CN114480720B - 一种水稻糊化温度基因alk的分子标记及其引物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水稻糊化温度基因ALK的分子标记及其引物和应用,该分子标记物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。高碱消值水稻扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,中碱消值水稻扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示,杂合基因型水稻材料同时扩增出如SEQ ID No.3所示和如SEQ ID No.4所示的条带。本发明能够实现使用简单可靠的方法快速检测水稻分子标记辅助育种高/中碱消值材料的鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及一种水稻糊化温度基因的分子标记,具体涉及一种水稻糊化温度基因ALK的分子标记及其引物和应用。
背景技术
稻米品质主要包含了碾磨品质、外观品质、营养品质和蒸煮食味品质等4个方面。这4个品质性状的评价指标涵盖了一系列物理到生化的特性。水稻自身的遗传因素是决定这些性状的主要原因,因此,研究稻米品质的一系列遗传机理具有极为重要的意义。到目前为止,科学家们已对多个与稻米品质相关的基因进行了QTL定位,其中部分已被克隆并进行了功能验证,这些被克隆的基因和QTL,多数已被开发成分子标记,利用这些分子标记辅助选择技术可以提高水稻品质改良的育种效率。
稻米的蒸煮食味品质(eating and cooking quality,ECQ)是评价水稻品质最为重要的指标之一,其决定了米饭蒸煮时的一系列特性、以及米饭煮熟后的质地和黏度等。目前在国际上所用的稻米蒸煮食味品质评价指标基本规范统一,其中主要包括直链淀粉含量(Amylose Content,AC)、胶稠度(Gel Consistency,GC)和糊化温度(GelatinizationTemperature,GT)3个主要理化性状。
糊化温度是指水稻淀粉颗粒在加热过程中发生的不可逆膨胀,且淀粉晶体结构开始融化时的一个温度范围,它是反映稻米在蒸煮过程中所需要的能量、水分和时间以及稻米胀性的一个指标。一般糊化温度高的稻米,其蒸煮时需要的水分和时间就更多,米饭也就越难煮熟。同时,糊化温度是仅次于直链淀粉含量的评价水稻稻米蒸煮品质的重要指标,稻米的糊化温度范围一般是在55℃到79℃之间,根据水稻品种稻米特性的不同,其糊化温度可以分为高糊化温度(>74℃)、中糊化温度(70℃~74℃)以及低糊化温度(<70℃)三个不同的级别。
由于条件的限制,对糊化温度直接进行测定的操作比较困难,所以通常我们采用其它的方式来间接的表示糊化温度的高低。目前,主要采用碱消值(Alkali spread value,ASV)、成糊温度(pasting temperature)或者差示扫描量热法(Differential ScanningCalorimetry,DSC)等来衡量稻米糊化温度。其中,碱消值是指稻米的整精米在1.7%KOH溶液中恒温(30℃±2℃)培养24h后其米粒的消解程度,其与糊化温度是呈负相关,即消解程度越高,则对应的糊化温度就越低。一般将碱消值分为7个级别,其中低碱消值1~2级对应的是高糊化温度(GT>74℃),中碱消值3~5级则对应中糊化温度(GT在70℃-74℃范围内),而高碱消值6~7级对应低糊化温度(GT<70℃)。人们通常针对用米的目的,选择糊化温度不同的品种,以ASV为6~7级的稻米品质为高品质,因为其在蒸煮时不需要太多的水分和太久的时间,而罐头制作则需要高糊化温度的品种。因此对水稻糊化温度基因的克隆,有助于水稻品质的分子改良。
目前的研究表明,糊化温度主要受ALK基因控制。ALK基因又称为SSSⅡa或SSSⅡ-3,在水稻胚乳中特异表达,主要负责延伸支链淀粉的短支链和合成中等长度的葡聚糖链,从而使支链淀粉具有中等长度的分支,导致淀粉颗粒的形态结构的改变。高振宇等人发现ALK基因含有8个外显子和7个内含子,其cDNA全长2409bp,编码一个由803个氨基酸组成的功能蛋白,其在双科早和C堡两个材料中有3处碱基(SNP264G/C、SNP1789G/A、SNP2319GC/TT)的突变导致了氨基酸的改变(Map-based cloning of the ALK gene,which controlsthe gelatinization temperature of rice[J].China CLife,2003,46(6):661-668)。李闯等人的研究表明,ALK主要有三种等位基因型,其主要受第8外显子的三个SNP的突变影响水稻的糊化温度,分别是SNP4198A/G,SNP4329G/T和SNP4330C/T,根据3个外显子的突变,可将ALK等位基因型分为3种,分别是ALKA(A/GC)、ALKG(G/GC)和ALKT(G/TT),其中ALKA(A/GC)控制低糊化温度(<66℃)、ALKT(G/TT)控制中低糊化温度(66℃~70℃),而ALKG(G/GC)则控制中高糊化温度(>70℃)(云南哈尼梯田当前栽培水稻ALK基因的遗传多样性及与稻米糊化温度的关联分析[J].作物学报,2017,43(3):343-353;Nucleotide Diversity andMolecular Evolution oftheALK Gene in Cultivated Rice and its Wild Relatives[J].Plant Molecular Biology Reporter,2016,34(5):1-8;ALK,the key gene forgelatinization temperature,is a modifier gene for gel consistency in rice[J].JournalofIntegrativePlantBiology,2011(09):756-765)。
稻米的糊化温度是水稻重要的蒸煮品质性状,是由多个微效基因共同控制的复杂数量性状,且极易受到环境等其他因素的影响,在水稻育种中难以直接通过表型来进行准确选择,而且稻米糊化温度要等成熟收获后才能进行鉴定,鉴定前需要出糙,费时费力。通过设计目标基因的功能标记进行分子标记辅助选择能够快速准确的鉴定目标基因的不同等位基因型,能够快速准确筛选到包含目标基因的单株。因此,获得ALK基因的功能标记能快速、准确鉴定目标基因的等位基因型,是开展ALK基因分子标记辅助选择的重要前提。
发明内容
本发明的目的是提供一种水稻糊化温度基因ALK的分子标记及其引物和应用,能够实现使用简单可靠的方法快速检测水稻分子标记辅助育种高/中碱消值材料的鉴定。
为了达到上述目的,本发明提供了一种水稻糊化温度基因ALK的分子标记物,该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。高碱消值(低糊化温度)水稻扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,中碱消值(中糊化温度)水稻扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示,杂合基因型水稻材料同时扩增出如SEQ ID No.3所示和如SEQ IDNo.4所示的条带。
本发明的另一目的是提供一种水稻糊化温度基因ALK的分子标记的引物对,该引物对针对所述的分子标记物,该引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
本发明的另一目的是提供所述的分子标记物在高/中碱消值水稻材料的鉴定及高碱消值材料选择育种中的应用。
本发明的另一目的是提供一种鉴定高/中碱消值水稻材料的方法,该方法包含:以待检测水稻材料的基因组为DNA模板,采用所述的引物对进行PCR扩增,根据扩增产物判断:若待检测水稻材料扩增出长度为143bp的条带,则该待检测水稻材料为高碱消值水稻材料;若待检测水稻材料扩增出长度为147bp的条带,则该待检测水稻材料为中碱消值水稻材料。
优选地,所述PCR扩增的扩增体系包含:DNA模板、如权利要求2所述的引物对、2×TaqMix和双蒸水。
更优选地,所述PCR扩增的扩增体系包含:50~100ng/μL的DNA模板2μL、10μmol的正向引物1μL、10μmol的反向引物1μL、2×Taq Mix 12.5μL和双蒸水8.5μL。
优选地,所述2×TaqMix包含:PCRbuffer、Mg2+、dNTP mixture和Taq酶。
优选地,所述PCR扩增的程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,30个循环;72℃延伸5min。
优选地,所述PCR扩增的产物进行凝胶电泳检测。
更优选地,所述凝胶电泳检测,为:按照每板胶30mL 6%的丙烯酰胺胶+350μL10%过硫酸铵+15μL TEMED的用量配置胶液;用1×TBE缓冲液预电泳10min(400V),PCR产物加loading buffer后,按每孔5μL的量依次点样;400V电泳1h40min;用0.1%AgNO3溶液染色,染色后用显影并拍照保存结果。
本发明的水稻糊化温度基因ALK的分子标记及其引物和应用,具有以下优点:
本发明发现1892S(ALKG,ASV=3.5)材料与以广8B(ALKT,ASV=7.0)为代表的高碱消值(低糊化温度)材料除SNP4198A/G,SNP4329G/T和SNP4330C/T差异外,还在3’UTR存在4个碱基的插入,3’UTR 4个碱基ATCG的缺失或插入与SNP4198A/G、SNP4329G/T和SNP4330C/T连锁,根据这一差异设计Indel分子标记引物,并将该分子标记引物应用于高碱消值材料的选择育种,能够实现使用简单可靠的方法快速检测水稻分子标记辅助育种高/中碱消值材料的鉴定。相比于基于SNP设计的标记,不会出现类似基于SNP差异设计的标记在群体应用中不稳定的现象,而且采用Indel标记检测准确省时省力,每个泳道均只有主带和一条弱带,本发明的引物特异性较好。
附图说明
图1为水稻1892S与广8B材料部分序列比对图。
图2为用本发明的水稻糊化温度基因ALK的InDel分子标记ALK26检测10个高碱消值材料和1个中碱消值材料的鉴定图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1引物设计
根据水稻材料1892S(基因ALKG,碱消值ASV=3.5,中碱消值)与广8B(基因ALKT,碱消值ASV=7.0,高碱消值)的ALK基因序列差异,除SNP4198A/G、SNP4329G/T和SNP4330C/T差异外,广8B材料较1892S材料在ALK基因的3’UTR缺失4个碱基ATCG,因此设计了引物ALK26(图1),引物ALK26的扩增片段包含这一差异,作为ALK基因内的连锁标记,将该分子标记引物应用于高碱消值材料的选择育种。
ALK26正向引物序列(SEQ ID NO.1)如下:
5’-AGCCTCCCTGAAGAAGCTTG-3’;
ALK26反向引物序列(SEQ ID NO.2)如下:
5’-GAACACACAAACCGGAAGCT-3’。
实施例2利用Indel分子标记ALK26鉴定水稻材料的糊化温度基因
1、试验材料
中碱消值水稻材料包括:1892S。
高碱消值水稻材料包括:广8B、川106B、川康606B、川绿609B、成恢3203、成恢727、IR24、晶4155S、川658S、丙4114。川康606B和川绿609B均是从川106B和川345B的杂交组合中选育而来的。川658S是从川香29B、成恢177和蜀恢527的杂交组合中选育而来的,是作为两系不育系材料应用的。
2、DNA提取
取3~5g水稻苗期组织,使用研钵研磨样品,采用CTAB法提取植物基因组DNA。
3、PCR扩增
PCR扩增体系为25μL,各试剂的具体用量如下:50~100ng/μL的DNA模板2μL、10μmol的正向引物1μL、10μmol的反向引物1μL、2×Taq Mix(包含PCRbuffer、3mM浓度的Mg2+、dNTP mixture、Taq酶等)12.5μL,双蒸水8.5μL。
PCR扩增反应程序,为:94℃预变性5min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,30个循环;72℃延伸5min。
4、6%聚丙烯酰胺凝胶电泳(24孔板)
按照每板胶30mL 6%的丙烯酰胺胶+350μL 10%过硫酸铵+15μL TEMED的用量配置胶液;用1×TBE缓冲液预电泳10min(400V),PCR产物加loading buffer后,按每孔5μL的量依次点样;400V电泳1h40min;用0.1%AgNO3溶液染色,染色后显影并拍照保存结果。
5、扩增结果
1个中碱消值水稻材料(1892S)扩增出长度147bp(SEQ ID NO.4)条带,10个高碱消值水稻材料(广8B、川106B、川康606B、川绿609B、成恢3203、成恢727、IR24、晶4155S、川658S和丙4114)均扩增出长度143bp(SEQ ID NO.3)条带,参见附图2,1~12泳道依次为Marker(DL2000)、1892S、广8B、川106B、川康606B、川绿609B、成恢3203、成恢727、IR24、晶4155S、川658S、丙4114,可以看出每个泳道均只有主带和一条弱带,本发明的引物特异性较好,而且采用Indel标记检测准确省时省力,不会出现类似基于SNP差异设计的标记在群体应用中不稳定的现象。
实施例3比较引物ALK26分子标记鉴定与碱消值表型鉴定
1、试验材料
1892S、广8B、川106B、川康606B、川绿609B、成恢3203、成恢727、IR24、晶4155S、川658S、丙4114。
2、碱消值表型鉴定
从试验材料中随机取6粒成熟饱满的整精米置于玻璃培养皿内,加入10.0mL左右百分比为1.7%KOH溶液。将培养皿内米粒排布均匀,使米粒完全被浸泡而不随意晃动,加盖。将培养皿平稳的移至恒温箱内,温度设置为30±2℃。静置24h后平稳地取出。逐粒观察米粒胚乳的分解情况,按标准进行碱消值分级,并记录每一粒米的碱消值,重复测定3次,最后算出其算数平均值。
3、比较ALK26分子标记鉴定与碱消值表型鉴定
表1为ALK26分子标记鉴定与碱消值表型鉴定
由表1可以看出,本发明的ALK26分子标记能够中碱消值和高碱消值的水稻材料鉴别出来,高碱消值的水稻材料能扩增出143bp的条带,中碱消值的水稻材料能扩增出147bp的条带。
4、测试材料ALK基因序列差异分析
对测试材料ALK基因序列差异分析,结果如下表2:
表2为测试材料ALK基因序列差异情况
注:N表示碱基缺失。
由表2可以看出,3’UTR 4个碱基ATCG的缺失或插入与SNP4198A/G、SNP4329G/T和SNP4330C/T连锁。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍,但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后,对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此,本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序 列 表
<110> 四川省农业科学院作物研究所
<120> 一种水稻糊化温度基因ALK的分子标记及其引物和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
agcctccctg aagaagcttg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gaacacacaa accggaagct 20
<210> 3
<211> 143
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
agcctccctg aagaagcttg gcgctgctgt ggaggtgcga ctcggtggcg gtgtggcgcc 60
ggcgccggcg cttgcagggg aggtgtttgt gctgaccgag ctgtgcgttg aggtgcgcaa 120
attagcttcc ggtttgtgtg ttc 143
<210> 4
<211> 147
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
agcctccctg aagaagcttg gcgctgctgt ggaggtgcga tcgactcggt ggcggtgtgg 60
cgccggcgcc ggcgcttgca ggggaggtgt ttgtgctgac cgagctgtgc gttgaggtgc 120
gcaaattagc ttccggtttg tgtgttc 147
Claims (6)
1.检测水稻糊化温度基因ALK的分子标记的引物对在中碱消值水稻材料1892S和高碱消值水稻材料鉴定中的应用,其特征在于,所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示,所述分子标记的序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4;其中,所述中碱消值水稻材料1892S的扩增产物的长度为147bp,扩增产物的序列如SEQ ID NO.4所示;所述高碱消值水稻材料的扩增产物的长度为143bp,扩增产物的序列如SEQ ID NO.3所示;
其中,所述高碱消值水稻材料选自广8B、川106B、川康606B、川绿609B、成恢3203、成恢727、IR24、晶4155S和丙4114。
2.一种鉴定中碱消值水稻材料1892S和高碱消值水稻材料的方法,其特征在于,该方法包含:
以待检测水稻材料的基因组为DNA模板,采用如权利要求1所述的引物对进行PCR扩增,根据扩增产物判断:
若待检测水稻材料扩增出长度为143bp的条带,则该待检测水稻材料为高碱消值水稻材料;其中,所述高碱消值水稻材料选自广8B、川106B、川康606B、川绿609B、成恢3203、成恢727、IR24、晶4155S和丙4114;
若待检测水稻材料扩增出长度为147bp的条带,则该待检测水稻材料为中碱消值水稻材料1892S;
所述待检测水稻材料选自所述高碱消值水稻材料和中碱消值水稻材料1892S。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述PCR扩增的扩增体系包含:DNA模板、如权利要求1所述的引物对、2×Taq Mix和双蒸水。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述2×Taq Mix包含:PCR buffer、Mg2+、dNTP mixture和Taq酶。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述PCR扩增的程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,30个循环;72℃延伸5min。
6.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述PCR扩增的产物进行凝胶电泳检测。
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