CN116622883B - 一种鉴定水稻h23转化体的特异性探针、引物、试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种探针、探针和引物组合、标准品、检测试剂盒、Real‑time PCR检测方法及其在定性或定量检测水稻H23转化体中的应用。

Description

一种鉴定水稻H23转化体的特异性探针、引物、试剂盒和方法

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种用于鉴定水稻H23转化体的探针、探针和引物组合、标准品、Real-timePCR检测试剂盒和检测方法。

背景技术

水稻转化体H23是一种抗虫耐草铵膦除草剂的水稻转基因材料，它对褐飞虱具有优异的抗性，对草铵膦具有良好的耐受性，利用该转化体能培育抗虫抗除草剂水稻品种。建立转化体特异性检测方法能为转基因生物的鉴定和监管提供有效的检测手段，为农业转基因生物安全管理提供技术支撑。与普通PCR和染料法Real-timePCR(实时荧光定量PCR)相比，探针法实时荧光定量PCR方法具有耗时短、操作简便、特异性好、灵敏度高和通量大等优势，过程可实时监控，结果可直接观察，可以对大量样品进行高效率的定量检测。

水稻转化体H23及其检测方法已公开，专利申请号为202011498142.7，公开的检测方法是普通PCR，其中所设计的检测引物之间的PCR产物长度过大(908bp和901bp)，不适合直接用于Real-time PCR方法检测，尤其是应用探针法的Real-timePCR检测。因此，需要进一步建立专门的Real-timePCR检测体系。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种新的用于检测水稻H23转化体的探针、探针和引物组合、标准品、检测试剂盒、Real-timePCR检测方法。本发明通过设计高灵敏度、特异性的探针、上游引物和下游引物，标准品，既能准确鉴定水稻H23转化体，能将其与不含H23的常规水稻和其他转基因水稻材料分开，还能完成微量H23的样品(含量不低于25拷贝/μL)的拷贝数鉴定。该检测方法具有极高的特异性和灵敏性，操作简便，能高通量完成大量样品的定量检测。

本发明提供了一种探针，其特征在于：所述探针的核苷酸序列为5'-CATGGCCTCCTTTGAACACC-3'。

在一些实施方案中，所述探针5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。当探针处于游离状态时，荧光基团发出的荧光会被淬灭基团吸收；在PCR扩增过程中，与模板紧密结合的探针5’端荧光基团会被Taq酶切开，从而远离3’端的淬灭基团，荧光基团发出的荧光能被仪器接收，产生的荧光信号与样本中扩增产物的量成正比。

在一些实施方案中，所述荧光基团包括FAM、TET、HEX、CY3、JOE、VIC、ROX、CY5、TAMRA或Texas中的任一种；所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ-X、TAMRA、DABCYL或MGB中的任一种；

在一些实施方案中，5’端标记FAM、3’端标记BHQ1的探针标记成本最低，可以作为最优选的探针标记方案。

本发明还提供了一种引物和探针组合，其特征在于：包括上述的探针和两条引物，所述引物的核苷酸序列为5'-ACGTCCGCAATGTGTTATTAAGT-3'和5'-CTATCAAGGCTTCCCAAATGCAG-3'；

上述的探针以及探针和引物组合是通过软件设计和人工组合、双重试验筛选以及多次PCR试验验证挑选出来的，定位于H23转化体外源插入序列下游边界的基因组和载体序列上。

本发明还提供了一种检测标准品，其特征在于：所述标准品为浓度不低于25拷贝/μL的一个或多个DNA样品；

在一些实施方案中，所述检测标准品为6个水稻H23基因组DNA，浓度分别为80000拷贝/μL、16000拷贝/μL、3200拷贝/μL、640拷贝/μL、128拷贝/μL、25拷贝/μL的DNA样品；

在一些实施方案中，所述标准品的制备方法为：取浓度为0.2μg/μL的水稻H23基因组DNA溶液依次稀释5倍、25倍、125倍、625倍、3125倍和15625倍。

本发明还提供了一种检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括上述的探针和引物组合以及上述的标准品；

在一些实施方案中，所述检测试剂盒包括：

引物1，序列为5'-ACGTCCGCAATGTGTTATTAAGT-3'；

引物2，序列为5'-CTATCAAGGCTTCCCAAATGCAG-3'；

探针，序列为5'-CATGGCCTCCTTTGAACACC-3”；

标准品，所述检测标准品为6个水稻H23基因组DNA，浓度分别为80000拷贝/μL、16000拷贝/μL、3200拷贝/μL、640拷贝/μL、128拷贝/μL、25拷贝/μL的DNA样品；

其中，所述探针5’端标记荧光基团FAM，3’端标记淬灭基团BHQ1。

本发明还提供了一种Real-time PCR检测方法，其特征在于：使用上述的检测试剂盒进行Real-time PCR检测，其中PCR反应体系中的引物1和引物2终浓度均为0.4μM，探针终浓度为0.2μM。

本发明还提供了上述的探针、探针和引物组合、检测标准品、检测试剂盒、检测方法在定性或定量检测核酸样品中的应用；其中，所述水稻H23转化体含有SEQ ID NO.1所示序列的核酸分子。

本发明的有益效果是：经过软件设计、人工组合以及多次试验筛选，从500多组探针引物池中获得了1条探针和2条引物的组合，在此基础上利用合适浓度梯度的标准品建立并优化了Real-time PCR检测方法，应用上述探针、探针和引物组合、标准品、检测试剂盒、Real-time PCR检测方法可以特异性地检测不低于25拷贝/μL的含有SEQ ID NO.1的核酸样品，并能有效地将H23材料与其他不含H23的水稻材料区分开，具有极高的灵敏度和特异性。

附图说明

通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1用普通PCR扩增反应检测其中5组候选引物后的电泳结果。M表示DNA LadderMarker。组合A1、A2、A3、B1和B2的引物可获得清晰的符合预期大小的单一条带。

图2灵敏度试验曲线。其中，1：16000拷贝/μL；2：3200拷贝/μL；3：640拷贝/μL；4：128拷贝/μL；5：25拷贝/μL；6：5拷贝/μL。

图3标准品扩增曲线。其中，1：80000拷贝/μL；2：16000拷贝/μL；3：3200拷贝/μL；4：640拷贝/μL；5：128拷贝/μL。

图4绘制标准曲线和线性方程。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步说明，以下实例仅用于说明本发明但并不限定本发明的范畴。

所述“水稻”是指亚洲栽培稻(Oryza sativa L.)，并且包括可以与水稻交配的所有植物品种，包括野生水稻种。

所述“包含”是指“包括但不限于”。

术语“植物”包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛(plant clumps)和植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎秆、根、根尖、花药等。应理解为本发明范围内的转基因植物的部分包括但不限于植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚以及花、茎、果实、叶和根，以上植物部分源自事先用本发明的DNA分子转化的并因此至少部分地由转基因细胞组成的转基因植物或其子代。

术语“基因”是指表达特定蛋白的核酸片段，包括编码序列前的调节序列(5’非编码序列)和编码序列后的调节序列(3’非编码序列)。“天然基因”是指天然发现具有其自身调节序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，其包含非天然发现的调节和编码序列。“内源基因”是指天然基因，所述天然基因位于生物体基因组中它的天然位置。“外源基因”是现存在于生物的基因组中且原来不存在的外来基因，也指经转基因步骤导入受体细胞的基因。外源基因可以包含插入非天然生物体的天然基因或嵌合基因。“转基因”是通过转化程序已经被引入基因组的基因。植物基因组中重组DNA已被插入的位点可以称为“插入位点”或“靶位点”。

引起外源DNA的随机整合的转化程序会导致含有不同侧翼区的转化体，所述不同侧翼区是每个转化体所特异性含有的。当重组DNA通过传统杂交被引入植物时，其侧翼区通常不会改变。转化体也会含有异源插入物DNA和基因组DNA的段之间或两段基因组DNA之间或两段异源DNA之间的独特的接合。“接合”是两个具体的DNA片段连接的点。例如，接合存在于插入物DNA连接侧翼DNA的位置。接合点还存在于转化的生物体中，其中两个DNA片段以天然生物体中发现的方式连接在一起。“接合DNA”是指包含接合点的DNA。

H23转化体是包括转基因水稻H23的植物和种子及其植物细胞或其可再生部分，所述H23的植物部分，包括但不限于细胞、花粉、胚珠、花、芽、根、茎、穗丝、花序、耳穗、叶和来自水稻植物H23的产物，例如稻米、稻草、稻壳、稻油、米饭、米粉、米糠、米皮和留在水稻作物田间的生物量。

术语“探针”是一段分离的核酸分子，其上面结合有常规的可检测标记或报告分子，例如，放射性同位素、配体、化学发光剂或酶类。这种探针与目标核酸的一条链是互补的，在本发明中，探针与来自转基因水稻H23基因组的一条DNA链互补，不论该基因组DNA是来自转基因水稻H23或种子还是来源于转基因水稻H23以及其他衍生品系的植物或种子或提取物，还是从H23中分离得到的包含H23身份信息的核酸分子。本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，还包括特异性地与目标DNA序列结合并可用于检测该目标DNA序列的存在的聚酰胺及其他探针材料。

术语“引物”是一段分离的核酸分子，其通过核酸杂交，退火结合到互补的目标DNA链上，在引物和目标DNA链之间形成杂合体，然后在聚合酶(例如DNA聚合酶)的作用下，沿目标DNA链延伸。本发明的引物对涉及其在目标核酸序列扩增中的应用，例如，通过聚合酶链式反应(PCR)或其他常规的核酸扩增方法。

实施例1水稻转化体H23上游边界特异性引物、探针及其检测方法

转化体的特异性检测方法需要在插入位点上游和下游的边界序列处设计引物和探针，PCR扩增产物需要包括外源序列和水稻基因组序列。因此，首先要根据水稻H23插入位点的边界序列设计引物和探针。

将上游或下游边界序列作为模板，利用软件(如ABIPrimer Express 3.0)设计，构建了一个上百组的探针引物池，从软件评分排序靠前的10组探针引物组合中通过普通PCR和染料法荧光定量PCR方法筛选出2组，然后经过重新组合，获得了一组定位于插入位点上游边界处的1条探针和2条引物的组合，并制备了含有上游边界序列的标准品。经过Real-time PCR体系检测水稻H23的灵敏度试验和样品特异性检测实验，发现这一组上游边界序列的探针和引物组合的最低检测限为100拷贝/μL，即能够完成浓度大于100拷贝/μL的H23样品的检测。当H23样品浓度低于100拷贝/μL时，则无法检测到。

实施例2在水稻转化体H23下游边界序列上设计和筛选特异性引物和探针

进一步分析和检测发现，实施例1构建的探针引物池中其他组合对H23的最低检测限均高于100拷贝/μL，且这些组合大部分定位在H23上游边界处，因此，本发明选择H23下游边界序列作为模板设计引物和探针，构建了一个总数超500组的探针引物池，并在实施例1的基础上对探针引物的筛选策略进行了调整——首先从池中选出10组评分最高的引物和探针组合，与此同时，将这10个组合中的引物和探针随机打乱后再重新组合出6组新的探针引物组合。将上述16组探针引物组合通过普通PCR和染料法荧光定量PCR方法进行筛选以及体系优化测试后意外地发现了一组比实施例1检测限更低的探针引物组合。具体步骤如下：

一、设计引物和探针组合

将下游边界序列的一部分(100-600bp)作为模板输入软件(如Beacon Designer8.0或Primer 3.0)中，该模板序列必须同时包含水稻基因组序列(长度至少50bp)和外源插入序列(长度至少50bp)，其中的2条模板SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3如下所示：

水稻转化体H23下游边界模板SEQ ID NO.2：

ctcgagtttctccataataatgtgtgagtagttcccagataagggaattagggttcctatagggtttcgctcatgtgttgagcata

taagaaacccttagtatgtatttgtatttgtaaaatacttctatcaataaaatttctaattcctaaaaccaaaatccagtactaaaat

ccagatcccccgaattaattcggcgttaattcagtctaacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcctcaag

ctgctctaacaACTTGTGGTCGGCCATGGCCTCCTTTGAACACCGCCATTTCTTGC

CATCTGTTCGACGGCATCTTCCAGGTTCTGGGTCAGAGTCTGCATTTGGGA

AGCCTTGATAGAGAGGCCTCCAGCTCACTGCAGTACAATAAGTATGTCATG

TTTCCATTTGATTTACATATC

水稻转化体H23下游边界模板SEQ ID NO.3：

cgaggcgctcggatatgccccccgcggcatgctgcgggcggccggcttcaagcacgggaactggcatgacgtgggtttc

tggcagctggacttcagcctgccggtaccgccccgtccggtcctgcccgtcaccgagatttgactcgagtttctccataata

atgtgtgagtagttcccagataagggaattagggttcctatagggtttcgctcatgtgttgagcatataagaaacccttagtatg

tatttgtatttgtaaaatacttctatcaataaaatttctaattcctaaaaccaaaatccagtactaaaatccagatcccccgaattaa

ttcggcgttaattcagtctaacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcctcaagctgctctaacaACTTG

TGGTCGGCCATGGCCTCCTTTGAACACCGCCATTTCTTGCCATCTGTTCGAC

GGCATCTTCCAGGTTCTGGGTCAGAGTCTGCATTTGGGAAGCCTTGATAGA

GAGGCCTCCAGCTCACTGCAGTACAATAAGTATGTCATGTTTCCATTTGATT

TACATATCACGTTGCCTTTTGTCATAATAAACCTGAACTGGTGAGAACTGAG

AACGTAACATTGATACAGCTTGTATGCAGCTCCTTTTTGTTAATAACATGCTC

ACTTGTACACTCAGATT

小写字母为外源序列，大写字母为基因组序列。

按以下要求设置软件中的相关参数后，共得到了超过500组的引物和探针组合。其中，每个组合中包含2条引物和1条探针。

探针和引物满足如下所有要求：

①引物的长度在20～25bp之间，探针的长度在22～30bp之间；

②引物的Tm值在58～60℃，探针的Tm值比引物高8-10℃；

③探针内部、引物内部或探针与引物之间避免产生3个碱基以上的互补序列；

④探针5’端第一个碱基不是G；

⑤正向引物和反向引物分别位于水稻基因组和载体插入序列。

⑥正向引物和反向引物之间的PCR产物长度介于80-300bp之间。

最后从中选取软件评分较高的10组引物和探针作为候选组合A1-A10，同时将上述A1-A10组合中的引物和探针随机打乱后再重新组合出6组新的候选组合B1-B6，以备进一步筛选。候选组合如表1所示。

表116组候选引物和探针

二、引物合成和筛选

合成表1所示的16组引物，并进行特异性引物筛选。筛选过程如下：

(1)用普通PCR扩增反应检测16个候选组合的引物F和引物R。电泳结果如图1和表2所示。结果表明，只有组合A1、A2、A3、B1和B2的引物扩增获得了符合预期大小(100-250bp)的单一特异性条带，因此组合A1、A2、A3、B1和B2的引物F和引物R为I类特异性引物。其他组合淘汰。

表2普通PCR筛选I类特异性引物

(2)用SYBR Green染料法Real-time PCR反应检测所有I类特异性引物，即组合A1、A2、A3、B1和B2的引物F和引物R。Real-time PCR反应结果如表3所示。结果表明：组合A2、B2的扩增曲线正常，但Ct值＞35；组合A1、A3、B1的扩增曲线正常，且Ct值＜35，其中组合A1和B1的熔解曲线为单峰，而组合A3熔解曲线形成了两个峰。因此，将组合A1和B1中的引物F和R归为II类特异性引物。组合A2、A3和B2淘汰。

表3SYBR Green染料法Real-time PCR筛选II类特异性引物

三、探针合成和筛选

合成组合A1和B1中的探针，5’端用荧光标记基团FAM修饰，3’端用荧光淬灭基团BHQ1修饰。

用探针法Real-time PCR反应检测组合A1和B1中的引物和探针，反应结果如表4所示。结果表明：组合A1和B1均扩增成功，Ct值分别为29.19和21.55。

表4探针法Real-timePCR筛选特异性引物、探针组合

因此，选择Ct值更小、扩增效率更高的B1引物和探针组合，作为检测水稻转化体H23材料的探针和引物组合。

组合B1的探针和引物位于外源插入序列下游边界，具体序列和位置如下所示：

小写字母为载体序列，大写字母为基因组序列，下划线部分表示引物所在位置，方框部分表示探针所在位置。

引物和探针序列如下：

引物F：5'-ACGTCCGCAATGTGTTATTAAGT-3'

引物R：5'-CTATCAAGGCTTCCCAAATGCAG-3'

探针P：FAM-CATGGCCTCCTTTGAACACC-BHQ1

实施例3制备标准品

利用Real-time PCR对样品的初始模板量进行定量分析，需要利用已知拷贝数的标准品作出标准曲线，再通过PCR获得待测样品的Ct值，最后从标准曲线上计算出该样品的拷贝数。因此，首先要制备适宜的标准品，其制备方法如下：

一、水稻H23基因组DNA提取：

采用CTAB法提取，具体步骤如下：

1)取水稻H23样品叶片0.1g，研磨成粉末后加入500-800μL CTAB，65℃温浴0.5-1h；

2)加入700μL氯仿或氯仿：异戊醇(24：1)，缓慢摇匀，12000rpm离心15min，取上清400-700μL；

3)加入1mL预冷无水乙醇或异丙醇，充分混匀后，12000rpm离心10min，弃上清；

4)将沉淀用75％酒精洗涤，12000rpm离心5min，弃酒精，倒置吸水干燥；

5)用50μL ddH₂O溶解DNA，取3-5μL电泳检测后，用超微量紫外分光光度计测定DNA浓度并稀释为0.2μg/μL备用。

二、制备不同浓度梯度的标准品

进行实时荧光定量PCR时，模板浓度需要以拷贝/μL为单位。

计算公式：模板拷贝/μL＝阿伏伽德罗常数×模板摩尔数，其中阿伏伽德罗常数＝6.02×10²³拷贝/mol，模板分子量＝模板DNA长度(碱基数量)×660(碱基的平均分子量)。

根据上述公式，0.2μg/μL的H23基因组DNA溶液就是6.02×10²³拷贝/mol×(0.2×10^-6g/μL)/(460*10⁶×660g/mol)，即为400000拷贝/μL。

取1.0μL上述溶液，分别稀释5倍、25倍、125倍、625倍、3125倍和15625倍，依次得到浓度分别为80000拷贝/μL、16000拷贝/μL、3200拷贝/μL、640拷贝/μL、128拷贝/μL、25拷贝/μL的DNA样品。置于-20℃保存备用。

实施例4探针法Real-time PCR反应体系的建立和优化

本发明通过实施例2的操作获得了可用的探针和引物，通过实施例3得到了系列浓度梯度的标准品，然而具体的Real-time PCR反应体系能否有更好的效果还受到引物和探针浓度等因素的影响，因此要想获得高效准确的定量结果，还需要进一步对PCR反应体系进行优化。

一、建立Real-time PCR反应体系

通过对实施例2筛选的引物和探针组合B1进行稀释，加入去离子水将其浓度稀释为10μM的工作液，进行探针法Real-time PCR扩增，建立反应体系。

PCR反应体系为：2×qPCR Mix 10μL，10μM上游引物0.5μL，10μM下游引物0.5μL，10μM探针0.25μL，模板DNA 1μL，ddH₂O补足至总体积为20μL。阳性对照(浓度为16000拷贝/μL的H23基因组DNA)作为模板，ddH₂O为空白对照。

Real-time PCR反应程序为：95℃10min；95℃10s，60℃20s，72℃40s(收集荧光信号)，共进行40-45个循环。

二、优化Real-time PCR反应体系

引物终浓度设置为0.1、0.2、0.3、0.4和0.5μM 5个浓度梯度，对应的探针浓度为引物浓度的1/2倍。各处理的Real-time PCR试验结果如表5所示。

表5不同引物和探针浓度的测试

结果表明：引物终浓度0.4μM、探针浓度0.2μM的PCR反应体系的Ct值最小，荧光信号值最高。因此，确定后续试验引物终浓度为0.4μM，探针浓度为0.2μM。

优化后的反应体系为：

2×qPCR Mix 10μL，10μM上游引物0.8μL，10μM下游引物0.8μL，10μM探针0.4μL，模板DNA 1μL，ddH₂O补足至总体积为20μL。阳性对照(浓度为16000拷贝/μL的H23基因组DNA)作为模板，ddH₂O为空白对照。

实施例5Real-time PCR体系检测水稻H23的灵敏度试验

灵敏度是指PCR扩增反应能检出样品的最低拷贝数，即最低检测限。用Real-timePCR检测不同浓度的标准品时，当某个浓度的标准品能形成扩增曲线但Ct值>35时，则认为该浓度标准品超出了PCR体系的最低检测限。

使用实施例2中所述的探针、引物组合B1、实施例4所优化的反应体系，以及以实施例3的标准品(浓度分别为16000、3200、640、128、25和5拷贝/μL)为模板(每个浓度3次平行试验)，ddH₂O为空白对照，进行Real-time PCR扩增，以确定本发明检测方法的最低检出限。根据仪器检测的荧光信号获得扩增曲线，结果见图2和表6。结果显示，当标准品浓度＜25拷贝/μL时，扩增曲线Ct＞35。因此，Real-time PCR的检出下限为25拷贝/μL。

上述灵敏度检测结果表明，当样品未出现典型扩增曲线或Ct值大于35，即样品中的转化体浓度低于25拷贝/μL，则认为样品中未检出H23转化体，检测结果为阴性。

表6灵敏度试验结果

实施例6绘制标准曲线

以梯度浓度的多个标准品作为模板进行Real-time PCR并记录Ct值，根据初始模板量(拷贝数)及Ct值绘制标准曲线，得到标准方程。当需要对待测样品初始模板进行定量时，只需要得到扩增曲线，读得Ct值，带入标准方程即可算出待测样品的初始模板量。

以实施例3的标准品(浓度分别为16000、3200、640、128和25拷贝/μL)为模板(每个浓度3次平行试验)，ddH₂O为空白对照，使用实施例2探针、引物组合B1，采用实施例4中优化的反应体系，进行Real-time PCR扩增，扩增曲线见图3。

以标准品浓度的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标，绘制标准曲线，见图4。本发明标准曲线方程为y＝-3.6761x+38.598(y表示Ct值，x为拷贝数的对数)，标准曲线呈良好的线性关系，R²＝0.9966，相关系数高，满足Real-time PCR定量检测的要求。

实施例7检测水稻转化体H23的Real-time PCR试剂盒

按照下列组成配制用于检测水稻H23的试剂盒：2×qPCR Mix，10μM上游引物、10μM下游引物、10μM探针、实施例3的标准品(浓度分别为16000、3200、640、128和25拷贝/μL)和ddH₂O。

引物、探针为实施例2中所述组合B1。

该试剂盒的反应体系可以为：2×qPCR Mix 10μL，10μM上游引物0.8μL，10μM下游引物0.8μL，10μM探针0.4μL，模板DNA 1μL，ddH₂O补足至总体积为20μL。

该试剂盒进行Real-time PCR的反应程序为：95℃10min；95℃10s，60℃20s，72℃40s(收集荧光信号)，共进行40-45个循环。

应用该试剂盒对样品进行检测时，通过仪器所检测到的荧光信号获得扩增曲线，根据标准品建立的标准方程和待测样品的Ct值计算样品拷贝数。

实施例8样品检测

用实施例3的DNA提取方法(CTAB法)提取水稻转化体H23、受体对照广占63-4S、其他转化体材料H21和上述3种水稻混合材料HH1的基因组DNA。

以上述4种材料的基因组DNA为模板，ddH₂O为空白对照，使用实施例2-7中所述的探针、引物、标准品、试剂盒和检测方法进行Real-time PCR扩增，以进行特异性试验检测。

同样的，以上述4种材料的基因组DNA为模板，ddH₂O为空白对照，采用实施例1的探针引物组合及其检测方法进行样品检测。

根据扩增曲线中各个样品的Ct值计算其拷贝数，结果如表7所示。

(1)应用实施例2-7的方法获得的检测结果为：水稻转化体H23的扩增曲线Ct值为25.05，拷贝数为4860，检测结果为阳性；受体广占63-4S和其他转化体材料H21的扩增曲线Ct值未检出，检测结果均为阴性；HH1的扩增曲线Ct值为31.47，拷贝数为87，检测结果为阳性。

(2)应用实施例1方法的检测结果为：水稻转化体H23的扩增曲线Ct值为32.83，拷贝数为4750，检测结果为阳性；受体广占63-4S和其他转化体材料H21的扩增曲线Ct值未检出，检测结果均为阴性；HH1的扩增曲线Ct值为36.07，Ct值大于35，检测结果为阴性。

由此可见，实施例2-7建立的检测体系能完成转化体浓度低于100拷贝/μL的水稻混合样品HH1的定量检测，与实施例1的探针和引物组合相比，定位于下游边界序列的探针引物组合、标准品和相应的检测体系具有更好的特异性和更低的检测极限值。

表7受试样品特异性试验检测结果

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (8)

1.检测水稻H23转化体的探针和引物组合，其特征在于：所述探针的核苷酸序列为5'-CATGGCCTCCTTTGAACACC-3'，所述引物的核苷酸序列为5'-

ACGTCCGCAATGTGTTATTAAGT-3'和5'-CTATCAAGGCTTCCCAAATGCAG-3'。

2.根据权利要求1所述的探针和引物组合，其特征在于：所述探针5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；

所述荧光基团为FAM、TET、HEX、CY3、JOE、VIC、ROX、CY5、TAMRA或Texas中的任一种；所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ-X、TAMRA、DABCYL或MGB中的任一种。

3.根据权利要求2所述的探针和引物组合，其特征在于：所述荧光基团和淬灭基团的组合为FAM/BHQ1、FAM/BHQ2、CY3/BHQ-X、HEX/DABCYL、JOE/TAMRA或VIC/BHQ2中的任一种。

4.根据权利要求3所述的探针和引物组合，其特征在于：所述荧光基团为FAM；所述淬灭基团为BHQ1。

5.检测水稻H23转化体的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1-4任一项所述的探针和引物组合以及标准品；其中，所述标准品为浓度不低于25拷贝/μL的水稻H23基因组DNA样品。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述标准品为6个水稻H23基因组DNA，浓度分别为80000拷贝/μL、16000拷贝/μL、3200拷贝/μL、640拷贝/μL、128拷贝/μL、25拷贝/μL的DNA样品。

7.检测水稻H23转化体的方法，其特征在于：使用权利要求5-6任一项所述的试剂盒进行Real-time PCR检测，其中PCR反应体系中的引物终浓度均为0.4μM，探针终浓度为0.2μM。

8.权利要求1-4任一项所述的探针和引物组合、权利要求5-6任一项所述的试剂盒、权利要求7所述的方法在定性或定量检测水稻H23转化体中的应用；

其中，H23转化体含有SEQ ID NO.1所示的核酸分子。