Cas9基因编辑技术创制ALK基因突变体来提高水稻精米碱消值，降低水稻糊化温度的方法，最终获得低糊化温度水稻品种。除此之外，改良后大米的外观品质也取得了一定程度的提升，例如垩白度降低，能更好地满足市场对高品质水稻的要求。本申请适用于所有含有功能型ALK基因的水稻品种。

为实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

(1)对拟改良水稻品种的ALK基因进行序列分析，确定基因突变类型，选择该基因的第八外显子位置处为靶序列；

(2)构建编辑载体，将拟改良水稻品种的愈伤组织作为遗传转化的受体材料，用农杆菌介导法将编辑载体导入愈伤组织细胞；

(3)检测ALK基因编辑体的基因型，从中选取靶标位点有多碱基缺失或添加突变的基因型进行表型考察，检测精米碱消值，评估糊化温度变化情况和稻米品质。

本申请的创制水稻低糊化温度新种质的方法，具体包括以下步骤：

(1)水稻中ALK基因的检测；

(2)水稻中ALK基因CRISPR/Cas9编辑表达载体的构建；

(3)将粳稻G17、籼稻X32和X48作为遗传转化的受体材料，使用测序方法检测通过筛选的T0代转化株系，检测目的基因编辑情况，获得不同突变类型的alk等位基因，考察纯合突变体的碱消值和稻米品质，最终获得高碱消值、低糊化温度的优质改良品系。

本申请具体涉及如下技术方案。

在一些实施方案中，所述修饰通过基因编辑进行。

在一些实施方案中，所述ALK基因包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或与其具有至少约70％,75％,80％, 85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％, 98％,99％或更高的序列同一性并编码相同功能的蛋白质的活性变体序列，或者编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与其具有至少约70％, 75％,80％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列的核苷酸序列。

本文所用的术语“活性变体序列”指基本上相似的序列。对于核苷酸序列，活性变体序列包括由于遗传密码子简并性而编码相同功能的蛋白质的那些序列。诸如天然存在的等位基因变体可以使用公知的分子生物学技术例如聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术来鉴定。例如，在本申请中，与粳稻G17、籼稻X32和X48的ALK基因具有至少约70％, 75％,80％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％, 96％,97％,98％,99％或更高的同一性并且也编码功能性ALK蛋白的来自其他水稻品种的基因，包括在本申请定义的“活性变体序列”中。同一性的确定是通过本文描述的序列比对程序，所述程序使用默认参数。核苷酸的活性变体序列与该核苷酸序列的差异可以少至1-15个核苷酸、少至1-10个(例如6-10个)，少至5个，少至4,3,2或甚至1个核苷酸。

对于蛋白质序列，术语“活性变体序列”包括衍生自天然蛋白的多肽，所述衍生是通过缺失(所谓的截短)天然蛋白N末端和/或C末端的一个或多个氨基酸或将一个或多个氨基酸添加至所述天然蛋白的N末端和/或C末端；在天然蛋白的一个或多个位点缺失或添加一个或多个氨基酸；或者在天然蛋白的一个或多个位点取代一个或多个氨基酸。因而，就蛋白质而言，术语“活性变体序列”包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天然蛋白生物学活性，例如具有ALK蛋白功能的足够数目的连续氨基酸残基。这样的功能相对天然蛋白可以是不同的或者是改良的，或者可以是不变的，只要保留了ALK蛋白功能。同一性的确定是通过本文描述的序列比对程序，所述程序使用默认参数。蛋白的活性变体序列与该蛋白的差异可以少至1-15个氨基酸残基、少至 1-10个(例如6-10个)，少至5个，少至4,3,2或甚至1个氨基酸残基。

在一些具体的实施方案中，所述水稻为籼稻或粳稻。

在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas9包含Cas9，其中所述Cas9 包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列或与其具有至少约70％,75％, 80％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％, 97％,98％,99％或更高的序列同一性并编码相同功能的蛋白质的活性变体序列。

在具体的实施方案中，所述CRISPR/Cas9系统中，Cas9蛋白的表达可以由Ubiquitin启动子启动，sgRNA可以由U3启动子启动。本申请中的编辑载体靶向ALK基因的第八外显子。所述sgRNA靶向SEQ ID NO:3或4所示的核苷酸序列。

在一些具体的实施方案中，所述sgRNA包含SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列或与其具有至少约70％,75％,80％,85％,86％,87％,88％, 89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列。

在一些实施方案中，所述修饰导致所述ALK基因仍表达功能正常的蛋白质。修饰结果意图为改变ALK基因的第八外显子的部分或全部功能，但仍保留整个ALK蛋白的原有功能。修饰结果改变了ALK的基因结构，但并不影响整个ALK蛋白的原有功能。

在第四方面，本申请提供了通过第一方面的方法获得的水稻的种子制成的制品，其选自食品、饮品、饲料或工业原料。

在第五方面，本申请提供了能够靶向水稻ALK基因的sgRNA，其包含SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列或与其具有至少约70％,75％, 80％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％, 97％,98％,99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列。

在第六方面，本申请提供了能够靶向水稻ALK基因的CRISPR/Cas9 编辑载体，其包含表达Cas9的第一表达盒、表达sgRNA的第二表达盒，其中所述Cas9包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列或与其具有至少约70％,75％,80％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％, 94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高的序列同一性并编码相同功能的蛋白质的活性变体序列，所述sgRNA包含SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列或与其具有至少约70％,75％,80％,85％,86％,87％,88％,89％, 90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列。

在一些实施方案中，所述ALK基因包含以下序列或由以下序列组成： SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或与其具有至少约70％,75％,80％, 85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％, 98％,99％或更高的序列同一性并编码相同功能的蛋白质的活性变体序列，或者编码SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或与其具有至少约70％, 75％,80％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列的核苷酸序列。

在优选的实施方案中，所述水稻为一些其它性状良好，糊化温度尚需改良的品种，例如籼稻或粳稻。在优选的实施方案中，所述水稻为粳稻G17、籼稻X32和X48。

本说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，且并非意图排除其他部分、添加物、组分、或步骤。

应该理解，在本申请的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。

实施例

以下实施例用于说明本申请，但不用来限制本申请的范围。在不背离本申请精神和实质的情况下，对本申请方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

以下实施例中使用的水稻品种为籼稻X32，其由中国种子集团有限公司提供，以下实施例中提到的野生型水稻(WT)均为未经过基因编辑的籼稻X32。

实施例1.CRISPR/Cas9编缉载体的构建

水稻ALK基因的序列分析及基因编辑靶序列设计

水稻ALK基因的序列如SEQ ID NO.1所示。序列分析显示，该基因含有8个外显子，分别为SEQ ID NO.1第256-585(第一外显子)、第715-1387(第二外显子)、1487-1551(第三外显子)、2241-2318(第四外显子)、2401-2511(第五外显子)、2617-2661(第六外显子)、3078-3251(第七外显子)、3719-4675(第八外显子)。

本实施例所设的2个靶序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4 所示，均在水稻中ALK基因的第八外显子上，分别位于SEQ ID NO.1 的第4435-4454处和第4574-4593处。

CRISPR/Cas9编缉载体的构建

本实施例采用的基因编辑技术为第三代基因编辑技术CRISPR/cas9，所使用的载体根据Liu等人(Hao Liu,Yuduan Ding,Yanqing Zhou,Wenqi Jin,Kabin Xie*,Ling-LingChen*.CRISPR-P 2.0:an improved CRISPR/Cas9 tool for genome editing inplants.Mol Plant,2017,10(3): 530-532)的方法设计，利用CRISPR-P2.0 (http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)在线工具设计了针对靶序列1(SEQ ID NO.3)的导向RNA(sgRNA)(SEQ ID NO：5)和针对靶序列2(SEQ ID NO.4)的导向RNA(sgRNA)(SEQ ID NO：6)。sgRNA是由引导 RNA(gRNA)和骨架RNA(gRNA scaffold)核苷酸序列连接起来的一个整体分子。植物表达载体包含甘蔗Ubi4启动子(即甘蔗泛素4启动子)驱动的Cas9(SEQ ID NO：7)表达盒，以及水稻U3启动子驱动的sgRNA 表达盒。构建的针对靶序列1(target 1)和靶序列2(target 2)的两个 CRISPR/Cas9编缉载体命名为pZZT000603和pZZT000604，其图谱参见图1和2。

实施例2.水稻的遗传转化

将实施例1构建的两种编辑载体分别转入农杆菌菌株EHA105(华中农业大学馈赠)中并进行测序鉴定。由籼稻X32诱导产生胚性愈伤组织，与分别含有上述编缉载体的农杆菌EHA105共同孵育，经过筛选再生等一系列步骤完成遗传转化。农杆菌侵染水稻愈伤组织及筛选、分化流程参照Nishimura等的文献报道(A protocol for Agrobacterium-mediatedtransformation in rice.Nature protocols,2006,6:2 796-2 802)。具体流程包括，水稻愈伤组织与农杆菌共培养3天后，将愈伤组织于250mg/L Carbenicillin的ddH₂O中浸泡30min，去除多余的农杆菌后置于含250 mg/L Carbenicillin的筛选培养基上筛选3轮，然后将抗性愈伤转移至再生培养基上培养，待分化出2～3cm的小苗后，将其转移至生根培养基中继续培养2周。

通过上述方法得到的针对ALK基因靶序列1和靶序列2编辑的 T0代水稻株系分别为179和239株。

实施例3.T0代ALK基因编辑水稻的筛选和鉴定

将实施例2中的再生植株送至温室种植，取再生的T0代小苗叶片，采用天根生化技术公司的DNA提取试剂盒提取植物基因组DNA作为模板。DNA样品用荧光定量PCR方法进行阳性检测。荧光定量PCR方法选择筛选标记基因CP4作为目标基因和水稻ACTIN1基因作为内参基因，于荧光定量PCR仪上进行扩增和荧光值检测，根据RQ值筛选出转基因阳性的植株(CP4基因RQ值>0.1，结果未示出)。用于扩增筛选标记基因CP4的引物序列为csp356：CAGCACAGGTTAAGTCTG(SEQ ID NO：13)和csp357：GTCTGTCTCAACGGTAAG(SEQ ID NO：14)；用于扩增ACTIN1基因的引物序列为csp106： TGCTATGTACGTCGCCATCCAG(SEQ ID NO：15)和csp107： AATGAGTAACCACGCTCCGTCA(SEQ ID NO：16)。根据筛选结果，保留CP4阳性的水稻株系，包括针对靶序列1编辑的水稻株系170株和针对靶序列2编辑的水稻株系137株。

用ALK基因靶位点特异性检测引物(正向引物为5’端含有FAM 荧光修饰的csp-006962(5'-TGGGTGGGGTTCTCGGTGAAGAT-3'， SEQ ID NO.8)；反向引物为csp-006963(5'-CCATTGGTACTTGGCCTTGACAA-3'，SEQ ID NO.9))和Q5超保真 DNA聚合酶进行PCR扩增。待反应结束后，利用琼脂糖电泳检测PCR 扩增成功与否。之后利用ABI3730XL测序仪进行毛细管电泳，之后用软件分析扩增片段的碱基长度。

对于alk-靶序列1编辑株系，对170株T0代转基因植株的ALK 基因编辑靶标区域的DNA序列长度变化进行分析，结果显示有163 株的ALK基因在靶标区域发生长度变化，突变率为95.88％，变化主要以单个碱基的插入或缺失为主，最长的插入和缺失片段分别为+8bp和-60bp。

对于alk-靶序列2编辑株系，对137株T0代转基因植株的ALK 基因编辑靶标区域的DNA序列长度变化进行分析，结果显示有136 株的ALK基因在靶标区域发生长度变化，突变率为99.27％，变化主要以单个碱基的插入或缺失为主，最长的插入和缺失片段分别为+10bp 和-83bp。

数据表明，两个编辑载体1和2均能够高效地编辑ALK基因。

实施例4.T1代ALK基因编辑纯合非转基因水稻的筛选和鉴定

通过对上述T0代编辑植株在温室种植过程中的各种农艺性状进行观察，选取alk-靶序列1编辑株系027和alk-靶序列2编辑株系031，其生长、发育、结实率等性状表现良好，与野生型相比无显著差异。将其自交T1代种子(约100粒)进行发芽、育苗，提取幼苗的DNA进行转基因成分检测及编辑位点PCR检测，从中筛选出非转基因及编辑位点纯合的株系，将其分别命名为alk1-027和alk2-031。转基因成分检测方法请参见《基因编辑后代材料GMO检测流程》，其是根据中国国家标准农业部953号公告6-2007号公告GB/T 19495—2004转基因产品检测标准要求进行。编辑位点纯合株系指利用上述csp-006962及csp-006963 引物进行基因组PCR扩增后，并对扩增产物进行测序，若测序结果只能检测到单一的目标编辑基因型(即，测序结果中无杂合情况)，则认为该株系为编辑位点纯合株系。为确认alk1-027和alk2-031编辑株系中ALK 基因编辑情况，对其靶位点区域进行PCR扩增和测序。结果显示，alk1-027株系在靶序列1中PAM序列前3位和4位之间(即ALK基因SNP1位点后)插入了1个碱基T(图3)，从而导致编辑后的ALK 基因编码的蛋白从第738个氨基酸处发生移码突变，并使突变后蛋白增加了55个氨基酸(图4,SEQ ID NO.10)。另外一个株系alk2-031 则在靶序列2中PAM序列前3位和4位碱基间(即ALK基因SNP2 附近)插入了1个碱基T(图3)，导致从第773个氨基酸处发生移码突变，使突变后蛋白增加了55个氨基酸(图4，SEQ ID NO.11)。

实施例5.ALK基因编辑水稻的碱消值和品质检测

水稻品种X32以及编辑株系alk1-027和alk2-031的理化指标，包括碱消值，垩白度和长宽比，由中国种子集团有限公司科技中心技术平台品质分析实验室负责鉴定。

水稻精米碱消值检测方法如下：

(1)称取颗粒状KOH(85％有效含量)20.00g溶于1000ml煮沸过的蒸馏水中，配制1.7％的KOH溶液。放置24h后使用。

(2)选择无破碎、无裂纹、大小一致、成熟一致的整粒精米6粒，放入干净的培养皿内，设重复。

(3)每皿加入1.7％KOH 2ml，并把米粒均匀排开，使各米粒之间留有充分的间隙，以便米粒分解扩散，盖上皿盖。

(4)将培养皿放入30℃恒温培养箱，静置23h。

(5)目测米粒胚乳外观的消化扩散程度。注意不要使样品晃荡，以免影响结果的准确性。观测标准参见表1。

表1水稻精米糊化温度(碱消值)分级标准

水稻精米垩白度测定方法如下：

(1)垩白粒率：随意从整精米中取出100粒样品置于乳白板上观察，拣出有垩白(包括心白、腹白、背白)的米粒，按公式求出垩白米的百分率。重复一次，取两次测定结果的平均值，即为垩白粒率。垩白粒率＝垩白米粒数/总粒数*100

(2)垩白大小：随机取垩白米10粒平放在乳白板上，逐粒目测垩白面积占整个籽粒面积的百分数，求出垩白面积的平均值。重复一次，取两次测定结果的平均值即为垩白大小。

(3)垩白度：垩白度指整精米样品中垩白的面积占样品总面积的百分比。垩白度按如下公式计算：垩白度＝垩白粒率/垩白大小。

实验结果显示，水稻品种X32未经编辑前，碱消值只有1.2左右。经过编辑之后，无论是靶向靶序列1还是靶序列2，都能够将水稻品种X32的碱消值从1.2提高到6.5左右。除此之外，编辑后后的株系所产精米从外观上看更加透明，垩白度也有显著改善，长宽比基本不变(表2和图5)。

表2 ALK基因编辑后水稻品质理化指标测定结果

从上述结果中可以看出，本申请利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得ALK基因突变体。与TALEN和ZFN技术相比，CRISPR/Cas9基因编辑技术操作过程简单方便，节约成本，一般实验室都可操作，是一种快速改良水稻淀粉糊化温度以及获得相关种质资源的生物技术育种方法。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本申请的技术方案作了详尽的描述，但在这些技术方案的基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本申请精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本申请要求保护的范围。

序列表

SEQ ID NO.1：水稻ALK基因的核苷酸序列，5033bp

TGGTTTTGGGGTTTTGGAGCGTTGCGGATTGCCACGGCGCACGCCACCGGTGGCGCACGCT TTACAGGTGGCTCCCCCGCCGTCTCCCCCGCGTGCCCTCCTCGCCGTCGTCGCTCGCTGCCC ATTTCATCCCCCGCACGGCACGCGCGGGACGAAAGCAAAGCACGCGCACACACTCAAACC CGCGCCTCCTCCGCTCTCGTCCGTCGCTTCGGTTCGGTTCCGGCTCGATCGGGGAGGTTCCT CGGGGCGACCATGTCGTCGGCCGTCGTCGCGTCATCCACCACGTTCCTCGTCGCGCTCGCC TCTTCGGCGTCACGGGGAGGGCCCAGGAGGGGGAGGGTGGTGGGCGTGGCCGCGCCGCCGGCCCTGCTTTACGACGGCCGCGCCGGAAGGCTAGCCCTACGGGCGCCGCCTCCGCCCCGGC CTCGGCCTCGGCGTCGGGATGCGGGCGTGGTGCGCCGCGCGGATGATGGGGAGAACGAGG CGGCGGTGGAGCGGGCGGGTGAGGACGACGACGAGGAGGAGGAGTTCTCTTCGGGCGCGT GGCAGCCGCCCCGCTCGCGTCGCGGCGGCGTCGGCAAGGTGGGTTGGTGGTGTCGATCGG GGCGCCGAGATCGTCGTGCTCGAGAGGTGTTCTCTGCTTTGATTCGCTTTGATGTTTTCATT TGAAACCGACGCGTGTGCTTGCGCGTGCGCGCGCTGTGTTTGCAGGTCTTGAAGCGGAGGG GCACCGTCCCGCCCGTCGGCCGGTACGGCTCCGGCGGTGATGCGGCGAGAGTGCGCGGGG CGGCCGCGCCGGCGCCGGCGCCGACACAGGACGCCGCCTCAAGTAAGAACGGAGCGCTTC TCAGCGGCCGCGACGACGACACACCTGCCTCACGGAACGGATCGGTCGTTACCGGCGCCG ACAAGCCTGCCGCCGCCACGCCGCCGGTGACCATAACGAAGCTCCCAGCGCCGGACTCCC CCGTGATCCTTCCATCCGTAGACAAGCCGCAGCCGGAGTTCGTCATCCCAGACGCGACGGC GCCGGCGCCGCCACCGCCCGGTTCAAATCCCAGGTCGTCCGCTCCTCTCCCCAAGCCTGAC AATTCGGAATTTGCAGAGGATAAGAGCGCAAAAGTTGTTGAGAGTGCTCCGAAGCCAAAG GCGACTAGATCTTCCCCTATTCCTGCGGTAGAAGAGGAGACGTGGGATTTCAAGAAATATT TTGATCTGAACGAACCGGACGCCGCGGAGGATGGCGATGACGATGATGACTGGGCTGATT CAGATGCGTCAGATTCTGAGATCGACCAGGATGACGATTCGGGCCCTTTGGCTGGGGAGA ATGTCATGAACGTGATCGTGGTGGCTGCTGAATGTTCTCCCTGGTGCAAAACAGGCATGTA CACGATATATACTTCTTTTTTCTCTTTTTTGTTCTTCTGATCTTGTAAATTTGCTTCAGTTACT GATATGAACAAGTGTTGCATTTGCACAGGTGGGCTTGGAGATGTTGCAGGTGCTTTACCCA AAGCTTTGGCGAGGAGAGGACATCGTGTTATGGTATTACTCCTTTTTTCTCTCCTTCATGGT TGGATGTTTCTTCCATTCTTACAGATTTGATCATTTAATTAACGTATATTTTCAGATATATAA ATTTGGATCAAATGTAAAGCAGATTAGTTCTCTTATGTTCTTTTGTTTACATAATCATGATG GCAAATTAAAAAGGCTACTCCAGCTGTTAGATTCAAAATACAAAAGTAATATTGATAAATT TGCAAATCTGTACTTGAAAGCTAAATTGCTTACTATTGTTACAGAAATGTTCATTTCTAACA TGCTGTTGAAAATATATACACTATGGCGTAGCCGCTTAGATCATCACGTGGCCATGGAAAC TAGTGCCAAAAGTAGTTCTCTTAGTTACACTAGTTACATACCTGTACATGATAACGGATCA GGCCCATACAATTAGGGATAGATTAGGAGCCCGTTAACGAACTAGGCCCTTATAATTAGGGAGGGACGGTAGTTACTTTTCGCATATGGACATGCTGCACGTGTTGGGAGGAGGGGATGGA AGGAAGACGACTTCGCTTTTAAGATAGTAGAGAAATGTAGCAATTTTTTTTAGCAATTTTA GTTATGGTAATAATATAAACCACAACGTATTCAGAGATCGGAAACGGGGACTCTCGGTGA CTTCCTGATATAAACTGATAACTGGCAAATGCATCTTTCAATCTTAGGTTGTGGTACCAAG GTACGGTGATTACGCGGAAGCCCAGGATGTAGGAATCAGGAAATACTACAAGGCTGCTGG ACAGGTGTGTGTCAACAATGCAATCCAAGAAGACTGGCATAGGAGACGCAAATTCCTTAG TAATTGGTTTTTATTTTGGCCTGCAGGATCTGGAAGTGAAATATTTCCATGCATTTATCGAT GGAGTTGATTTTGTGTTCATTGACGCTCCTCTCTTCCGTCACCGTCAGGATGACATCTATGG GGGGAACAGACAGGTGAAGCTTCTATCTGTTTGGTATTACATTGCATTAGTAAAACTTAAG TTGCATCTCCTAGGCGTACTGATTTGAAAATGCTTACCCATTCCCATTTTCATTCAGGAAAT CATGAAGCGCATGATTCTGTTTTGTAAGGCTGCTGTTGAGGTATTTTCTCCAACTCCATTAT CAATCATTAATTTGGTTTTAGGAATGAGATGTATTTGTTTGGTTTGAGGATTGGTCAAAAGC ACAAATCATTTTTTCTGTTGATAAATAGAAGAAGTGTATTAACTTTTGGACTGAAGCACAC AATAAGTAGGAGAAATGAGGTCGCAGTAGATGATTTGAATTTGATCCCTCAAACAAACAG CCCGTAAATGTTTCTGCAAGATTTCACAGAGATTCATATTCTTTTTTATTTTAAATATATTAC ACATTATCGCCAAATACACGGATGAACTCCTTCGATACCTCTAGCAGCATTTCAACCTGCT ACCGTTCGTAATATGCAATGCTCTTGCCAATGTTGTCATATGTTCCCCTACAAAGGGCTATA TTTTCTGTTTCTGTACAATCGGCAGGTTCCTTGGCACGTTCCATGCGGTGGTGTGCCCTATG GGGATGGCAACTTGGTGTTCCTTGCAAACGATTGGCACACTGCACTCCTGCCTGTTTATCTG AAGGCATATTACAGAGACAATGGCATGATGCAGTACACTCGCTCTGTCCTTGTGATACATA ATATCGCTTACCAGGTTTTGTTTTTCTCTCCTCCCTAATGAATCATCTTTATTCTATTTGTAT GCATCTCCTGCTGTTTGTTAGAGAAATTAGTTGAGTGCACAAATTGTGGGTCATGGTAATT ATTGAGCAGGGACACGATAAACTCTTCTTCAGTCTATTACTACTTTTAGTTCAGCAATTTCT CCGTTTCATATTATAATTTATAAGTCGTTTTTTTTCTAATCAAACATCTTTACGTTTGATTAA CTTTATCGAAAAATTTAACAGCATCTATAACATCAAATTAGTTTAATTAAATATAATGTTTA ATGTAATTTGATTATATGTTTGTTTTGTATTGGAAATGTTATTGTATTTTTCTATAAACTAAT TAAATTTAAAACTGTTTAACTTAAAAAAATATCAAAACAATTTACAATATGAAACGGGCCG GGGAGTACTTTTTTTGTGTGCTAAATGGTTCGTGTAATGTTTGTAGGGCCGTGGCCCAGTAGATGAATTCCCCTACATGGAATTGCCGGAGCACTACCTGGATCACTTCAAGCTGTACGACCC CGTCGGCGGCGAGCACGCCAACATCTTCGGCGCGGGCCTGAAGATGGCGGACCGGGTGGT GACCGTGAGCCCCGGCTACCTCTGGGAGCTGAAGACGACGGAGGGCGGCTGGGGCCTCCA CGACATCATACGGGAGAACGACTGGAAGATGAACGGCATCGTGAACGGCATCGACTACCG GGAGTGGAACCCGGAGGTGGACGTGCACCTGCAGTCCGACGGCTACGCCAACTACACCGTGGCCTCGCTGGACTCCAGCAAGCCGCGGTGCAAGGCGGCGCTGCAGCGCGAGCTGGGGCT GGAGGTGCGCGACGACGTGCCGCTGATCGGGTTCATCGGGCGGCTCGACGGGCAGAAAGG TGTGGACATCATCGGCGACGCGATGCCGTGGATCGCCGGGCAGGACGTGCAGCTGGTGCT GCTGGGCTCCGGCCGCCGCGACCTGGAGGTGATGCTGCAGCGGTTCGAGGCGCAGCACAA CAGCAAGGTGCGCGGGTGGGTGGGGTTCTCGGTGAAGATGGCGCACCGGATCACGGCGGGCGCCGACGTGCTGGTCATGCCGTCGCGGTTCGAGCCGTGCGGCCTCAACCAGCTCTACGCC ATGGCGTACGGCACCGTCCCCGTCGTGCACGCCGTCGGCGGGCTGAGGGACACCGTGTCG GCGTTCGACCCGTTCGAGGACACCGGCCTCGGGTGGACGTTCGACCGCGCCGAGCCGCAC AAGCTCATCGAGGCGCTCGGCCACTGCCTCGAGACGTACCGCAAGTACAAGGAGAGCTGG AGGGGGCTCCAGGTGCGCGGCATGTCGCAGGACCTCAGCTGGGACCACGCCGCCGAGCTCTACGAGGAGGTCCTTGTCAAGGCCAAGTACCAATGGTGAAGAGACCATGTCCGCCCGCGG TCTCCGCCTGCGCGTTCGGCAGCTATAGCTATAGCCTCCCTGAAGAAGCTTGGCGCTGCTG TGGAGGTGCGACTCGGTGGCGGTGTGGCGCCGGCGCCGGCGCTTGCAGGGGAGGTGTTTG TGCTGACCGAGCTGTGCGTTGAGGTGCGCAAATTAGCTTCCGGTTTGTGTGTTCATGGCGA GGCATGGTGGAGTTGAGGGAGTATTAAGCTTTGTTTCAGATGCATCATGCATGCGTAATAG GATGTTGTATTTAATAATGTGTTTGTTATGTCCATTGATGCGATGTTACTTCTTCATTAGCTCTCGTGTCTGAATGGATGTGACTTGTGAGCAA

SEQ ID NO.2：水稻ALK基因的cds序列，2433bp

ATGTCGTCGGCCGTCGTCGCGTCATCCACCACGTTCCTCGTCGCGCTCGCCTCTTCGGCGTC ACGGGGAGGGCCCAGGAGGGGGAGGGTGGTGGGCGTGGCCGCGCCGCCGGCCCTGCTTTA CGACGGCCGCGCCGGAAGGCTAGCCCTACGGGCGCCGCCTCCGCCCCGGCCTCGGCCTCG GCGTCGGGATGCGGGCGTGGTGCGCCGCGCGGATGATGGGGAGAACGAGGCGGCGGTGG AGCGGGCGGGTGAGGACGACGAGGAGGAGGAGGAGTTCTCTTCGGGCGCGTGGCAGCCGC CCCGCTCGCGTCGCGGCGGCGTCGGCAAGGTCTTGAAGCGGAGGGGCACCGTCCCGCCCG TCGGCCGGTACGGCTCCGGCGGTGACGCGGCGAGAGTGCGCGGGGCGGCCGCGCCGGCGC CGGCGCCGACACAGGACGCCGCCTCAAGTAAGAACGGAGCGCTTCTCAGCGGCCGCGACG ACGACACACCTGCCTCACGGAACGGATCGGTCGTTACCGGCGCCGACAAGCCTGCCGCCG CCACGCCGCCGGTGACCATAACGAAGCTCCCAGCGCCGGACTCCCCCGTGATCCTTCCATC CGTAGACAAGCCGCAGCCGGAGTTCGTCATCCCAGACGCGACGGCGCCGGCGCCGCCACC GCCCGGTTCAAATCCCAGGTCGTCCGCTCCTCTCCCCAAGCCTGACAATTCGGAATTTGCA GAGGATAAGAGCGCAAAAGTTGTTGAGAGTGCTCCGAAGCCAAAGGCGACTAGATCTTCC CCTATTCCTGCGGTAGAAGAGGAGACGTGGGATTTCAAGAAATATTTTGATCTGAACGAAC CGGACGCCGCGGAGGATGGCGATGACGATGATGACTGGGCTGATTCAGATGCGTCAGATT CTGAGATCGACCAGGATGACGATTCGGGCCCTTTGGCTGGGGAGAATGTCATGAACGTGATCGTGGTGGCTGCTGAATGTTCTCCCTGGTGCAAAACAGGTGGGCTTGGAGATGTTGCAGGT GCTTTACCCAAAGCTTTGGCGAGGAGAGGACATCGTGTTATGGTTGTGGTACCAAGGTACG GTGATTACGCGGAAGCCCAGGATGTAGGAATCAGGAAATACTACAAGGCTGCTGGACAGG ATCTGGAAGTGAAATATTTCCATGCATTTATCGATGGAGTTGATTTTGTGTTCATTGACGCT CCTCTCTTCCGTCACCGTCAGGATGACATCTATGGGGGGAACAGACAGGAAATCATGAAGC GCATGATTCTGTTTTGTAAGGCTGCTGTTGAGGTTCCTTGGCACGTTCCATGCGGTGGTGTG CCCTATGGGGATGGCAACTTGGTGTTCCTTGCAAACGATTGGCACACTGCACTCCTGCCTG TTTATCTGAAGGCATATTACAGAGACAATGGCATGATGCAGTACACTCGCTCTGTCCTTGT GATACATAATATCGCTTACCAGGGCCGTGGCCCAGTAGATGAATTCCCCTACATGGAATTG CCGGAGCACTACCTGGATCACTTCAAGCTGTACGACCCCGTCGGCGGCGAGCACGCCAAC ATCTTCGGCGCGGGCCTGAAGATGGCGGACCGGGTGGTGACCGTGAGCCCCGGCTACCTCT GGGAGCTGAAGACGACGGAGGGCGGCTGGGGCCTCCACGACATCATACGGGAGAACGACT GGAAGATGAACGGCATCGTGAACGGCATCGACTACCGGGAGTGGAACCCGGAGGTGGACG TGCACCTGCAGTCCGACGGCTACGCCAACTACACCGTGGCCTCGCTGGACTCCGGCAAGCC GCGGTGCAAGGCGGCGCTGCAGCGCGAGCTGGGGCTGGAGGTGCGCGACGACGTGCCGCT GATCGGGTTCATCGGGCGGCTCGACGGGCAGAAAGGGGTGGACATCATCGGCGACGCGATGCCGTGGATCGCCGGGCAGGACGTGCAGCTGGTGCTGCTGGGCTCCGGCCGCCGCGACCT GGAGGTGATGCTGCAGCGGTTCGAGGCGCAGCACAACAGCAAGGTGCGCGGGTGGGTGGG GTTCTCGGTGAAGATGGCGCACCGGATCACGGCGGGCGCCGACGTGCTGGTCATGCCGTCG CGGTTCGAGCCGTGCGGCCTCAACCAGCTCTACGCCATGGCGTACGGCACCGTCCCCGTCG TGCACGCCGTCGGCGGGCTGAGGGACACCGTGTCGGCGTTCGACCCGTTCGAGGACACCG GCCTCGGGTGGACGTTCGACCGCGCCGAGCCGCACAAGCTCATCGAGGCGCTCGGCCACT GCCTCGAGACGTACCGCAAGTACAAGGAGAGCTGGAGGGGGCTCCAGGTGCGCGGCATGT CGCAGGACCTCAGCTGGGACCACGCCGCCGAGCTCTACGAGGAGGTCCTTGTCAAGGCCA AGTACCAATGGTGA

SEQ ID NO.3：水稻ALK基因中的靶序列1，20bp

CGGGCTGAGGGACACCGTGT

SEQ ID NO.4：水稻ALK基因中的靶序列2，20bp

TGGAGGGGGCTCCAGGTGCG

SEQ ID NO：5：针对靶序列1的sgRNA的编码核苷酸序列，97bp

CGGGCTGAGGGACACCGTGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTC CGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCT

SEQ ID NO：6：针对靶序列2的sgRNA的编码核苷酸序列，97bp

TGGAGGGGGCTCCAGGTGCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTC CGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCT

SEQ ID NO：7：Cas9的核苷酸序列，4149bp

ATGCCGAAGAAGCGCCGCCGCGTGGACAAGAAGTACTCCATCGGCCTCGACATCGGCACCA ACTCCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCGTCCAAGAAGTTCAAGGT GCTCGGCAACACCGACCGCCACTCCATCAAGAAGAACCTCATCGGCGCCCTCCTCTTCGAC TCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGCCTCAAGCGCACCGCCCGCCGCCGCTACACCCGCC GCAAGAACCGCATCTGCTACCTCCAGGAGATCTTCTCCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGA CTCCTTCTTCCACCGCCTCGAGGAGTCCTTCCTCGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGCCACCCGATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCGACCATCT ACCACCTCCGCAAGAAGCTCGTGGACTCCACCGACAAGGCCGACCTCCGCCTCATCTACCT CGCCCTCGCCCACATGATCAAGTTCCGCGGCCACTTCCTCATCGAGGGCGACCTCAACCCGG ACAACTCCGACGTGGACAAGCTCTTCATCCAGCTCGTGCAGACCTACAACCAGCTCTTCGA GGAGAACCCGATCAACGCCTCCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTCTCCGCCCGCCTCTCC AAGTCCCGCCGCCTCGAGAACCTCATCGCCCAGCTCCCGGGCGAGAAGAAGAACGGCCTCT TCGGCAACCTCATCGCCCTCTCCCTCGGCCTCACCCCGAACTTCAAGTCCAACTTCGACCTC GCCGAGGACGCCAAGCTCCAGCTCTCCAAGGACACCTACGACGACGACCTCGACAACCTC CTCGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTCTTCCTCGCCGCCAAGAACCTCTCCGACG CCATCCTCCTCTCCGACATCCTCCGCGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCGCTCTCCGCC TCCATGATCAAGCGCTACGACGAGCACCACCAGGACCTCACCCTCCTCAAGGCCCTCGTGCGCCAGCAGCTCCCGGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGTCCAAGAACGGCTACGC CGGCTACATCGACGGCGGCGCCTCCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTC GAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTCCTCGTGAAGCTCAACCGCGAGGACCTCCTCCGC AAGCAGCGCACCTTCGACAACGGCTCCATCCCGCACCAGATCCACCTCGGCGAGCTCCACG CCATCCTCCGCCGCCAGGAGGACTTCTACCCGTTCCTCAAGGACAACCGCGAGAAGATCGA GAAGATCCTCACCTTCCGCATCCCGTACTACGTGGGCCCGCTCGCCCGCGGCAACTCCCGCT TCGCCTGGATGACCCGCAAGTCCGAGGAGACCATCACCCCGTGGAACTTCGAGGAGGTGGT GGACAAGGGCGCCTCCGCCCAGTCCTTCATCGAGCGCATGACCAACTTCGACAAGAACCTC CCGAACGAGAAGGTGCTCCCGAAGCACTCCCTCCTCTACGAGTACTTCACCGTGTACAACG AGCTCACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGCAAGCCGGCCTTCCTCTCCGGCGA GCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTCCTCTTCAAGACCAACCGCAAGGTGACCGTGAAGCA GCTCAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAGATCTCCGGCGTG GAGGACCGCTTCAACGCCTCCCTCGGCACCTACCACGACCTCCTCAAGATCATCAAGGACA AGGACTTCCTCGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTCGAGGACATCGTGCTCACCCTCAC CCTCTTCGAGGACCGCGAGATGATCGAGGAGCGCCTCAAGACCTACGCCCACCTCTTCGAC GACAAGGTGATGAAGCAGCTCAAGCGCCGCCGCTACACCGGCTGGGGCCGCCTCTCCCGCA AGCTCATCAACGGCATCCGCGACAAGCAGTCCGGCAAGACCATCCTCGACTTCCTCAAGTC CGACGGCTTCGCCAACCGCAACTTCATGCAGCTCATCCACGACGACTCCCTCACCTTCAAG GAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGACTCCCTCCACGAGCACATCGCC AACCTCGCCGGCTCCCCGGCCATCAAGAAGGGCATCCTCCAGACCGTGAAGGTGGTGGACG AGCTCGTGAAGGTGATGGGCCGCCACAAGCCGGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCCGCGA GAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACTCCCGCGAGCGCATGAAGCGCATCGAGGA GGGCATCAAGGAGCTCGGCTCCCAGATCCTCAAGGAGCACCCGGTGGAGAACACCCAGCT CCAGAACGAGAAGCTCTACCTCTACTACCTCCAGAACGGCCGCGACATGTACGTGGACCAG GAGCTCGACATCAACCGCCTCTCCGACTACGACGTGGACCACATCGTGCCGCAGTCCTTCCT CAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTCACCCGCTCCGACAAGAACCGCGGCAAGTC CGACAACGTGCCGTCCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGCCAGCTCCT CAACGCCAAGCTCATCACCCAGCGCAAGTTCGACAACCTCACCAAGGCCGAGCGCGGCGG CCTCTCCGAGCTCGACAAGGCCGGCTTCATCAAGCGCCAGCTCGTGGAGACCCGCCAGATC ACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTCGACTCCCGCATGAACACCAAGTACGACGAGAACGAC AAGCTCATCCGCGAGGTGAAGGTGATCACCCTCAAGTCCAAGCTCGTGTCCGACTTCCGCA AGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTCAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTCATCAAGAAGTACCCGAAGCTCGAGTCCGAGTTC GTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGCAAGATGATCGCCAAGTCCGAGCAGGAGA TCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACTCCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAG ATCACCCTCGCCAACGGCGAGATCCGCAAGCGCCCGCTCATCGAGACCAACGGCGAGACCG GCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCCGCGACTTCGCCACCGTGCGCAAGGTGCTCTCCATGCC GCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCTCCAAGGAGTCCAT CCTCCCGAAGCGCAACTCCGACAAGCTCATCGCCCGCAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAA GTACGGCGGCTTCGACTCCCCGACCGTGGCCTACTCCGTGCTCGTGGTGGCCAAGGTGGAG AAGGGCAAGTCCAAGAAGCTCAAGTCCGTGAAGGAGCTCCTCGGCATCACCATCATGGAGC GCTCCTCCTTCGAGAAGAACCCGATCGACTTCCTCGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAA GAAGGACCTCATCATCAAGCTCCCGAAGTACTCCCTCTTCGAGCTCGAGAACGGCCGCAAG CGCATGCTCGCCTCCGCCGGCGAGCTCCAGAAGGGCAACGAGCTCGCCCTCCCGTCCAAGT ACGTGAACTTCCTCTACCTCGCCTCCCACTACGAGAAGCTCAAGGGCTCCCCGGAGGACAA CGAGCAGAAGCAGCTCTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTCGACGAGATCATCGAGCA GATCTCCGAGTTCTCCAAGCGCGTGATCCTCGCCGACGCCAACCTCGACAAGGTGCTCTCC GCCTACAACAAGCACCGCGACAAGCCGATCCGCGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTCTTCACCCTCACCAACCTCGGCGCCCCGGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCG CAAGCGCTACACCTCCACCAAGGAGGTGCTCGACGCCACCCTCATCCACCAGTCCATCACC GGCCTCTACGAGACCCGCATCGACCTCTCCCAGCTCGGCGGCGACCCGAAGAAGCGCCGCC GCGTGTGA

SEQ ID NO.8：用于ALK基因靶位点扩增的正向引物序列，23bp

TGGGTGGGGTTCTCGGTGAAGAT

SEQ ID NO.9：用于ALK基因靶位点扩增的反向引物序列，23bp

CCATTGGTACTTGGCCTTGACAA

SEQ ID NO.10：水稻alk1-027株系的ALK氨基酸序列，865

MSSAVVASSTTFLVALASSASRGGPRRGRVVGVAAPPALLYDGRAGRLALRAPPPPRPRPRRR DAGVVRRADDGENEAAVERAGEDDEEEEEFSSGAWQPPRSRRGGVGKVLKRRGTVPPVGRY GSGGDAARVRGAAAPAPAPTQDAASSKNGALLSGRDDDTPASRNGSVVTGADKPAAATPPVT ITKLPAPDSPVILPSVDKPQPEFVIPDATAPAPPPPGSNPRSSAPLPKPDNSEFAEDKSAKVVESAP KPKATRSSPIPAVEEETWDFKKYFDLNEPDAAEDGDDDDDWADSDASDSEIDQDDDSGPLAGE NVMNVIVVAAECSPWCKTGGLGDVAGALPKALARRGHRVMVVVPRYGDYAEAQDVGIRKY YKAAGQDLEVKYFHAFIDGVDFVFIDAPLFRHRQDDIYGGNRQEIMKRMILFCKAAVEVPWHV PCGGVPYGDGNLVFLANDWHTALLPVYLKAYYRDNGMMQYTRSVLVIHNIAYQGRGPVDEF PYMELPEHYLDHFKLYDPVGGEHANIFGAGLKMADRVVTVSPGYLWELKTTEGGWGLHDIIR ENDWKMNGIVNGIDYREWNPEVDVHLQSDGYANYTVASLDSGKPRCKAALQRELGLEVRDD VPLIGFIGRLDGQKGVDIIGDAMPWIAGQDVQLVLLGSGRRDLEVMLQRFEAQHNSKVRGWV GFSVKMAHRITAGADVLVMPSRFEPCGLNQLYAMAYGTVPVVHAVGGLRDTVVGVRPVRGH RPRVDVRPRRAAQAHRGARPLPRDVPQVQGELEGAPGARHVAGPQLGPRRRALRGGPCQGQV PMVKRPCPPAVSACAFGSYSYSLPEEAWRCCGGATRWRCGAGAGACRGGVCADRAVR

SEQ ID NO.11：水稻alk2-031株系的ALK氨基酸序列，865

MSSAVVASSTTFLVALASSASRGGPRRGRVVGVAAPPALLYDGRAGRLALRAPPPPRPRPRRR DAGVVRRADDGENEAAVERAGEDDEEEEEFSSGAWQPPRSRRGGVGKVLKRRGTVPPVGRY GSGGDAARVRGAAAPAPAPTQDAASSKNGALLSGRDDDTPASRNGSVVTGADKPAAATPPVT ITKLPAPDSPVILPSVDKPQPEFVIPDATAPAPPPPGSNPRSSAPLPKPDNSEFAEDKSAKVVESAP KPKATRSSPIPAVEEETWDFKKYFDLNEPDAAEDGDDDDDWADSDASDSEIDQDDDSGPLAGE NVMNVIVVAAECSPWCKTGGLGDVAGALPKALARRGHRVMVVVPRYGDYAEAQDVGIRKY YKAAGQDLEVKYFHAFIDGVDFVFIDAPLFRHRQDDIYGGNRQEIMKRMILFCKAAVEVPWHV PCGGVPYGDGNLVFLANDWHTALLPVYLKAYYRDNGMMQYTRSVLVIHNIAYQGRGPVDEF PYMELPEHYLDHFKLYDPVGGEHANIFGAGLKMADRVVTVSPGYLWELKTTEGGWGLHDIIR ENDWKMNGIVNGIDYREWNPEVDVHLQSDGYANYTVASLDSGKPRCKAALQRELGLEVRDD VPLIGFIGRLDGQKGVDIIGDAMPWIAGQDVQLVLLGSGRRDLEVMLQRFEAQHNSKVRGWV GFSVKMAHRITAGADVLVMPSRFEPCGLNQLYAMAYGTVPVVHAVGGLRDTVSAFDPFEDTG LGWTFDRAEPHKLIEALGHCLETYRKYKESWRGLQVARHVAGPQLGPRRRALRGGPCQGQVP MVKRPCPPAVSACAFGSYSYSLPEEAWRCCGGATRWRCGAGAGACRGGVCADRAVR

SEQ ID NO.12：水稻ALK氨基酸序列，803

MSSAVVASSTTFLVALASSASRGGPRRGRVVGVAAPPALLYDGRAGRLALRAPPPPRPRPRRR DAGVVRRADDGENEAAVERAGEDDEEEEEFSSGAWQPPRSRRGGVGKVLKRRGTVPPVGRY GSGGDAARVRGAAAPAPAPTQDAASSKNGALLSGRDDDTPASRNGSVVTGADKPAAATPPVT ITKLPAPDSPVILPSVDKPQPEFVIPDATAPAPPPPGSNPRSSAPLPKPDNSEFAEDKSAKVVESAP KPKATRSSPIPAVEEETWDFKKYFDLNEPDAAEDGDDDDDWADSDASDSEIDQDDDSGPLAGE NVMNVIVVAAECGLGDVAGALPKALARRGHRVMVVVPRYGDYAEAQDVGIRKYYKAAGQD LEVKYFHAFIDGVDFVFIDAPLFRHRQDDIYGGNRQEIMKRMILFCKAAVEVPWHVPCGGVPY GDGNLVFLANDWHTALLPVYLKAYYRDNGMMQYTRSVLVIHNIAYQGRGPVDEFPYMELPE HYLDHFKLYDPVGGEHANIFGAGLKMADRVVTVSPGYLWELKTTEGGWGLHDIIRENDWKM NGIVNGIDYREWNPEVDVHLQSDGYANYTVASLDSGKPRCKAALQRELGLEVRDDVPLIGFIG RLDGQKGVDIIGDAMPWIAGQDVQLVLLGSGRRDLEVMLQRFEAQHNSKVRGWVGFSVKMA HRITAGADVLVMPSRFEPCGLNQLYAMAYGTVPVVHAVGGLRDTVSAFDPFEDTGLGWTFDR AEPHKLIEALGHCLETYRKYKESWRGLQVRGMSQDLSWDHAAELYEEVLVKAKYQW

SEQ ID NO：13：用于扩增筛选标记基因CP4的正向引物序列，18bp

CAGCACAGGTTAAGTCTG

SEQ ID NO：14：用于扩增筛选标记基因CP4的反向引物序列，18bp

GTCTGTCTCAACGGTAAG

SEQ ID NO：15：用于扩增ACTIN1基因的正向引物序列，22bp

TGCTATGTACGTCGCCATCCAG

SEQ ID NO：16：用于扩增ACTIN1基因的反向引物序列，22bp

AATGAGTAACCACGCTCCGTCA

序列表

<110> 中国种子集团有限公司

<120> 创制水稻低糊化温度新种质的方法及其应用

<130> 19C14654CN

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5033

<212> DNA/RNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

tggttttggg gttttggagc gttgcggatt gccacggcgc acgccaccgg tggcgcacgc 60

tttacaggtg gctcccccgc cgtctccccc gcgtgccctc ctcgccgtcg tcgctcgctg 120

cccatttcat cccccgcacg gcacgcgcgg gacgaaagca aagcacgcgc acacactcaa 180

acccgcgcct cctccgctct cgtccgtcgc ttcggttcgg ttccggctcg atcggggagg 240

ttcctcgggg cgaccatgtc gtcggccgtc gtcgcgtcat ccaccacgtt cctcgtcgcg 300

ctcgcctctt cggcgtcacg gggagggccc aggaggggga gggtggtggg cgtggccgcg 360

ccgccggccc tgctttacga cggccgcgcc ggaaggctag ccctacgggc gccgcctccg 420

ccccggcctc ggcctcggcg tcgggatgcg ggcgtggtgc gccgcgcgga tgatggggag 480

aacgaggcgg cggtggagcg ggcgggtgag gacgacgacg aggaggagga gttctcttcg 540

ggcgcgtggc agccgccccg ctcgcgtcgc ggcggcgtcg gcaaggtggg ttggtggtgt 600

cgatcggggc gccgagatcg tcgtgctcga gaggtgttct ctgctttgat tcgctttgat 660

gttttcattt gaaaccgacg cgtgtgcttg cgcgtgcgcg cgctgtgttt gcaggtcttg 720

aagcggaggg gcaccgtccc gcccgtcggc cggtacggct ccggcggtga tgcggcgaga 780

gtgcgcgggg cggccgcgcc ggcgccggcg ccgacacagg acgccgcctc aagtaagaac 840

ggagcgcttc tcagcggccg cgacgacgac acacctgcct cacggaacgg atcggtcgtt 900

accggcgccg acaagcctgc cgccgccacg ccgccggtga ccataacgaa gctcccagcg 960

ccggactccc ccgtgatcct tccatccgta gacaagccgc agccggagtt cgtcatccca 1020

gacgcgacgg cgccggcgcc gccaccgccc ggttcaaatc ccaggtcgtc cgctcctctc 1080

cccaagcctg acaattcgga atttgcagag gataagagcg caaaagttgt tgagagtgct 1140

ccgaagccaa aggcgactag atcttcccct attcctgcgg tagaagagga gacgtgggat 1200

ttcaagaaat attttgatct gaacgaaccg gacgccgcgg aggatggcga tgacgatgat 1260

gactgggctg attcagatgc gtcagattct gagatcgacc aggatgacga ttcgggccct 1320

ttggctgggg agaatgtcat gaacgtgatc gtggtggctg ctgaatgttc tccctggtgc 1380

aaaacaggca tgtacacgat atatacttct tttttctctt ttttgttctt ctgatcttgt 1440

aaatttgctt cagttactga tatgaacaag tgttgcattt gcacaggtgg gcttggagat 1500

gttgcaggtg ctttacccaa agctttggcg aggagaggac atcgtgttat ggtattactc 1560

cttttttctc tccttcatgg ttggatgttt cttccattct tacagatttg atcatttaat 1620

taacgtatat tttcagatat ataaatttgg atcaaatgta aagcagatta gttctcttat 1680

gttcttttgt ttacataatc atgatggcaa attaaaaagg ctactccagc tgttagattc 1740

aaaatacaaa agtaatattg ataaatttgc aaatctgtac ttgaaagcta aattgcttac 1800

tattgttaca gaaatgttca tttctaacat gctgttgaaa atatatacac tatggcgtag 1860

ccgcttagat catcacgtgg ccatggaaac tagtgccaaa agtagttctc ttagttacac 1920

tagttacata cctgtacatg ataacggatc aggcccatac aattagggat agattaggag 1980

cccgttaacg aactaggccc ttataattag ggagggacgg tagttacttt tcgcatatgg 2040

acatgctgca cgtgttggga ggaggggatg gaaggaagac gacttcgctt ttaagatagt 2100

agagaaatgt agcaattttt tttagcaatt ttagttatgg taataatata aaccacaacg 2160

tattcagaga tcggaaacgg ggactctcgg tgacttcctg atataaactg ataactggca 2220

aatgcatctt tcaatcttag gttgtggtac caaggtacgg tgattacgcg gaagcccagg 2280

atgtaggaat caggaaatac tacaaggctg ctggacaggt gtgtgtcaac aatgcaatcc 2340

aagaagactg gcataggaga cgcaaattcc ttagtaattg gtttttattt tggcctgcag 2400

gatctggaag tgaaatattt ccatgcattt atcgatggag ttgattttgt gttcattgac 2460

gctcctctct tccgtcaccg tcaggatgac atctatgggg ggaacagaca ggtgaagctt 2520

ctatctgttt ggtattacat tgcattagta aaacttaagt tgcatctcct aggcgtactg 2580

atttgaaaat gcttacccat tcccattttc attcaggaaa tcatgaagcg catgattctg 2640

ttttgtaagg ctgctgttga ggtattttct ccaactccat tatcaatcat taatttggtt 2700

ttaggaatga gatgtatttg tttggtttga ggattggtca aaagcacaaa tcattttttc 2760

tgttgataaa tagaagaagt gtattaactt ttggactgaa gcacacaata agtaggagaa 2820

atgaggtcgc agtagatgat ttgaatttga tccctcaaac aaacagcccg taaatgtttc 2880

tgcaagattt cacagagatt catattcttt tttattttaa atatattaca cattatcgcc 2940

aaatacacgg atgaactcct tcgatacctc tagcagcatt tcaacctgct accgttcgta 3000

atatgcaatg ctcttgccaa tgttgtcata tgttccccta caaagggcta tattttctgt 3060

ttctgtacaa tcggcaggtt ccttggcacg ttccatgcgg tggtgtgccc tatggggatg 3120

gcaacttggt gttccttgca aacgattggc acactgcact cctgcctgtt tatctgaagg 3180

catattacag agacaatggc atgatgcagt acactcgctc tgtccttgtg atacataata 3240

tcgcttacca ggttttgttt ttctctcctc cctaatgaat catctttatt ctatttgtat 3300

gcatctcctg ctgtttgtta gagaaattag ttgagtgcac aaattgtggg tcatggtaat 3360

tattgagcag ggacacgata aactcttctt cagtctatta ctacttttag ttcagcaatt 3420

tctccgtttc atattataat ttataagtcg ttttttttct aatcaaacat ctttacgttt 3480

gattaacttt atcgaaaaat ttaacagcat ctataacatc aaattagttt aattaaatat 3540

aatgtttaat gtaatttgat tatatgtttg ttttgtattg gaaatgttat tgtatttttc 3600

tataaactaa ttaaatttaa aactgtttaa cttaaaaaaa tatcaaaaca atttacaata 3660

tgaaacgggc cggggagtac tttttttgtg tgctaaatgg ttcgtgtaat gtttgtaggg 3720

ccgtggccca gtagatgaat tcccctacat ggaattgccg gagcactacc tggatcactt 3780

caagctgtac gaccccgtcg gcggcgagca cgccaacatc ttcggcgcgg gcctgaagat 3840

ggcggaccgg gtggtgaccg tgagccccgg ctacctctgg gagctgaaga cgacggaggg 3900

cggctggggc ctccacgaca tcatacggga gaacgactgg aagatgaacg gcatcgtgaa 3960

cggcatcgac taccgggagt ggaacccgga ggtggacgtg cacctgcagt ccgacggcta 4020

cgccaactac accgtggcct cgctggactc cagcaagccg cggtgcaagg cggcgctgca 4080

gcgcgagctg gggctggagg tgcgcgacga cgtgccgctg atcgggttca tcgggcggct 4140

cgacgggcag aaaggtgtgg acatcatcgg cgacgcgatg ccgtggatcg ccgggcagga 4200

cgtgcagctg gtgctgctgg gctccggccg ccgcgacctg gaggtgatgc tgcagcggtt 4260

cgaggcgcag cacaacagca aggtgcgcgg gtgggtgggg ttctcggtga agatggcgca 4320

ccggatcacg gcgggcgccg acgtgctggt catgccgtcg cggttcgagc cgtgcggcct 4380

caaccagctc tacgccatgg cgtacggcac cgtccccgtc gtgcacgccg tcggcgggct 4440

gagggacacc gtgtcggcgt tcgacccgtt cgaggacacc ggcctcgggt ggacgttcga 4500

ccgcgccgag ccgcacaagc tcatcgaggc gctcggccac tgcctcgaga cgtaccgcaa 4560

gtacaaggag agctggaggg ggctccaggt gcgcggcatg tcgcaggacc tcagctggga 4620

ccacgccgcc gagctctacg aggaggtcct tgtcaaggcc aagtaccaat ggtgaagaga 4680

ccatgtccgc ccgcggtctc cgcctgcgcg ttcggcagct atagctatag cctccctgaa 4740

gaagcttggc gctgctgtgg aggtgcgact cggtggcggt gtggcgccgg cgccggcgct 4800

tgcaggggag gtgtttgtgc tgaccgagct gtgcgttgag gtgcgcaaat tagcttccgg 4860

tttgtgtgtt catggcgagg catggtggag ttgagggagt attaagcttt gtttcagatg 4920

catcatgcat gcgtaatagg atgttgtatt taataatgtg tttgttatgt ccattgatgc 4980

gatgttactt cttcattagc tctcgtgtct gaatggatgt gacttgtgag caa 5033

<210> 2

<211> 2433

<212> DNA/RNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

atgtcgtcgg ccgtcgtcgc gtcatccacc acgttcctcg tcgcgctcgc ctcttcggcg 60

tcacggggag ggcccaggag ggggagggtg gtgggcgtgg ccgcgccgcc ggccctgctt 120

tacgacggcc gcgccggaag gctagcccta cgggcgccgc ctccgccccg gcctcggcct 180

cggcgtcggg atgcgggcgt ggtgcgccgc gcggatgatg gggagaacga ggcggcggtg 240

gagcgggcgg gtgaggacga cgaggaggag gaggagttct cttcgggcgc gtggcagccg 300

ccccgctcgc gtcgcggcgg cgtcggcaag gtcttgaagc ggaggggcac cgtcccgccc 360

gtcggccggt acggctccgg cggtgacgcg gcgagagtgc gcggggcggc cgcgccggcg 420

ccggcgccga cacaggacgc cgcctcaagt aagaacggag cgcttctcag cggccgcgac 480

gacgacacac ctgcctcacg gaacggatcg gtcgttaccg gcgccgacaa gcctgccgcc 540

gccacgccgc cggtgaccat aacgaagctc ccagcgccgg actcccccgt gatccttcca 600

tccgtagaca agccgcagcc ggagttcgtc atcccagacg cgacggcgcc ggcgccgcca 660

ccgcccggtt caaatcccag gtcgtccgct cctctcccca agcctgacaa ttcggaattt 720

gcagaggata agagcgcaaa agttgttgag agtgctccga agccaaaggc gactagatct 780

tcccctattc ctgcggtaga agaggagacg tgggatttca agaaatattt tgatctgaac 840

gaaccggacg ccgcggagga tggcgatgac gatgatgact gggctgattc agatgcgtca 900

gattctgaga tcgaccagga tgacgattcg ggccctttgg ctggggagaa tgtcatgaac 960

gtgatcgtgg tggctgctga atgttctccc tggtgcaaaa caggtgggct tggagatgtt 1020

gcaggtgctt tacccaaagc tttggcgagg agaggacatc gtgttatggt tgtggtacca 1080

aggtacggtg attacgcgga agcccaggat gtaggaatca ggaaatacta caaggctgct 1140

ggacaggatc tggaagtgaa atatttccat gcatttatcg atggagttga ttttgtgttc 1200

attgacgctc ctctcttccg tcaccgtcag gatgacatct atggggggaa cagacaggaa 1260

atcatgaagc gcatgattct gttttgtaag gctgctgttg aggttccttg gcacgttcca 1320

tgcggtggtg tgccctatgg ggatggcaac ttggtgttcc ttgcaaacga ttggcacact 1380

gcactcctgc ctgtttatct gaaggcatat tacagagaca atggcatgat gcagtacact 1440

cgctctgtcc ttgtgataca taatatcgct taccagggcc gtggcccagt agatgaattc 1500

ccctacatgg aattgccgga gcactacctg gatcacttca agctgtacga ccccgtcggc 1560

ggcgagcacg ccaacatctt cggcgcgggc ctgaagatgg cggaccgggt ggtgaccgtg 1620

agccccggct acctctggga gctgaagacg acggagggcg gctggggcct ccacgacatc 1680

atacgggaga acgactggaa gatgaacggc atcgtgaacg gcatcgacta ccgggagtgg 1740

aacccggagg tggacgtgca cctgcagtcc gacggctacg ccaactacac cgtggcctcg 1800

ctggactccg gcaagccgcg gtgcaaggcg gcgctgcagc gcgagctggg gctggaggtg 1860

cgcgacgacg tgccgctgat cgggttcatc gggcggctcg acgggcagaa aggggtggac 1920

atcatcggcg acgcgatgcc gtggatcgcc gggcaggacg tgcagctggt gctgctgggc 1980

tccggccgcc gcgacctgga ggtgatgctg cagcggttcg aggcgcagca caacagcaag 2040

gtgcgcgggt gggtggggtt ctcggtgaag atggcgcacc ggatcacggc gggcgccgac 2100

gtgctggtca tgccgtcgcg gttcgagccg tgcggcctca accagctcta cgccatggcg 2160

tacggcaccg tccccgtcgt gcacgccgtc ggcgggctga gggacaccgt gtcggcgttc 2220

gacccgttcg aggacaccgg cctcgggtgg acgttcgacc gcgccgagcc gcacaagctc 2280

atcgaggcgc tcggccactg cctcgagacg taccgcaagt acaaggagag ctggaggggg 2340

ctccaggtgc gcggcatgtc gcaggacctc agctgggacc acgccgccga gctctacgag 2400

gaggtccttg tcaaggccaa gtaccaatgg tga 2433

<210> 3

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

cgggctgagg gacaccgtgt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 4

tggagggggc tccaggtgcg 20

<210> 5

<211> 97

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgggctgagg gacaccgtgt gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgct 97

<210> 6

<211> 97

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggagggggc tccaggtgcg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgct 97

<210> 7

<211> 4149

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgccgaaga agcgccgccg cgtggacaag aagtactcca tcggcctcga catcggcacc 60

aactccgtgg gctgggccgt gatcaccgac gagtacaagg tgccgtccaa gaagttcaag 120

gtgctcggca acaccgaccg ccactccatc aagaagaacc tcatcggcgc cctcctcttc 180

gactccggcg agaccgccga ggccacccgc ctcaagcgca ccgcccgccg ccgctacacc 240

cgccgcaaga accgcatctg ctacctccag gagatcttct ccaacgagat ggccaaggtg 300

gacgactcct tcttccaccg cctcgaggag tccttcctcg tggaggagga caagaagcac 360

gagcgccacc cgatcttcgg caacatcgtg gacgaggtgg cctaccacga gaagtacccg 420

accatctacc acctccgcaa gaagctcgtg gactccaccg acaaggccga cctccgcctc 480

atctacctcg ccctcgccca catgatcaag ttccgcggcc acttcctcat cgagggcgac 540

ctcaacccgg acaactccga cgtggacaag ctcttcatcc agctcgtgca gacctacaac 600

cagctcttcg aggagaaccc gatcaacgcc tccggcgtgg acgccaaggc catcctctcc 660

gcccgcctct ccaagtcccg ccgcctcgag aacctcatcg cccagctccc gggcgagaag 720

aagaacggcc tcttcggcaa cctcatcgcc ctctccctcg gcctcacccc gaacttcaag 780

tccaacttcg acctcgccga ggacgccaag ctccagctct ccaaggacac ctacgacgac 840

gacctcgaca acctcctcgc ccagatcggc gaccagtacg ccgacctctt cctcgccgcc 900

aagaacctct ccgacgccat cctcctctcc gacatcctcc gcgtgaacac cgagatcacc 960

aaggccccgc tctccgcctc catgatcaag cgctacgacg agcaccacca ggacctcacc 1020

ctcctcaagg ccctcgtgcg ccagcagctc ccggagaagt acaaggagat cttcttcgac 1080

cagtccaaga acggctacgc cggctacatc gacggcggcg cctcccagga ggagttctac 1140

aagttcatca agccgatcct cgagaagatg gacggcaccg aggagctcct cgtgaagctc 1200

aaccgcgagg acctcctccg caagcagcgc accttcgaca acggctccat cccgcaccag 1260

atccacctcg gcgagctcca cgccatcctc cgccgccagg aggacttcta cccgttcctc 1320

aaggacaacc gcgagaagat cgagaagatc ctcaccttcc gcatcccgta ctacgtgggc 1380

ccgctcgccc gcggcaactc ccgcttcgcc tggatgaccc gcaagtccga ggagaccatc 1440

accccgtgga acttcgagga ggtggtggac aagggcgcct ccgcccagtc cttcatcgag 1500

cgcatgacca acttcgacaa gaacctcccg aacgagaagg tgctcccgaa gcactccctc 1560

ctctacgagt acttcaccgt gtacaacgag ctcaccaagg tgaagtacgt gaccgagggc 1620

atgcgcaagc cggccttcct ctccggcgag cagaagaagg ccatcgtgga cctcctcttc 1680

aagaccaacc gcaaggtgac cgtgaagcag ctcaaggagg actacttcaa gaagatcgag 1740

tgcttcgact ccgtggagat ctccggcgtg gaggaccgct tcaacgcctc cctcggcacc 1800

taccacgacc tcctcaagat catcaaggac aaggacttcc tcgacaacga ggagaacgag 1860

gacatcctcg aggacatcgt gctcaccctc accctcttcg aggaccgcga gatgatcgag 1920

gagcgcctca agacctacgc ccacctcttc gacgacaagg tgatgaagca gctcaagcgc 1980

cgccgctaca ccggctgggg ccgcctctcc cgcaagctca tcaacggcat ccgcgacaag 2040

cagtccggca agaccatcct cgacttcctc aagtccgacg gcttcgccaa ccgcaacttc 2100

atgcagctca tccacgacga ctccctcacc ttcaaggagg acatccagaa ggcccaggtg 2160

tccggccagg gcgactccct ccacgagcac atcgccaacc tcgccggctc cccggccatc 2220

aagaagggca tcctccagac cgtgaaggtg gtggacgagc tcgtgaaggt gatgggccgc 2280

cacaagccgg agaacatcgt gatcgagatg gcccgcgaga accagaccac ccagaagggc 2340

cagaagaact cccgcgagcg catgaagcgc atcgaggagg gcatcaagga gctcggctcc 2400

cagatcctca aggagcaccc ggtggagaac acccagctcc agaacgagaa gctctacctc 2460

tactacctcc agaacggccg cgacatgtac gtggaccagg agctcgacat caaccgcctc 2520

tccgactacg acgtggacca catcgtgccg cagtccttcc tcaaggacga ctccatcgac 2580

aacaaggtgc tcacccgctc cgacaagaac cgcggcaagt ccgacaacgt gccgtccgag 2640

gaggtggtga agaagatgaa gaactactgg cgccagctcc tcaacgccaa gctcatcacc 2700

cagcgcaagt tcgacaacct caccaaggcc gagcgcggcg gcctctccga gctcgacaag 2760

gccggcttca tcaagcgcca gctcgtggag acccgccaga tcaccaagca cgtggcccag 2820

atcctcgact cccgcatgaa caccaagtac gacgagaacg acaagctcat ccgcgaggtg 2880

aaggtgatca ccctcaagtc caagctcgtg tccgacttcc gcaaggactt ccagttctac 2940

aaggtgcgcg agatcaacaa ctaccaccac gcccacgacg cctacctcaa cgccgtggtg 3000

ggcaccgccc tcatcaagaa gtacccgaag ctcgagtccg agttcgtgta cggcgactac 3060

aaggtgtacg acgtgcgcaa gatgatcgcc aagtccgagc aggagatcgg caaggccacc 3120

gccaagtact tcttctactc caacatcatg aacttcttca agaccgagat caccctcgcc 3180

aacggcgaga tccgcaagcg cccgctcatc gagaccaacg gcgagaccgg cgagatcgtg 3240

tgggacaagg gccgcgactt cgccaccgtg cgcaaggtgc tctccatgcc gcaggtgaac 3300

atcgtgaaga agaccgaggt gcagaccggc ggcttctcca aggagtccat cctcccgaag 3360

cgcaactccg acaagctcat cgcccgcaag aaggactggg acccgaagaa gtacggcggc 3420

ttcgactccc cgaccgtggc ctactccgtg ctcgtggtgg ccaaggtgga gaagggcaag 3480

tccaagaagc tcaagtccgt gaaggagctc ctcggcatca ccatcatgga gcgctcctcc 3540

ttcgagaaga acccgatcga cttcctcgag gccaagggct acaaggaggt gaagaaggac 3600

ctcatcatca agctcccgaa gtactccctc ttcgagctcg agaacggccg caagcgcatg 3660

ctcgcctccg ccggcgagct ccagaagggc aacgagctcg ccctcccgtc caagtacgtg 3720

aacttcctct acctcgcctc ccactacgag aagctcaagg gctccccgga ggacaacgag 3780

cagaagcagc tcttcgtgga gcagcacaag cactacctcg acgagatcat cgagcagatc 3840

tccgagttct ccaagcgcgt gatcctcgcc gacgccaacc tcgacaaggt gctctccgcc 3900

tacaacaagc accgcgacaa gccgatccgc gagcaggccg agaacatcat ccacctcttc 3960

accctcacca acctcggcgc cccggccgcc ttcaagtact tcgacaccac catcgaccgc 4020

aagcgctaca cctccaccaa ggaggtgctc gacgccaccc tcatccacca gtccatcacc 4080

ggcctctacg agacccgcat cgacctctcc cagctcggcg gcgacccgaa gaagcgccgc 4140

cgcgtgtga 4149

<210> 8

<211> 23

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tgggtggggt tctcggtgaa gat 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

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<210> 10

<211> 865

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 10

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Ala Ser Ser Ala Ser Arg Gly Gly Pro Arg Arg Gly Arg Val Val Gly

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Val Ala Ala Pro Pro Ala Leu Leu Tyr Asp Gly Arg Ala Gly Arg Leu

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865

<210> 11

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<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

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<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

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tgctatgtac gtcgccatcc ag 22

<210> 16

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<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aatgagtaac cacgctccgt ca 22

Claims

1.创制水稻低糊化温度新种质的方法，其包括修饰水稻中的ALK基因，使其第八外显子发生缺失或插入突变，所述修饰通过CRISPR/Cas9进行，所述CRISPR/Cas9包含Cas9和导向RNA(sgRNA)，其中所述sgRNA靶向SEQ ID NO:3或4所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述ALK基因包含以下序列或由以下序列组成：SEQID NO:1所示的核苷酸序列，或者编码SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述水稻为籼稻或粳稻。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述Cas9包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，所述sgRNA包含SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述修饰导致所述ALK基因仍表达功能正常的蛋白质。

6.通过权利要求1-5中任一项所述的方法创制的水稻用于育种的用途。

7.通过权利要求1-5中任一项所述的方法创制的水稻用于改良种质资源的用途。

8.由权利要求1-5中任一项的方法获得的水稻的种子制成的制品，其选自食品、饮品、饲料或工业原料。

9.能够靶向水稻ALK基因的sgRNA，其靶向SEQ ID NO:3或4所示的核苷酸序列。

10.根据权利要求9所述的sgRNA，其包含SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列或由SEQID NO:5或6所示的核苷酸序列组成。

11.能够靶向水稻ALK基因的CRISPR/Cas9编辑载体，其包含表达Cas9的第一表达盒和表达sgRNA的第二表达盒，其中所述Cas9包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，并且所述sgRNA包含SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列。

12.创制水稻低糊化温度新种质的方法，其包括将权利要求11所述的CRISPR/Cas9编辑载体导入含有ALK基因的水稻中。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述ALK基因包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或者编码SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述水稻为籼稻或粳稻。