CN111154906A - 适于米粉专用稻筛选的snp功能分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了适于米粉专用稻筛选的SNP功能分子标记及其应用。其中，Wx^g2基因SNP功能分子标记由两对引物组成，该SNP多态性为T/C，位于Wx基因第10外显子第115碱基处；Alk^lASV基因SNP功能分子标记由两对引物组成，多态性为GC/TT，位于Alk基因第8外显子第864、865碱基处。以待检测水稻品系DNA为模板，采用所述SNP功能分子标记引物进行PCR扩增，根据扩增结果可以准确、快速地判断被检水稻样品是否含有Wx^g2和Alk^lASV基因以及含有的Wx^g2和Alk^lASV基因型为纯合或杂合，进而实现对Wx^g2和Alk^lASV基因的分子标记辅助选择，最终能够快速选育米粉专用水稻品种。

Description

适于米粉专用稻筛选的SNP功能分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及用于筛选米粉专用水稻的功能分子标记及其专用SNP功能分子标记的应用，属于米粉专用稻品种选育领域。

背景技术

水稻是中国的第一大粮食作物，水稻生产对于维护我国粮食安全、社会稳定和经济发展有着举足轻重的作用。米粉(rice noodle)作为一种重要的稻米加工产品，以其方便快捷、营养合理、口味丰富等特点成为我国南方地区餐饮业的重要组成部分，广州的“沙河粉”、常德的“金健鲜米粉”、江西的“会昌米粉”等已扬名国内外。除此之外，在东南亚地区(印尼、菲律宾，新加坡)及美国、英国、法国等20多个国家和地区均有着巨大的消费需求和市场。闵军等(2008中国稻米(1):18–20)报道，中国大陆地区每年用于米粉加工的大米约120万吨,占食品加工用米总量的1/3左右。目前，随着米粉产品市场的进一步扩大，米粉专用稻的需求量将越来越大。

米粉稻多为早稻品种，感温性强，目前主要集中分布在江西、湖南、广西、广东、湖北等省份。米粉稻的蒸煮品质虽然较差，但却适宜于加工成米粉，其加工特性主要取决于稻米的直链淀粉含量、胶稠度和糊化温度(碱消值)3项理化指标。一般来说，直链淀粉含量高、胶稠度短有助于米粉加工成粗细均匀，垂直性好，酸度低的米线或粉条；糊化温度高(碱消值低)有助于米线或粉条煮后不糊汤、不断条、不破裂，口感爽滑柔韧，富有弹性。由于米粉具有不易膨胀和糊化的特点，因此相比于普通大米，米粉具有耐消化和促进餐后血糖稳定的功能，具有极高的保健功能。目前，仅有湖南省地方标准《米粉专用稻谷》(DB43/264-2005)对米粉稻的3项理化指标(直链淀粉含量、胶稠度与碱消值)进行了界定。根据该标准，二级以上米粉稻的直链淀粉含量为21-25％、胶稠度为20-40毫米、碱消值为3.0-5.0级。现有的米粉稻育种技术方案是水稻种植收获后，通过测定分析直链淀粉含量、胶稠度和碱消值3个表型指标对杂交后代进行筛选，耗时费力，且工作量巨大。三个表型技术指标中,除直链淀粉含量可以通过仪器进行相对准确的测定,胶稠度和碱消值的测定则易受测定者的操作熟练程度及主观观测标准等因素干扰,试验误差大。此外，米粉稻的杂交选育在早代很难对目标品质性状进行选择(需对后代种子目标性状进行破坏性评价)，而待高代株系稳定后，米粉的理化指标性状又常常丢失，由此导致米粉稻的品种选育周期长且效率不高。因此，亟需研发一种快速、高效、准确、不依赖于表型选择的分子标记辅助选择育种方法。

水稻Wx基因是控制稻米直链淀粉含量和胶稠度的主效基因。Teng Bin等(Molecular breeding,2012(30):583–595)依据表观直链淀粉含量和核酸多态位点，将Wx基因划分为5类常见的功能等位基因，分别为wx、Wx^t、Wx^g1、Wx^g2和Wx^g3，直链淀粉含量表型分别对应于糯(2.1-2.4％)、低(12.1-16.0％)、中(21.7-23.8％)、较高(24.4-25.2％)和高(25.8-26.2％)。Teng Bin等(Starch,2013(65):1069–1077)研究发现不同Wx等位基因对稻米胶稠度的影响表现为：wx(87.3mm)>Wx^g3(75.3mm)>Wx^t(68.7mm)>Wx^g1(42.5mm)>Wx^g2(31.4mm)。引起Wx^g2等位基因与其他Wx等位基因淀粉特性表型差异的核酸序列为第10外显子(Ex10)上的一个T/C突变，Ex10T的表型为较高直链淀粉含量(24.4-25.2％)和硬胶稠度(31.4mm)。因此，只需要检测Ex10的T/C突变就可以判断水稻品系是否携带Wx^g2等位基因。水稻Alk基因是控制稻米糊化温度的主效基因。Bao Jinsong等(Theoretical and AppliedGenetics 2006(113)1171–1183)采用连锁不平衡分析方法证明了位于Alk基因Ex8上的2个SNP(即GC/TT)与糊化温度高度相关，GC等位基因(Alk^lASV)的表型为低、中碱消值，TT等位基因(Alk^hASV)则为高碱消值。目前，Wx^g2和Alk^lASV基因间是否存在互作还尚不清楚，但可尝试通过分子标记辅助选择Wx^g2和Alk^lASV基因，快速实现米粉稻新品种的选育。

Chen Ming-Hsuan等(Mol Breeding(2010)26:513-523)应用等位基因特异PCR(Allele-specific PCR,AS-PCR)方法对Wx基因Ex10上的T/C基因型进行了分型；BaoJinsong等(Theoretical and Applied Genetics 2006(113)1171–1183)应用两对交叉引物PCR(PCR-PCPP)技术进行了Alk基因GC/TT功能标记的开发。但是，由于Chen等(2010)的AS-PCR标记对Taq酶有特定要求(需Tfl polymerase，普通Taq酶无法有效扩增)，且PCR反应程序步骤烦琐，所以使用起来存在费用昂贵、PCR耗时长、扩增效果不稳定的弊端。BaoJinsong等(Theoretical and Applied Genetics2006(113)1171–1183)开发的PCR-PCPP功能标记需4条引物，在同一PCR体系中引物较多，引物浓度要求严格，容易产生不同引物的非特异性扩增，使用起来存在扩增效果不稳定的问题。

基于上述原因，需要开发一套新的基于AS-PCR技术的用于检测Wx基因Ex10T/C和Alk基因Ex8GC/TT突变位点的SNP功能分子标记，对水稻Wx^g2和Alk^lASV等位基因进行快速、准确、经济、简单、稳定的鉴定。

发明内容

本发明的目的之一是提供水稻Wx^g2基因和Alk^lASV基因的SNP功能分子标记；

本发明的目的之二是提供扩增所述水稻Wx^g2基因或Alk^lASV基因的SNP功能分子标记的引物组；

本发明的目的之三是将所述的SNP功能分子标记或所述的引物组应用于选育米粉稻新品种。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明首先提供了水稻Wx^g2基因的SNP功能分子标记以及水稻Alk^lASV基因的SNP功能分子标记；所述水稻Wx^g2基因的SNP功能分子标记为T/C多态，Wx^g2基因为T基因型，T/C多态位点位于Wx基因第10外显子第115碱基处；所述水稻Alk^lASV基因的SNP功能分子标记为GC/TT多态，Alk^lASV基因为GC基因型，GC/TT多态位点位于Alk基因第8外显子第864、865碱基处。

本发明还提供了扩增所述水稻Wx^g2基因的SNP功能分子标记的引物组，该引物组由引物对Wx-P_T和引物对Wx-P_C组成；其中引物对Wx-P_T和引物对Wx-P_C的前引物为通用前引物Wx-F10，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示；引物对Wx-P_T的后引物的核苷酸序列为SEQ IDNo.2所示；引物对Wx-P_C的后引物的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。

本发明还进一步提供了扩增所述水稻Alk^lASV基因的SNP功能分子标记的引物组，该引物组由引物对Alk-P_GC和引物对Alk-P_TT组成；其中，引物对Alk-P_GC和引物对Alk-P_TT的后引物为通用后引物Alk-R，其核苷酸序列为SEQ ID No.6所示；引物对Alk-P_GC的前引物的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示；引物对Alk-P_TT的前引物的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示。

本发明所提供的SNP功能分子标记以及扩增所述SNP功能分子标记的引物组可应用于选育米粉稻新品种；其中，所述米粉稻新品系是同时携带有Wx^g2和Alk^lASV双纯合基因的水稻新品系。

进一步的，本发明提供了应用扩增水稻Wx^g2基因的SNP功能分子标记的引物组检测水稻中是否含有Wx^g2基因以及Wx^g2基因是纯合还是杂合的方法，包括：

(1)以待测水稻材料的基因组DNA为模板，用权利要求3所述的引物组进行PCR扩增；

(2)Wx^g2基因SNP功能分子标记扩增产物的鉴定：如引物对Wx-P_T扩增产物产生条带，引物对Wx-P_C扩增产物不产生条带，则待测水稻含有Wx^g2基因，且Wx^g2基因型为纯合；如引物对Wx-P_T扩增产物不产生条带，引物对Wx-P_C扩增产物产生条带，则待测水稻不含有Wx^g2基因；如引物对Wx-P_T和Wx-P_C扩增产物均产生条带，则待测水稻含有Wx^g2基因，Wx^g2的基因型为杂合。

其中，Wx-P_T和Wx-P_C引物对的扩增产物长度分别为140bp和135bp。

更进一步的，本发明提供了应用扩增水稻Alk^lASV基因的SNP功能分子标记的引物组检测水稻中是否含有Alk^lASV基因以及Alk^lASV基因是纯合还是杂合的方法，其特征在于，包括：

(1)以待测水稻材料的基因组DNA为模板，用权利要求4所述的引物组进行PCR扩增；

(2)Alk^lASV基因SNP功能分子标记扩增产物的鉴定：如引物组Alk-P_GC扩增产物产生条带，引物Alk-P_TT组扩增产物不产生条带，则待测水稻含有Alk^lASV基因，且Alk^lASV基因型为纯合；如引物组Alk-P_GC扩增产物不产生条带，引物Alk-P_TT组扩增产物产生条带，则待测水稻不含有Alk^lASV基因；如引物组Alk-P_GC和Alk-P_TT扩增产物均产生条带，则待测水稻含有Alk^lASV基因，Alk^lASV的基因型为杂合。

其中，Alk-P_GC和Alk-P_TT引物组的扩增产物长度分别为186bp和193bp。

本发明通过SNP分子功能标记辅助聚合水稻Wx^g2和Alk^lASV基因，可选育到具有米粉稻淀粉特性的水稻品系，具有不依赖于表型选择、快速、准确、经济、简单、稳定等优点；相比于传统的依赖于淀粉表型选择的米粉稻育种技术方案，本发明方法于早代(F₂、BC₁F₁代)起通过SNP分子功能标记对目标性状基因进行选择，从而无需对早代种子的淀粉特性进行破坏性评价。此外，相比于以往开发的AS-PCR和PCR-PCPP功能标记，本发明的Wx^g2和Alk^lASV基因SNP功能分子标记对Taq酶无特定要求，PCR扩增反应条件无需优化，操作简单、扩增结果稳定、更易于推广应用。

附图说明

图1Wx-P_T(A)和Wx-P_C(B)标记引物序列及SNP位点在Wx基因序列中的位置。方框为引入的错配碱基及位置；***表示人为引入的错配碱基

图2Alk-P_GC(A)和Alk-P_TT(B)标记引物序列及SNP位点在Alk基因序列中的位置。方框为引入的错配碱基及位置；**表示人为引入的错配碱基

图3Wx^g2(A)和Alk^lASV(B)基因SNP功能分子标记在部分水稻亲本及杂交F₁中PCR扩增结果。注：M,标准分子量(100bp)；P1,华粳籼74；P2,早籼14；P1×P2,华粳籼74/早籼14

图4应用Wx^g2和Alk^lASV基因SNP功能分子标记杂交选育米粉稻的示意图

图5应用Wx^g2和Alk^lASV基因SNP功能分子标记回交选育米粉稻的示意图

图6应用SNP功能分子标记快速度检测Wx^g2和Alk^lASV基因；A、应用Wx-P_T标记快速检测Wx^g2基因。注：M,标准分子量(100bp)；1,IR64；2,Basmati370；3,IAPAR9；4,华粳籼74；5,珍桂矮1号；6,扬稻6号；7,Zihui100；8,1892S；9,Y58S；10,IR8。B、应用Alk-P_GC标记快速检测Alk^lASV基因。注：M,标准分子量(100bp)；1,华占；2,IR64；3,南洋占；4,OM052；5,蜀恢527；6,晚粳117；7,华粳籼74；8,1892S；9,Y58S；10,IAPAR9；11,晚粳W328；12,早籼14。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1水稻Wx^g2基因的SNP功能分子标记的鉴定

所述水稻基因为Wx^g2；所述SNP为T/C多态，Wx^g2基因为T基因型，C/A多态位点位于Wx基因第10外显子第115碱基处，其核苷酸序列为图1所示。

实施例2检测Wx基因Ex10T/C多态SNP分子标记的引物组的筛选

为了检测T/C多态，采用等位基因特异PCR(AS-PCR)方法进行设计(图1)。将T/CSNP位点设为后引物3’端的互补碱基，通过在后引物3’端引入1至3个错配碱基设计特异识别T或C位点的反向引物，2个后引物的前引物为相同引物。本发明设计的用于筛选T/C多态的错配引物序列见表1。如表1所示，T-9后引物和Wx-F10前引物可以扩增特异T基因型模板，不能扩增C基因型模板；C-3后引物和Wx-F10前引物可以特异扩增C基因型模板，不能扩增T基因型模板。

表1用于筛选Wx基因Ex10T/C多态位点的后引物序列

注：人为引入的错配碱基用下划线突出表示；筛选Ex10T/C多态位点的前引物序列为Wx-F10

(TCAGGCAATCGAGGCGAAG)。

在上述研究基础上，将用于检测T/C多态的两对引物组，分别命名为Wx-P_T和Wx-P_C；两组前引物共用的前引物命名为Wx-F10。

Wx-P_T和Wx-P_C引物组的通用前引物Wx-F10核苷酸序列为：

Wx-F10：TCAGGCAATCGAGGCGAAG(SEQ ID No.1)

Wx-P_T引物组后引物Wx-R_T核苷酸序列为：

Wx-R_T：TGGCGGCGGCCATGACGTCGTA(SEQ ID No.2)

Wx-P_C引物组后引物Wx-R_C核苷酸序列为：

Wx-R_C：GCGGCCATGACGTAGGG(SEQ ID No.3)。

实施例3水稻Alk^lASV基因的SNP功能分子标记的鉴定

所述水稻基因为Alk^lASV；所述SNP为GC/TT多态，Alk^lASV基因为GC基因型，GC/TT多态位点位于Alk基因第8外显子第864、865碱基处，其核苷酸序列如图2所示。

实施例4用于检测Alk基因Ex8GC/TT多态SNP分子标记的引物组的筛选

为了检测GC/TT多态，采用等位基因特异PCR(AS-PCR)方法进行设计(图2)。以GC/TT SNP位点为前引物3’端，通过在前引物3’端引入1至2个错配碱基设计特异识别GC或TT位点的前引物，2个前引物的后引物为相同引物。本发明设计的用于筛选GC/TT多态的错配引物序列见表2。如表2所示，H6前引物和Alk-R后引物可以特异扩增GC基因型模板，不能扩增TT基因型模板；L5前引物和Alk-R后引物可以扩增特异TT基因型模板，不能扩增GC基因型模板。

表2用于筛选Alk基因Ex8GC/TT多态位点的前引物序列

注：人为引入的错配碱基用下划线突出表示；筛选Ex8GC/TT多态位点的后引物序列为Alk-R(GCCAAGCTTCTTCAGGGAGG)。

在上述研究基础上，将用于检测GC/TT多态的两对引物组，分别命名为Alk-P_GC和Alk-P_TT；两组前引物共用的前引物命名为Alk-R。

Alk-P_GC引物组前引物Alk-F_GC核苷酸序列为：

Alk-F_GC：AAGGAGAGCTGGAGGTGGC(SEQ ID No.4)

Alk-P_TT引物组前引物Alk-F_TT核苷酸序列为：

Alk-F_TT：CAAGTACAAGGAGAGCTGGAGGCTTT(SEQ ID No.5)

Alk-P_GC和Alk-P_TT引物组的通用后引物Alk-R核苷酸序列为：

Alk-R：GCCAAGCTTCTTCAGGGAGG(SEQ ID No.6)

试验例1水稻Wx^g2和Alk^lASV基因SNP功能分子标记在检测水稻中是否含有Wx^g2基因以及Wx^g2基因是纯合还是杂合的应用试验

(1)基因组DNA提取

CTAB法提取水稻基因组DNA。剪取水稻材料幼嫩叶片100-200mg，移入2.0mL离心管中，向离心管中加液氮用玻棒充分研磨至粉末状，再加入700μL 65℃预热的DNA提取液(81.7g NaCl和20g CTAB充分溶于适量水中，然后加入1mol/L Tris-HCl 100mL，0.5mol/LEDTA 40mL，定容至1000mL)，65℃孵育40min，每隔10min颠倒混匀一次；加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，剧烈摇晃20次，室温静置5min；13,000rpm离心5min，吸取550μL上清液移至1.5mL离心管中，再加入900μL-20℃无水乙醇混匀，置于4℃90min；13,000rpm离心10min，弃上清，晾干后，加入200μL灭菌超纯水，充分溶解后置于4℃备用。

(2)PCR扩增

以待测水稻材料的基因组DNA为模板，分别用引物组Wx-P_T、Wx-P_C、Alk-P_GC和Alk-P_TT进行PCR扩增，扩增体系中各组分配见表3。

表3 PCR反应体系

注：反应体积可选择在10-50μL之间，模板DNA原浓度在20-200ng/μL之间。

扩增条件为：反应程序为：95℃变性5min后，94℃30S，退火温度(Wx-P_T,60℃；Wx-P_C,60℃；Alk-P_GC,62℃；Alk-P_TT,62℃)30S，72℃30S，循环35次，72℃延伸5min，4℃保温。扩增产物采用2.0％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

(3)Wx^g2和Alk^lASV基因的检测验证

利用Wx-P_T和Wx-P_C SNP功能分子标记分别对Wx^g2基因纯合体、杂合体和不含Wx^g2基因品系进行扩增。扩增结果为图3A所示，Wx-P_T和Wx-P_C功能标记的扩增产物长度分别为140bp和135bp。如Wx-P_T标记扩增产物产生条带，Wx-P_C标记扩增产物不产生条带，则待测水稻含有Wx^g2基因，且Wx^g2基因型为纯合；进一步的，如Wx-P_T标记扩增产物不产生条带，Wx-P_C标记扩增产物产生条带，则待测水稻不含有Wx^g2基因；进一步的，如Wx-P_T和Wx-P_C标记扩增产物均产生条带，则待测水稻含有Wx^g2基因，且Wx^g2的基因型为杂合。

利用Alk-P_GC和Alk-P_TT SNP功能分子标记分别对Alk^lASV基因纯合体、杂合体和不含Alk^lASV基因品系进行扩增。扩增结果为图3B所示，Alk-P_GC和Alk-P_TT功能标记的扩增产物长度分别为186bp和193bp。如Alk-P_GC标记扩增产物产生条带，Alk-P_TT标记扩增产物不产生条带，则待测水稻含有Alk^lASV基因，且Alk^lASV基因型为纯合；进一步的，如Alk-P_GC标记扩增产物不产生条带，Alk-P_TT标记扩增产物产生条带，则待测水稻不含有Alk^lASV基因；进一步的，如Alk-P_GC和Alk-P_TT标记扩增产物均产生条带，则待测水稻含有Alk^lASV基因，且Alk^lASV的基因型为杂合。

试验例2应用SNP功能分子标记杂交选育米粉稻

选育原理：通过杂交选育方法，将Wx^g2和Alk^lASV基因聚合在一起。选择生产上推广的分别带有Wx^g2和Alk^lASV基因的高产、抗病水稻品种为亲本杂交获得F₁杂交种子。F₁代种植，收获F₂种子。从F₂代起，采用分子标记辅助选择的方法将Wx^g2和Alk^lASV基因聚合到同一水稻品系中，上诉开发的4种SNP功能标记的筛选顺序可随机确定，下面以其中的一种标记组合顺序对试验方案流程进行说明(图4)。

第1步，选取若干(具体数目根据育种目标确定)F₂单株进行目标基因检测，先采用Wx-P_T标记进行单株选择，获得携有Wx^g2基因的株系，再对获选单株用Wx-P_C标记进行单株选择，淘汰可扩增出条带(即Wx^g2基因型为杂合，还带有其他Wx等位基因)的单株，选择到携带有Wx^g2纯合基因的株系；

第2步，中选的携有Wx^g2纯合基因单株，先采用Alk-P_GC标记进行单株选择，获得携有Alk^lASV基因的株系，再对获选单株用Alk-P_TT标记进行单株选择，淘汰可扩增出条带(即Alk^lASV基因型为杂合，还带有Alk^hASV基因)的单株，最终选择到同时携带有Wx^g2和Alk^lASV双纯合基因的新品系。

具体选育实例：

按图4所示米粉稻杂交选育路线，聚合Wx^g2和Alk^lASV基因。选择携有Wx^g2基因的珍桂矮1号与携有Alk^lASV基因水稻品种早籼14杂交，获得F₁种子。F₁代种植，收获F₂种子。从F₂代起，采用分子标记辅助选择的方法将Wx^g2和Alk^lASV基因聚合到同一水稻品系中。第1步，选取60个F₂单株进行目标基因检测，先采用Wx-P_T标记进行单株选择，筛选到46株携有Wx^g2基因的株系，再对46个获选单株用Wx-P_C标记进行选择，淘汰可扩增出条带(即Wx^g2基因型为杂合型)的单株，选择到17个携带有Wx^g2纯合基因的株系；第2步，中选的17个携有Wx^g2纯合基因单株，先采用Alk-P_GC标记进行单株选择，筛选到12个携有Alk^lASV基因的株系，再对12个获选单株用Alk-P_TT标记进行单株选择，淘汰可扩增出条带(即Alk^lASV基因型为杂合，还带有Alk^hASV基因)的单株，最终选择到5个同时携带有Wx^g2和Alk^lASV双纯合基因的新品系；收获5个F₂中选单株的稻谷经测定，稻米胶稠度、直链淀粉及碱消值各项指标均达到米粉稻的淀粉特性标准(表4)。

表4水稻F₂中选单株的稻米胶稠度、直链淀粉及碱消值

试验例3 SNP功能分子标记回交选育米粉稻

选育原理：采用回交选育方法，将Alk^lASV或Wx^g2基因转入到需要改良的水稻受体亲本中。本发明以对携有Wx^g2基因的水稻品种进行回交改良为例，对回交过程中利用SNP分子功能标记辅助选择Alk^lASV基因进行说明，回交试验方案如图5所示。选择生产上推广的携有Wx^g2基因的高产、抗病的水稻品种为母本(受体)与含有Alk^lASV基因的水稻品系杂交获得F₁杂交种子。从BC₁F₁代起，选取10个左右单株进行代换片段检测，采用Alk-P_GC单标记在BC₁F₁进行单株选择，获选单株继续回交产生BC₂F₁代；BC₂F₁代选取10个单株用于继续进行Alk-P_GC标记检测，根据结果，选取单株继续回交产生BC₃F₁；BC₃F₁代选取10个单株继续进行Alk-P_GC单标记检测，根据结果，选取单株继续回交产生BC₄F₁；BC₄F₁代自交，BC₄F₂代选取10个单株进行Alk-P_GC、Alk-P_TT、Wx-P_T和Wx-P_C四标记检测，最终选择到携有Wx^g2和Alk^lASV双纯合基因的改良株系。

具体选育实例：

按图5所示的分子标记辅助选育路线进行，选择不含Alk^lASV基因的华粳籼74(直链淀粉含量为25.0％、胶稠度为32毫米、碱消值为7.0)与携有Alk^lASV基因水稻品种早籼14(碱消值为3.0)杂交，获得F₁种子；播种F₁和华粳籼74，以华粳籼74为轮回亲本，抽穗期完成杂交种F₁与华粳籼74的回交，获回交一代BC₁F₁种子；播种BC₁F₁和华粳籼74号，从BC₁F₁代起，选取10个单株，利用Alk-P_GC标记进行代换片段检测，选择到携Alk^lASV基因BC₁F₁单株，抽穗期获选BC₁F₁单株与华粳籼74回交，获回交二代BC₂F₁种子；播种BC₂F₁和华粳籼74，选取10个单株继续进行Alk-P_GC标记检测，选择到携Alk^lASV基因BC₂F₁单株，继续与华粳籼74回交产生BC₃F₁；播种BC₃F₁和华粳籼74，选取10个单株继续进行Alk-P_GC标记检测，选择到携Alk^lASV基因BC₃F₁单株，继续与华粳籼74回交产生BC₄F₁；BC₄F₁代自交，收获BC₄F₂种子，BC₄F₂代进行Alk-P_GC、Alk-P_TT、Wx-P_T和Wx-P_C四标记检测，选择到携有Wx^g2和Alk^lASV双纯合基因的华粳籼74改良后单株。收获改良型华粳籼74(HJX74^lASV)种子，HJX74^lASV稻米的直链淀粉含量、胶稠度和碱消值经测定分别为25.3％、34毫米和3.5，符合并达到米粉稻的稻米淀粉特性标准。

试验例4应用Wx-P_T标记对水稻种质资源进行Wx^g2基因检测

以水稻品系IR64、Basmati370、IAPAR9、华粳籼74、珍桂矮1号、扬稻6号、Zihui100、1892S、Y58S、IR8为试验材料。提取这些水稻材料的DNA，利用Wx^g2基因SNP功能标记中的Wx-P_T引物对Wx^g2基因进行快速鉴定。PCR扩增结果见图6A，可以看出：华粳籼74、珍桂矮1号、Zihui100和IR8携带有Wx^g2基因；IR64、Basmati370、IAPAR9、扬稻6号、1892S和Y58S没有携带Wx^g2基因。

试验例5应用Alk-P_GC标记对水稻种质资源进行Alk^lASV基因检测

以水稻品系华占、IR64、南洋占、OM052、蜀恢527、晚粳117、华粳籼74、1892S、Y58S、IAPAR 9、晚粳W328、早籼14为试验材料。提取这些水稻材料的DNA，利用Alk^lASV基因SNP功能标记中的Alk-P_GC标记对Alk^lASV基因进行快速鉴定。PCR扩增结果见图6B，可以看出：华占、IR64、南洋占、1892S、IAPAR9和早籼14携带有Alk^lASV基因；OM052、蜀恢527、华粳籼74、Y58S、晚粳117和晚粳W328没有携带Alk^lASV基因。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽省农业科学院水稻研究所

<120> 适于米粉专用稻筛选的SNP功能分子标记及其应用

<130> AH-2001-190914A

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 1

tcaggcaatc gaggcgaag 19

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 2

tggcggcggc catgacgtcg ta 22

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 3

gcggccatga cgtaggg 17

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 4

aaggagagct ggaggtggc 19

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 5

caagtacaag gagagctgga ggcttt 26

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 6

gccaagcttc ttcagggagg 20

Claims (10)

1.水稻Wx^g2基因的SNP功能分子标记，其特征在于，该SNP为T/C多态，Wx^g2基因为T基因型，T/C多态位点位于Wx基因第10外显子第115碱基处。

2.水稻Alk^lASV基因的SNP功能分子标记，其特征在于，该SNP为GC/TT多态，Alk^lASV基因为GC基因型，GC/TT多态位点位于Alk基因第8外显子第864、865碱基处。

3.扩增权利要求1所述水稻Wx^g2基因的SNP功能分子标记的引物组，其特征在于，由引物对Wx-P_T和引物对Wx-P_C组成；其中，引物对Wx-P_T和引物对Wx-P_C的前引物为通用前引物Wx-F10，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示；引物对Wx-P_T的后引物的核苷酸序列为SEQ IDNo.2所示；引物对Wx-P_C的后引物的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。

4.扩增权利要求2所述水稻Alk^lASV基因的SNP功能分子标记的引物组，其特征在于，由引物对Alk-P_GC和引物对Alk-P_TT组成；其中，引物对Alk-P_GC和引物对Alk-P_TT的后引物为通用后引物Alk-R，其核苷酸序列为SEQ ID No.6所示；引物对Alk-P_GC的前引物的核苷酸序列为SEQID No.4所示；引物对Alk-P_TT的前引物的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示。

5.权利要求1或2所述的SNP功能分子标记在选育米粉稻新品系中的应用，或权利要求3或4所述的引物组在选育米粉稻新品系中的应用。

6.按照权利要求5所述的应用，其特征在于，所述米粉稻新品系是同时携带有Wx^g2和Alk^lASV双纯合基因的水稻新品系。

7.应用权利要求3所述的引物组检测水稻中是否含有Wx^g2基因以及Wx^g2基因是纯合还是杂合的方法，其特征在于，包括：

(1)以待测水稻材料的基因组DNA为模板，用权利要求3所述的引物组进行PCR扩增；

(2)Wx^g2基因SNP功能分子标记扩增产物的鉴定：如引物对Wx-P_T扩增产物产生条带，引物对Wx-P_C扩增产物不产生条带，则待测水稻含有Wx^g2基因，且Wx^g2基因型为纯合；如引物对Wx-P_T扩增产物不产生条带，引物对Wx-P_C扩增产物产生条带，则待测水稻不含有Wx^g2基因；如引物对Wx-P_T和Wx-P_C扩增产物均产生条带，则待测水稻含有Wx^g2基因，Wx^g2的基因型为杂合。

8.按照权利要求7所述的应用，其特征在于：Wx-P_T和Wx-P_C引物对的扩增产物长度分别为140bp和135bp。

9.应用权利要求4所述的引物组检测水稻中是否含有Alk^lASV基因以及Alk^lASV基因是纯合还是杂合的方法，其特征在于，包括：

(1)以待测水稻材料的基因组DNA为模板，用权利要求4所述的引物组进行PCR扩增；

(2)Alk^lASV基因SNP功能分子标记扩增产物的鉴定：如引物组Alk-P_GC扩增产物产生条带，引物Alk-P_TT组扩增产物不产生条带，则待测水稻含有Alk^lASV基因，且Alk^lASV基因型为纯合；如引物组Alk-P_GC扩增产物不产生条带，引物Alk-P_TT组扩增产物产生条带，则待测水稻不含有Alk^lASV基因；如引物组Alk-P_GC和Alk-P_TT扩增产物均产生条带，则待测水稻含有Alk^lASV基因，Alk^lASV的基因型为杂合。

10.按照权利要求9所述的应用，其特征在于，Alk-P_GC和Alk-P_TT引物组的扩增产物长度分别为186bp和193bp。

Images