CN111621591B - 一种用于检测水稻碱消值的分子标记及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测水稻碱消值的分子标记及检测方法。该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2和/或SEQ ID NO.3～4所示。本发明研究发现位于4329/4330bp的功能SNP位点GC/TT以及位于启动子区域‑741bp处9个碱基缺失与碱消值相关，会影响支链淀粉的侧链结构，因此获得最优的ALK等位基因，开发快速、准确、检测成本低的功能标记是开展碱消值分子设计育种的重要保障和途径。

Description

一种用于检测水稻碱消值的分子标记及检测方法

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种用于检测水稻碱消值的分子标记及检测方法。

背景技术

水稻是世界上最重要的三大粮食作物之一，是全球一半以上人口赖以生存的基本食粮。然而随着经济的发展，城镇化进程的持续推进，我国国民生活水平的不断改善，消费者对稻米品质的要求也与日俱增。水稻品质改良育种是适应当前市场的迫切需求，已经成为最主要的育种改良目标之一。根据农业农村部颁布的米质评价标准，主要包括糙米率、整精米率、垩白度、透明度、碱消值、胶稠度、支链淀粉。碱消值已经是仅次于垩白度的评价水稻品质的重要指标，直接与蒸煮食味品质相关，低碱消值是限制优质杂交水稻选育的重要限制因素(Gao et al.2003,Gao et al.2011,Yu et al.2011)。碱消值是由一个主效基因控制，多个微效基因共同调控的复性状。在水稻育种选育过程中，难以通过常规的方法进行选择，而且其测定方法较为复杂。而现有分子标记筛选方法则是存在成本高，特异性较差的问题。

通过优良种质资源筛选与鉴定，设计目标基因优良单倍体型的功能标记，在较早世代开展分子标记选择，鉴定不同的等位基因型，有利于开展稻米品质改良育种。因此，亟需设计一种特异性好，且成本低的筛选方法。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种用于检测水稻碱消值的分子标记及检测方法，本申请通过对片段代换系群体的大量筛选，获得了一个水稻碱消值优异的资源材料及其ALK等位基因的分子标记方法。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种用于检测水稻碱消值的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2和/或SEQID NO.3～4所示，具体序列如下：

ZT125F：ACTAGCGACTATGGTTTGTG；(SEQ ID NO.1)

ZT125R：ATACAGGTAGAATGGCAGTG；(SEQ ID NO.2)

ZT140F：GAGCCGTGCGGCCTCAACCA；(SEQ ID NO.3)

ZT140R：CCTGCGACATGCCGCGCACCTGGAT；(SEQ ID NO.4)

其中，ZT125F/R用于鉴定启动子区域-741bp处9个碱基缺失差异；ZT140F/R用于鉴定第8外显子4329/4330bp处的功能位点GC/TT差异。可以以ZT125F/R或ZT140F/R单独作为分子标记，也可以将两者结合起来一同作为分子标记使用。

一种检测水稻碱消值的分子标记方法，包括以下步骤：

(1)采用CTAB法提取待测水稻DNA；

(2)用权利要求2所述引物对水稻DNA进行PCR扩增，分别获得包含ALK基因启动子和第8外显子的相应片段；

(3)酶切含有第8外显子的扩增产物，然后分别对酶切产物和包含ALK基因启动子的扩增产物进行电泳检测，经条带分析辨别对应水稻材料ALK基因型。

进一步地，PCR反应体系为10μL 2×PCR mix、2μL 10mM前引物、2μL 10mM后引物、2μL模板DNA，4μL ddH₂O。

进一步地，PCR反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s；56℃退火30s；72℃退火30s；共32个循环，72℃延伸5min；4℃延伸1min。

一种用于检测水稻碱消值的试剂盒，包括上述引物。

上述分子标记在改良水稻碱消值培育优质水稻品种中的应用。

一种用于改良水稻碱消值培育优质水稻的基因芯片，包括上述分子标记。

本发明的有益效果为：

鉴定到了改良水稻碱消值的优异种质资源，同时开发ALK优异等位基因的分子标记方法及其专用dCAPS引物。相比之前开发的dCAPS引物，常用限制性内切酶BamHⅠ的使用可准确、低成本的检测水稻品种或育种材料中ALK基因的等位基因类型，便于ALK优异等位基因在水稻育种上的应用。

本发明研究发现位于4329/4330bp的功能SNP位点GC/TT以及启动子区域-741bp处9个碱基缺失与碱消值相关，会影响支链淀粉的侧链结构。因此获得最优的ALK等位基因，开发快速、准确、检测成本低的功能标记是开展碱消值分子设计育种的重要保障和途径。

附图说明

图1为ALK基因-741bp处9个碱基缺失导致启动子活性降低；

图2为Q1182植株农艺性状表型；

图3为启动子区域-741bp处9个碱基缺失差异PCR扩增示意图及部分核心种质资源PCR产物凝胶电泳图；

图4为第8外显子4329/4330bp处的功能位点GC/TT PCR产物酶切示意图及部分核心种质资源凝胶电泳图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1检测启动子-741bp处9个碱基缺失对ALK启动子活性的影响

首先通过QPCR对获得的碱消值优异资源材料Q1882以及其对照水稻品种R498受精后15天的颖果中ALK的表达量开展检测。包括以下步骤：

(1)颖果RNA提取：RNA提取采用TRIzol试剂提取(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)；

(2)cDNA合成：依照SuperScript II(Invitrogen)cDNA合成试剂盒开展；

(3)qPCR定量检测RNA：qPCR反应通过qTOWER3G Real-Time System定量PCR分析仪开展(Analytik Jena,Germany)，使用ALK基因内部特异的引物。

其结果见图1，实验结果表明9个碱基缺失降低了ALK的转录水平图。

ALK基因起始密码子上游1.58kb的启动子片段分别从Q1882及对照水稻品种R498中扩增出来，并进一步构建到luciferase(firefly,Photinus pyralis)报告质粒中(Pcambia1300-35S-LUC)；

构建好的质粒与含有35S启动子启动的Renillain报告质粒(Pcambia1300-35S-RLUC)同时在烟草中瞬时表达，转化的烟草在放置24小时后，通过Biorad成像系统拍照，同时荧光素酶活性通过Beyotime Dual Luciferase Reporter Gene检测试剂盒测定，实验按照说明书的步骤进行，其结果见图1。

如图1所示，图中A为R498与片段代换系Q1882受精后15天颖果中ALK的表达量检测及成熟种子品质性状检测；B为R498与Q1882型ALK启动子启动荧光素酶活性检测；C为B荧光素酶活性的定量数据，其R498启动子活性高于Q1882型；根据图1的检测结果可知，9个碱基缺失降低了ALK的启动子的活性。

实施例2优异种质资源Q1882鉴定与主要农艺性状考察

种质资源Q1882鉴定，包括以下步骤：

1、启动子区域-741bp处9个碱基缺失差异的分子检测，启动子9bp缺失的功能分子标记包含以下两条引物：

正向引物ZT125F：ACTAGCGACTATGGTTTGTG；

反向引物ZT125R：ATACAGGTAGAATGGCAGTG

采用该方法，ALK启动子差异可以根据PCR产物大小区别开，Q1882扩增DNA产物为70bp，而R498扩增DNA产物为79bp，凝胶电泳图如图3所示，图3中A为9个碱基缺失示意图；B为设计的Indel多态性分子标记检测R498与Q1882及其杂交种的凝胶电泳图；C为设计的Indel多态性分子标记检测部分种子资源群体的凝胶电泳图。

2、第8外显子4329/4330bp处的功能位点GC/TT差异的分子检测，所用引物具体序列如下所示：

ZT140F：GAGCCGTGCGGCCTCAACCA；

ZT140R：CCTGCGACATGCCGCGCACCTGGAT；

采用该方法，第8外显子4329/4330bp处的功能位点GC/TT差异可以根据PCR酶切产物大小区别开，Q1882(ALK^TT)的DNA产物为240bp，而Q1627(ALK^GC)扩增DNA产物为225bp，凝胶电泳图如图4所示。如图4所示，图4中A为新开发dCAPs分子标记示意图；B为设计的dCAPs多态性分子标记的凝胶电泳图；C为设计的dCAPs多态性分子标记检测部分种子资源群体的凝胶电泳图。根据图4的检测结果可知，Q1882为启动子缺失9个bp，第8外显子为高碱消值TT基因型亲本材料。

3、优异种质资源Q1882的农艺性状考察

在种子完全成熟后，每个小区取中间5株，考察农艺性状，包括：株高、有效穗数、穗长、千粒重、粒长、粒宽等，其中千粒重、粒长、粒宽采用万深考种仪进行分析。采用Excel2010进行数据处理和t检验等，结果如图2所示，图2中A为R498与Q1882二者植株形态对比图；B为穗部与粒型对比图；C为主要农艺性状考种数据；D为R498与Q1882株高、穗长、粒长、粒宽和千粒重检测对比数据。

实施例3利用分子标记检测151个水稻核心种质亲本材料的ALK等位基因类型

1、检测151个水稻核心种质亲本材料的ALK等位基因类型的具体过程如下：

(1)通过CTAB法提取水稻植株DNA物质；

(2)用设计的多态性分子标记通过PCR扩增分别获得包含ALK基因启动子和第8外显子相应目标片段；

(3)对于包含8外显子部分序列的PCR产物进行限制性内切酶处理；

(4)对上述酶切产物以及启动子序列扩增产物进行凝胶电泳检测，经条带分析辨别对应水稻材料ALK基因型。

其中，PCR反应体系为20μL，具体包括10μL 2×PCR mix、2μL 10mM ZT125F orZT140F、2μL 10mM ZT125R or ZT140R、2μL模板DNA、4μL ddH₂O。

PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s；56℃退火30s；72℃退火30s；共32个循环，72℃延伸5min；4℃延伸1min。

酶切体系为10μL，具体包括3μL PCR扩增产物，0.5μL BamHⅠ、1μL10×酶切缓冲液、5.5μL ddH₂O。然后于37℃酶切4小时。

2、结果与分析

151个水稻亲本品种的分子标记的基因分型检测详见图3、图4。由图3可见：ALK启动子差异可以根据PCR产物大小区别开，Q1882扩增DNA产物为70bp，而R498扩增DNA产物为79bp，凝胶电泳图如图4所示；第8外显子4329/4330bp处的功能位点GC/TT差异可以根据PCR酶切产物大小区别开，Q1882(ALK^TT)的DNA产物为240bp，而Q1627(ALK^GC)扩增DNA产物为225bp，凝胶电泳图如图4所示。

实施例4检测151份水稻亲本材料ALK等位基因型，并结合检测材料的表型

根据ALK基因第8外显子4329bp处GC→TT的变异以及启动子区域9bp的缺失是影响碱消值的关键因素。

本发明设计用启动子区域-741bp处9个碱基缺失差异的分子标记以及第8外显子4329/4330bp处的功能位点GC/TT的分子标记，鉴定收集的151份水稻核心种质资源亲本材料进行检测，部分检测结果见图3及图4。同时对相应的亲本材料进行碱消值的测定，并与分子标记的检测结果进行联合统计，统计结果见表1。

根据表1数据可知，碱消值高于5.5的水稻亲本为TT型，碱消值低于5.5的水稻亲本材料为GC。同时，GC型中启动子区域-741bp处9个碱基缺失能显著增加碱消值，本申请可应用于水稻品种高效准确的分子，大大节约时间和工作量。

表1水稻亲本材料碱消值检测

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种用于检测水稻碱消值的分子标记及检测方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

actagcgact atggtttgtg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atacaggtag aatggcagtg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagccgtgcg gcctcaacca 20

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cctgcgacat gccgcgcacc tggat 25

Claims (7)

1.一种引物在用于检测水稻碱消值的分子标记中的用途，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1~2所示；所述分子标记位于ALK基因启动子区域-741bp处，存在9个碱基缺失，缺失碱基为TTAGAGCTA。

2.一种检测水稻碱消值的分子标记方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待测水稻DNA；

（2）用权利要求1所述的引物对水稻DNA进行PCR扩增，获得包含ALK基因启动子的相应片段；

（3）对包含ALK基因启动子的扩增产物进行电泳检测即可，若ALK基因启动子-741bp处存在9个碱基缺失，则其碱消值增加，反之则减少，缺失碱基为TTAGAGCTA。

3.根据权利要求2所述的分子标记方法，其特征在于，所述PCR反应体系为10μL 2×PCRmix、2μL 10mM前引物、2μL 10mM后引物、2μL 模板DNA，4 μL ddH₂O。

4.根据权利要求2所述的分子标记方法，其特征在于，所述PCR反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s；56℃退火30s；72℃退火30s；共32个循环，72℃延伸5min；4℃延伸1min。

5.一种试剂盒在用于检测水稻碱消值中的应用，其特征在于，包括权利要求1所述的引物。

6.权利要求1所述引物在改良水稻碱消值培育优质水稻品种中的应用。

7.一种基因芯片用于改良水稻碱消值培育优质水稻中的用途，其特征在于，包括权利要求1所述的引物。

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