CN114015682A - 一种鉴定核酸样品的特异性探针、引物、试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种探针、探针和引物组合、标准品、检测试剂盒、Real‑time PCR检测方法及其在定性或定量检测核酸样品中的应用。

Description

一种鉴定核酸样品的特异性探针、引物、试剂盒和方法

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种用于鉴定核酸样品的探针、探针和引物组合、标准品、Real-time PCR检测试剂盒和检测方法。

背景技术

玉米转化体T抗-4是一种抗草甘膦除草剂的玉米转基因材料，它对草甘膦具有较好的耐受性，利用该转化体能培育抗草甘膦玉米品种。建立转化体特异性检测方法能为转基因生物的鉴定和监管提供有效的检测手段，为农业转基因生物安全管理提供技术支撑。

转化体特异性的检测主要利用普通PCR方法，但其缺点是灵敏度不高，且无法实时监控PCR过程，不能定量。随着分子生物学技术的发展，Real-time PCR(实时荧光定量PCR)已广泛应用于转基因检测，与常规PCR技术相比，其具有耗时短、操作简便、特异性好、灵敏度高的特点，过程可实时监控，结果可直接观察，可以进行定量检测。

Real-time PCR方法可分为染料法和探针法两种。染料法Real-time PCR中的荧光染料能与双链DNA结合发出荧光，其结合是非特异性的，体系中的引物二聚体、DNA模板等都会与其结合，所以染料法的特异性不高。而探针法中的探针能与模板特异性结合，其扩增曲线反映的就是特异性产物的积累，不会含有非特异扩增的成分，灵敏度比染料法高出10倍。另外，染料法只支持单通道反应，如果需要进行多通道试验，或是检测相同样本的不同靶标，最常用的还是探针法。

玉米转化体T抗-4及其检测方法已公开，专利申请号为2019103741446，公开的检测方法是普通PCR，其中所设计的检测引物之间的PCR产物长度过大(353bp和414bp)，不适合直接用于Real-time PCR方法检测，尤其是应用探针法的Real-time PCR检测。因此，需要进一步建立专门的探针法Real-time PCR检测体系。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了用于检测核酸样品的探针、探针和引物组合、标准品、检测试剂盒、Real-time PCR检测方法。上述的核酸样品可以是玉米T抗-4转化体的基因组DNA，也可以是T抗-4转化体衍生品系的基因组DNA，或是含有T抗-4转化体的混杂玉米材料的基因组DNA，或是从上述样品中通过PCR扩增等方法分离得到的包含T抗-4身份信息的核酸样品。由于SEQ ID NO.1所示序列是确认T抗-4转化体身份信息的特异性序列，因此只要含有SEQ ID NO.1所示序列核酸分子的样品均可以用本发明提供的方法进行定性和定量检测。

本发明通过设计高灵敏度、特异性的探针、上游引物和下游引物，可准确鉴定玉米T抗-4转化体，能将其与不含T抗-4的常规玉米和其他转基因玉米材料分开。该检测方法具有较高的特异性、灵敏性和操作便利性等优点，弥补了常规PCR方法流程繁琐、检测灵敏度低的缺点。

本发明提供了一种探针，其特征在于：所述探针的核苷酸序列为5'-TGATGGGCGACATTGGGCAGC-3'。

在一些实施方案中，所述探针5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。当探针处于游离状态时，荧光基团发出的荧光会被淬灭基团吸收；在PCR扩增过程中，与模板紧密结合的探针5’端荧光基团会被Taq酶切开，从而远离3’端的淬灭基团，荧光基团发出的荧光能被仪器接收，产生的荧光信号与样本中扩增产物的量成正比。

在一些实施方案中，所述荧光基团包括FAM、TET、HEX、CY3、JOE、VIC、ROX、CY5、TAMRA或Texas中的任一种；所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ-X、TAMRA、DABCYL或MGB中的任一种；

在一些实施方案中，所述荧光基团/淬灭基团的组合为FAM/BHQ1、FAM/BHQ2、CY3/BHQ-X、HEX/DABCYL、JOE/TAMRA或VIC/BHQ2中的任一种；

在随机选取的荧光基团和淬灭基团测试试验中，上述荧光基团和淬灭基团标记的探针均能够得到特异性的检测结果。同时，5’端标记FAM、3’端标记BHQ1的探针标记成本最低，可以作为最优选的探针标记方案。

本发明还提供了一种探针和引物组合，其特征在于：包括权利要求1所述的探针和一条引物，所述引物的核苷酸序列为5'-CGCGCGGTGTCATCTATGT-3'；

在一些实施方案中，所述探针和引物组合还包括另外一条引物，另外一条引物的核苷酸序列为5'-CGTGAGAGTTTAGCGATTGGAAT-3'；或5'-AGAGTTTAGCGATTGGAATGGAAT-3'任意一个。

上述的探针以及探针和引物组合是通过软件设计、试验筛选、人工重新组合和再次PCR试验验证挑选出来的，定位于T抗-4转化体外源插入序列右边界上。

本发明还提供了一种检测标准品，其特征在于：所述标准品为浓度不低于64拷贝/μL的一个或多个核酸样品；所述核酸样品含有SEQ ID NO.1所示序列的核酸分子；

在一些实施方案中，所述检测标准品为5个浓度分别为200000拷贝/μL、40000拷贝/μL、8000拷贝/μL、1600拷贝/μL、320拷贝/μL的DNA样品；所述DNA样品含有SEQ ID NO.1所示的核酸分子；

在一些实施方案中，所述标准品的制备方法为：将浓度为1μg/μL的玉米T抗-4纯合转化体基因组DNA溶液分别稀释2倍、10倍、50倍、250倍、1250倍。

本发明还提供了一种检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括上述的探针和引物组合以及上述的标准品；

在一些实施方案中，所述检测试剂盒包括：

引物1，序列为5'-CGCGCGGTGTCATCTATGT-3'；

引物2，序列为5'-CGTGAGAGTTTAGCGATTGGAAT-3'；

探针，序列为5'-TGATGGGCGACATTGGGCAGC-3'；

标准品，所述检测标准品为5个浓度分别为200000拷贝/μL、40000拷贝/μL、8000拷贝/μL、1600拷贝/μL、320拷贝/μL的DNA样品；所述DNA样品含有SEQ ID NO.1所示序列的核酸分子；

其中，所述探针5’端标记荧光基团FAM，3’端标记淬灭基团BHQ1。

本发明还提供了一种Real-time PCR检测方法，其特征在于：使用上述的检测试剂盒进行Real-time PCR检测，其中PCR反应体系中的引物1和引物2终浓度均为0.2μM，探针终浓度为0.1μM。

本发明还提供了上述的探针、探针和引物组合、检测标准品、检测试剂盒、检测方法在定性或定量检测核酸样品中的应用；其中，所述核酸样品含有SEQ ID NO.1所示序列的核酸分子。

本发明的有益效果是：经过软件设计、人工重新组合以及多次试验筛选，从300多组探针引物组合中获得了1条探针以及2组探针和引物组合，在此基础上利用合适浓度梯度的标准品建立并优化了Real-time PCR检测方法，应用上述探针、探针和引物组合、标准品、检测试剂盒、Real-time PCR检测方法可以特异性地检测不低于64拷贝/μL的含有SEQ IDNO.1的核酸样品，并能有效地将T抗-4材料与其他不含T抗-4的玉米材料区分开，具有极高的灵敏度和特异性。

附图说明

通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1用普通PCR扩增反应检测20组引物后的电泳结果。M表示DNA Ladder Marker，A1-A20表示组合A1-A20中的引物对。可见，组合A1-A5、A9-A11和A17的引物可获得清晰的符合预期的单一条带。

图2用SYBR Green染料法Real-time PCR反应检测组合A1-A5、A9-A11和A17引物对的扩增结果。左图为扩增曲线，右图为熔解曲线。每一条曲线代表一组引物反应。可见，组合A10、A11的扩增失败；组合A1-A5、A9、A17的扩增曲线正常，Ct值＜35，其中组合1-5的熔解曲线为单峰，而组合A9、A17熔解曲线形成了双峰。

图3用探针法Real-time PCR反应检测组合A1-A5的引物和探针的扩增结果。可见，组合A2-A4扩增失败，无稳步上扬的扩增曲线，无Ct值；组合A1和A5虽然扩增成功，但Ct值分别为36.55和37.25。

图4用探针法Real-time PCR反应检测组合B1-B12的引物和探针的扩增结果。可见，组合B1-B8扩增失败，无稳步上扬的扩增曲线，无Ct值；组合B9-B12扩增成功，Ct值分别为35.11、24.08、36.32和27.12。

图5建立和优化Real-time PCR体系的扩增曲线。其中，A：引物终浓度0.1μM、探针终浓度0.05μM；B：引物终浓度0.2μM、探针终浓度0.1μM；C：引物终浓度0.3μM、探针终浓度0.15μM；D：引物终浓度0.4μM、探针终浓度0.2μM；E：引物终浓度0.5μM、探针终浓度0.25μM。

图6灵敏度试验曲线。其中，A：200000拷贝/μL；B：40000拷贝/μL；C：8000拷贝/μL；D：1600拷贝/μL；E：320拷贝/μL；F：64拷贝/μL；G：12.8拷贝/μL；H：空白对照。

图7标准品扩增曲线。其中，A：40000拷贝/μL；B：8000拷贝/μL；C：1600拷贝/μL；D：320拷贝/μL；E：64拷贝/μL；F：空白对照。

图8绘制标准曲线和线性方程。

图9特异性样品检测试验。其中，A：转化体T抗-4；B：阴性对照18599；C：转化体T抗-1；D：转化体T抗-2；E：空白对照。

图10不同荧光基团标记探针的扩增曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步说明，以下实例仅用于说明本发明但并不限定本发明的范畴。

所述“玉米”是指玉蜀黍(Zea mays)，并且包括可以与玉米交配的所有植物品种，包括野生玉米种。

所述“包含”是指“包括但不限于”。

术语“植物”包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛(plant clumps)和植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎秆、根、根尖、花药等。应理解为本发明范围内的转基因植物的部分包括但不限于植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚以及花、茎、果实、叶和根，以上植物部分源自事先用本发明的DNA分子转化的并因此至少部分地由转基因细胞组成的转基因植物或其子代。

术语“基因”是指表达特定蛋白的核酸片段，包括编码序列前的调节序列(5’非编码序列)和编码序列后的调节序列(3’非编码序列)。“天然基因”是指天然发现具有其自身调节序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，其包含非天然发现的调节和编码序列。“内源基因”是指天然基因，所述天然基因位于生物体基因组中它的天然位置。“外源基因”是现存在于生物的基因组中且原来不存在的外来基因，也指经转基因步骤导入受体细胞的基因。外源基因可以包含插入非天然生物体的天然基因或嵌合基因。“转基因”是通过转化程序已经被引入基因组的基因。植物基因组中重组DNA已被插入的位点可以称为“插入位点”或“靶位点”。

引起外源DNA的随机整合的转化程序会导致含有不同侧翼区的转化体，所述不同侧翼区是每个转化体所特异性含有的。当重组DNA通过传统杂交被引入植物时，其侧翼区通常不会改变。转化体也会含有异源插入物DNA和基因组DNA的段之间或两段基因组DNA之间或两段异源DNA之间的独特的接合。“接合”是两个具体的DNA片段连接的点。例如，接合存在于插入物DNA连接侧翼DNA的位置。接合点还存在于转化的生物体中，其中两个DNA片段以天然生物体中发现的方式连接在一起。“接合DNA”是指包含接合点的DNA。

T抗-4转化体是包括转基因玉米T抗-4的植物和种子及其植物细胞或其可再生部分，所述T抗-4的植物部分，包括但不限于细胞、花粉、胚珠、花、芽、根、茎、穗丝、花序、耳穗、叶和来自玉米植物T抗-4的产物，例如玉米粉、玉米面、玉米油、玉米浆、玉米穗丝、玉米淀粉和留在玉米作物田间的生物量。

术语“探针”是一段分离的核酸分子，其上面结合有常规的可检测标记或报告分子，例如，放射性同位素、配体、化学发光剂或酶类。这种探针与目标核酸的一条链是互补的，在本发明中，探针与来自转基因玉米T抗-4基因组的一条DNA链互补，不论该基因组DNA是来自转基因玉米T抗-4或种子还是来源于转基因玉米T抗-4以及其他衍生品系的植物或种子或提取物，还是从T抗-4中分离得到的包含T抗-4身份信息的核酸分子。本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，还包括特异性地与目标DNA序列结合并可用于检测该目标DNA序列的存在的聚酰胺及其他探针材料。

术语“引物”是一段分离的核酸分子，其通过核酸杂交，退火结合到互补的目标DNA链上，在引物和目标DNA链之间形成杂合体，然后在聚合酶(例如DNA聚合酶)的作用下，沿目标DNA链延伸。本发明的引物对涉及其在目标核酸序列扩增中的应用，例如，通过聚合酶链式反应(PCR)或其他常规的核酸扩增方法。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册(SambrookJ&Russell D W,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1玉米转化体T抗-4的特异性引物和探针的设计和筛选

转化体的特异性检测方法需要在插入位点两侧的边界序列处设计引物和探针，PCR扩增产物需要包括外源序列和玉米基因组序列。因此，首先要根据玉米T抗-4左右边界序列设计引物和探针。

1、用软件设计引物和探针组合

将左、右边界序列的一部分(100-600bp)作为模板输入软件(如ABI PrimerExpress 3.0)中，该模板序列必须同时包含玉米基因组序列(长度至少50bp)和外源插入序列(长度至少50bp)，其中的2条模板SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3如下所示：

玉米转化体T抗-4左边界模板SEQ ID NO.2：

玉米转化体T抗-4右边界模板SEQ ID NO.3：

小写字母为外源序列，大写字母为基因组序列。

按以下要求设置软件中的相关参数后，探针和引物满足如下所有要求：

①引物的长度在18～25bp之间，探针的长度在18～30bp之间；

②引物的Tm值在58～60℃，探针的Tm值比引物高8-10℃；

③探针内部、引物内部或探针与引物之间避免产生3个碱基以上的互补序列；

④探针5’端第一个碱基不是G；

⑤上游引物和下游引物分别位于玉米基因组和载体插入序列。

⑥上游引物和下游引物之间的PCR产物长度介于80-300bp之间。

共得到了超过300组的引物和探针组合。其中，每个组合中包含1对引物和1条探针。最后从中选取软件评分较高的20组引物和探针作为候选组合，以备进一步筛选。候选组合如表1所示。

表1软件设计评分较高的20组候选引物和探针

组合	引物F	引物R	探针P
				A1	ACAAAATATAGCGCGCAAACTAGG	GGCATCTCGATCCATATTGCG	TGATGGGCGACATTGGGCAGC
A2	CGCGCGGTGTCATCTATGT	AAGCGTGTTGGATCAATGGC	TTATGATGGGCGACATTGGG
				A3	GCGCGGTGTCATCTATGTTA	CGTGAGAGTTTAGCGATTGGAAT	TGGGCAGCCATTGATCCAACACGC
A4	CGCGCGGTGTCATCTATGT	AGAGTTTAGCGATTGGAATGGAAT	GCCATTGATCCAACACGCTTTCCTACAC
				A5	GCGCGGTGTCATCTATGTTAC	TCGTGAGAGTTTAGCGATTGGAA	TGATGGGCGACATTGGGCAGC
A6	AGCGCGCAAACTAGGATAAA	TGTGTAGGAAAGCGTGTTGG	GACATTGGGCAGCCATTGAT
				A7	TTATCGCGCGCGGTGT	TCTTGACTTTATGGTAGCCCAACA	CAGCCATTGATCCAACACGCTTTCC
A8	CGCGGTGTCATCTATGTTACT	GTTGGATCAATGGCTGCCC	AGTCAATAATTATGATGGGCGACA
				A9	CGCGCGGTGTCATCTATGT	TCGCCACCTTGACTTCCC	TGATGGGCGACATTGGGCAGC
A10	AGAACTAGTCAATAATTATGATGGG	CAAACAGCTCTTGACTTTATGGTAG	CAGCCATTGATCCAACACGCTTTCCT
				A11	CATCTATGTTACTAGATCGGGAATT	ATCCAACACGCTTTCCTACACA	TGATGGGCGACATTGGGCAGC
A12	GAACTAGTCAATAATTATGATGGGC	TGTTGGGCTACCATAAAGTCAAGAG	CAGCCATTGATCCAACACGCTTTCCT
				A13	GCGCGCGGTGTCATCTAT	TTTAGCAGAGTCGTGAGAGTTTAGC	TTGACTTTATGGTAGCCCAACATGGACAGC
A14	GCGCGCGGTGTCATCTAT	GAGAGTTTAGCGATTGGAATGGA	TTGACTTTATGGTAGCCCAACATGGACAGC
				A15	AGCGCGCAAACTAGGATAAATT	GAGAGTTTAGCGATTGGAATGGAA	TGACTTTATGGTAGCCCAACATGGACAGC
A16	CGCTAGGATTGTCAGCATATGTTC	GTCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTC	TTATCACCCTTGATTTTATTGTGGT
				A17	TAGCAGCTTTAACGAGAGAGGAAAA	CATTAAAAACGTCCGCAATGTGT	TAATATTATGTTAAGAAAGCCGCTAGG
A18	CATATGTTCCCAAATGCTACTGCTA	CACCACAATAAAATCAAGGGTGATA	CCGCGCATGGAACAACCATTTCA
				A19	GACATGCAATGCTCATTATCTCTAG	TACACCGCGCATGGAACA	ACGACCGGGTCACGCTGCACTG
A20	CATATGTTCCCAAATGCTACTGCTA	CACCACAATAAAATCAAGGGTGATAA	ACCGCGCATGGAACAACCATTTCA

2、引物合成和筛选

合成表1所示的20组引物，并进行特异性引物筛选。筛选过程如下：

(1)用普通PCR扩增反应检测20个候选组合的引物F和引物R。电泳结果如图1所示。结果表明，组合A1-A5、A9-A11和A17的引物扩增获得了符合预期的单一特异性条带，因此组合A1-A5、A9-A11和A17的引物F和引物R为I类特异性引物。组合A6-A8、A12-A16、A18-A20淘汰。

(2)用SYBR Green染料法Real-time PCR反应检测所有I类特异性引物，即组合A1-A5、A9-A11和A17的引物F和引物R。Real-time PCR反应结果如图2所示。结果表明：组合A10、A11扩增失败，无稳步上扬的扩增曲线，无Ct值；组合A1-A5、A9和A17的扩增曲线正常，Ct值<35(均为上海宏石SLAN-96S仪器自动阈值线)，其中组合A1-A5的熔解曲线为单峰，而组合A9和A17熔解曲线形成了两个峰。因此，将组合A1-A5中的引物F和R归为II类特异性引物。组合A9-A11、A17淘汰。

3、探针合成和筛选

合成组合A1-A5中的探针，5’端用荧光标记基团FAM修饰，3’端用荧光淬灭基团BHQ1修饰。

用探针法Real-time PCR反应检测组合A1-A5中的引物和探针，反应结果如图3所示。结果表明：组合A2-A4扩增失败，无稳步上扬的扩增曲线，无Ct值；组合A1和A5虽然扩增成功，但Ct值分别为36.55和37.25。由于组合A2-A3无Ct值，组合A1和A5的Ct>35，因此，淘汰组合A1-A5。

经过筛选，在左、右边界都没有找到合适的引物和探针组合。

4、重新组合引物和探针

重新分析表1组合A1-A5中的所有引物和探针，挑选发夹结构(Hairpin)和二聚体(Self Dimers)较少的3条上游引物、2条下游引物和2条探针进行重新组合，获得了12个新的引物和探针组合B1-B12。

表2重新组合的引物和探针

组合	引物F	引物R	探针P
				B1	GCGCGGTGTCATCTATGTTAC	CGTGAGAGTTTAGCGATTGGAAT	TTATGATGGGCGACATTGGG
B2	GCGCGGTGTCATCTATGTTAC	CGTGAGAGTTTAGCGATTGGAAT	TGATGGGCGACATTGGGCAGC
				B3	GCGCGGTGTCATCTATGTTAC	AGAGTTTAGCGATTGGAATGGAAT	TTATGATGGGCGACATTGGG
B4	GCGCGGTGTCATCTATGTTAC	AGAGTTTAGCGATTGGAATGGAAT	TGATGGGCGACATTGGGCAGC
				B5	GCGCGGTGTCATCTATGTTA	CGTGAGAGTTTAGCGATTGGAAT	TTATGATGGGCGACATTGGG
B6	GCGCGGTGTCATCTATGTTA	CGTGAGAGTTTAGCGATTGGAAT	TGATGGGCGACATTGGGCAGC
				B7	GCGCGGTGTCATCTATGTTA	AGAGTTTAGCGATTGGAATGGAAT	TTATGATGGGCGACATTGGG
B8	GCGCGGTGTCATCTATGTTA	AGAGTTTAGCGATTGGAATGGAAT	TGATGGGCGACATTGGGCAGC
				B9	CGCGCGGTGTCATCTATGT	CGTGAGAGTTTAGCGATTGGAAT	TTATGATGGGCGACATTGGG
B10	CGCGCGGTGTCATCTATGT	CGTGAGAGTTTAGCGATTGGAAT	TGATGGGCGACATTGGGCAGC
				B11	CGCGCGGTGTCATCTATGT	AGAGTTTAGCGATTGGAATGGAAT	TTATGATGGGCGACATTGGG
B12	CGCGCGGTGTCATCTATGT	AGAGTTTAGCGATTGGAATGGAAT	TGATGGGCGACATTGGGCAGC

5、新组合的筛选

用探针法Real-time PCR反应检测组合B1-B12中的引物和探针。Real-time PCR反应结果如图4所示。

结果表明：组合B1-B8扩增失败，无稳步上扬的扩增曲线，无Ct值；组合B9-B12扩增成功，Ct值分别为35.11、24.08、36.32和27.12。由于组合B1-B8无Ct值，组合B9和B11的Ct值＞35，因此，淘汰组合B1-B9、B11。而组合B10和B12的Ct＜35，均为合适的探针引物组合，其中组合B10的Ct值最小，所以将组合B10确定为检测玉米转化体T抗-4材料的最优探针和引物组合。

组合B10的探针和引物位于外源插入序列右边界，具体序列和位置如下所示：

组合B12的探针和引物也位于外源插入序列右边界，具体序列和位置如下所示：

小写字母为载体序列，大写字母为基因组序列，阴影部分表示引物所在位置，方框部分表示探针所在位置。

第一组引物和探针序列

上游引物：5'-CGCGCGGTGTCATCTATGT-3'；

下游引物：5'-CGTGAGAGTTTAGCGATTGGAAT-3'；

特异性探针：FAM-TGATGGGCGACATTGGGCAGC-BHQ1。

第二组引物和探针序列

上游引物：5'-CGCGCGGTGTCATCTATGT-3'；

下游引物：5'-AGAGTTTAGCGATTGGAATGGAAT-3'；

特异性探针：FAM-TGATGGGCGACATTGGGCAGC-BHQ1。

这两个组合探针相同，正向引物相同，只有反向引物不同。这两个组合均位于外源插入序列右边界。

实施例2制备标准品

利用Real-time PCR对样品的初始模板量进行定量分析，需要利用已知拷贝数的标准品作出标准曲线，再通过PCR获得待测样品的Ct值，最后从标准曲线上计算出该样品的拷贝数。因此，首先要制备适宜的标准品，其制备方法如下：

1、玉米T抗-4基因组DNA提取：

采用CTAB法提取，具体步骤如下：

1)取玉米T抗-4样品叶片0.1g，研磨成粉末后加入500-800μL CTAB，65℃温浴0.5-1h；

2)加入700μL氯仿或氯仿：异戊醇(24：1)，缓慢摇匀，12000rpm离心15min，取上清400-700μL；

3)加入1mL预冷无水乙醇或异丙醇，充分混匀后，12000rpm离心10min，弃上清；

4)将沉淀用75％酒精洗涤，12000rpm离心5min，弃酒精，倒置吸水干燥；

5)用50μL ddH₂O溶解DNA，取3-5μL电泳检测后，用紫外分光光度计测定DNA浓度为1μg/μL。

二、制备系列浓度梯度的标准品

进行Real-time PCR时，标准品模板浓度需要以拷贝/μL为单位。

计算公式：模板拷贝/μL＝阿伏伽德罗常数×模板摩尔数，其中阿伏伽德罗常数＝6.02×10²³拷贝/mol，模板分子量＝模板DNA长度(碱基数量)×660(碱基的平均分子量)。

根据上述公式，1μg/μL的T抗-4基因组DNA溶液就是6.02×10²³拷贝/mol×(1×10^-6g/μL)/(2300*10⁶×660g/mol)，即为400000拷贝/μL。

取1μL上述溶液，分别稀释2倍、10倍、50倍、250倍、1250倍、6250和12500倍，得到浓度为200000、40000、8000、1600、320、64和12.8拷贝/μL的标准品。置于-20℃保存备用。

实施例3探针法Real-time PCR反应体系的建立和优化

本发明通过实施例1的操作获得了可用的探针和引物，通过实施例2得到了系列浓度梯度的标准品，然而具体的Real-time PCR反应体系能否有更好的效果还受到引物和探针浓度等因素的影响，因此要想获得高效准确的定量结果，还需要进一步对PCR反应体系进行优化。

一、建立初步的Real-time PCR反应体系

通过对实施例1筛选的引物和探针组合B10进行稀释，加入去离子水将其浓度稀释为10μM的工作液，进行探针法Real-time PCR扩增，建立反应体系。

PCR反应体系为：2×qPCR Mix 10μL，10μM上游引物0.5μL，10μM下游引物0.5μL，10μM探针0.25μL，模板DNA 1μL，ddH₂O补足至总体积为20μL。阳性对照(浓度为40000拷贝/μL的T抗-4基因组DNA)作为模板，ddH₂O为空白对照。

Real-time PCR反应程序为：95℃10min；95℃10s，60℃20s，72℃40s(收集荧光信号)，共进行40-45个循环。

二、优化Real-time PCR反应体系

引物终浓度设置为0.1、0.2、0.3、0.4和0.5μM 5个浓度梯度，对应的探针浓度为引物浓度的1/2倍。各处理的Real-time PCR试验结果如图5、表3所示。

表3不同引物和探针浓度的测试

处理	引物终浓度	探针终浓度	Ct
				A	0.1	0.05	26.82
B	0.2	0.1	25.6
				C	0.3	0.15	26.15
D	0.4	0.2	27.22
				E	0.5	0.25	28.5

结果表明：引物浓度0.2μM、探针浓度0.1μM的PCR反应体系的Ct值最小，荧光信号值最高。因此，确定后续试验引物终浓度为0.2μM，探针浓度为0.1μM。

优化后的反应体系为：

2×qPCR Mix 10μL，10μM上游引物0.4μL，10μM下游引物0.4μL，10μM探针0.2μL，模板DNA 1μL，ddH₂O补足至总体积为20μL。阳性对照(浓度为40000拷贝/μL的T抗-4基因组DNA)作为模板，ddH₂O为空白对照。

实施例4Real-time PCR体系检测玉米T抗-4的灵敏度试验

灵敏度是指PCR扩增反应能检出样品的最低拷贝数，即最低检测限。用Real-timePCR检测不同浓度的标准品时，当某个浓度的标准品能形成扩增曲线但Ct值>35时，则认为该浓度标准品超出了PCR体系的最低检测限。

使用实施例1中所述的探针、引物组合B10、实施例3所优化的反应体系，以及以实施例2的标准品(浓度200000、40000、8000、1600、320、64和12.8拷贝/μL)为模板(每个浓度3次平行试验)，ddH₂O为空白对照，进行Real-time PCR扩增，以确定本发明检测方法的最低检出限。根据仪器检测的荧光信号获得扩增曲线，结果见图6和表4。结果显示，当标准品浓度＜64拷贝/μL时，扩增曲线Ct＞35。因此，Real-time PCR的检出下限为64拷贝/μL。

上述灵敏度检测结果表明，当样品未出现典型扩增曲线或Ct值大于35，即样品中的转化体浓度低于64拷贝/μL，则认为样品中未检出T抗-4转化体，检测结果为阴性。

表4灵敏度试验结果

样品	A	B	C	D	E	F	G
								浓度(拷贝/μL)	200000	40000	8000	1600	320	64	12.8
Ct	23.14	25.45	27.96	30.27	32.60	34.8	36.72

实施例5绘制标准曲线

以梯度浓度的多个标准品作为模板进行Real-time PCR并记录Ct值，根据初始模板量(拷贝数的对数)及Ct值绘制标准曲线，得到标准方程。当需要对待测样品初始模板进行定量时，只需要得到扩增曲线，读得Ct值，带入标准方程即可算出待测样品的初始模板量。

取浓度200000、40000、8000、1600和320拷贝/μL的T抗-4基因组DNA样品为模板(每个浓度3次平行试验)，ddH₂O为空白对照，使用实施例1探针、引物组合B10，采用实施例2中的反应体系，进行Real-time PCR扩增，扩增曲线见图7。

以标准品浓度的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标，绘制标准曲线，见图8。本发明标准曲线方程为y＝-3.3964x+41.141(y表示Ct值，x为拷贝数的对数)，标准曲线呈良好的线性关系，R²＝0.9998，相关系数高，满足Real-time PCR定量检测的要求。

实施例6检测玉米转化体T抗-4的Real-time PCR试剂盒

按照下列组成配制用于检测玉米T抗-4的试剂盒：2×qPCR Mix，10μM上游引物、10μM下游引物、10μM探针、检测标准品(浓度为40000、8000、1600、320拷贝/μL)和ddH₂O。

上游引物、下游引物、探针为实施例1中所述组合B10。

该试剂盒的反应体系可以为：2×qPCR Mix 10μL，10μM上游引物0.4μL，10μM下游引物0.4μL，10μM探针0.2μL，模板DNA 1μL，ddH₂O 8μL，反应总体积为20μL。

该试剂盒进行Real-time PCR的反应程序为：95℃10min；95℃10s，60℃20s，72℃40s(收集荧光信号)，共进行40-45个循环。

应用该试剂盒对样品进行检测时，通过仪器所检测到的荧光信号获得扩增曲线，根据标准品建立的标准方程和待测样品的Ct值计算样品拷贝数。

实施例7特异性试验和样品检测

用实施例2的DNA提取方法(CTAB法)提取玉米转化体T抗-4、受体18599、其他转化体材料T抗-1、T抗-2的基因组DNA

以上述的玉米转化体T抗-4、受体18599、T抗-1和T抗-2的基因组DNA为模板，ddH₂O为空白对照，使用实施例6中所述的试剂盒，采用实施例3的反应体系进行Real-time PCR扩增，以进行特异性试验检测。根据仪器所检测到的荧光信号获得扩增曲线，如图9所示。

根据扩增曲线中各个样品的Ct值计算其拷贝数，结果如表5所示：玉米转化体T抗-4的扩增曲线Ct值为26.34，拷贝数为22795.52，检测结果为阳性；受体18599和其他转化体材料T抗-1、T抗-2的扩增曲线Ct值均大于35，拷贝数均低于最低检测限64，因此，检测结果均为阴性。由此可见，本发明建立的检测体系具有很好的特异性。

表5受试样品特异性试验检测结果

样品	Ct	拷贝数
			T抗-4	26.34	22795.52
18599	37.31	13.42
			T抗-1	36.80	18.97
T抗-2	36.64	21.14

实施例8不同荧光基团的测试

使用实施例1筛选的引物和探针组合B10，探针两端分别标记常用的不同种类的荧光基团和淬灭基团，如表6所示。使用实施例6中所述的试剂盒、采用实施例3的反应体系，以浓度40000拷贝/μL的标准品为模板(每个浓度3次平行试验)，进行Real-time PCR检测，以确定较合适的荧光标记基团。

根据仪器检测的荧光信号获得扩增曲线，如图10所示。结果表明，编号A、B、C、D、E和F的荧光标记组合均能成功扩增，扩增曲线的平均Ct值相近，介于26.5-27.5之间。但是，从扩增曲线的y轴高度来看，组合A、B和C的荧光收集效率较高。同时，在所有受试组合中，组合A的探针标记成本最低，所以将组合A(5’端标记FAM、3’端标记BHQ1)确定为优选探针标记方案。

表6探针两端标记不同荧光基团的测试

编号	5’端荧光基团	3’端淬灭基团	Ct
				A	FAM	BHQ1	26.56
B	FAM	BHQ2	26.73
				C	CY3	BHQ-X	27.31
D	HEX	DABCYL	26.83
				E	JOE	TAMRA	27.17
F	VIC	BHQ2	27.44

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110> 四川省农业科学院生物技术核技术研究所，武汉晨晖解码科技有限公司

<120> 一种鉴定核酸样品的特异性探针、引物、试剂盒和方法

<130> 1

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 187

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 1

cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg gaattaaact atcagtgttt tagaactagt 60

caataattat gatgggcgac attgggcagc cattgatcca acacgctttc ctacacaaac 120

agctcttgac tttatggtag cccaacatgg acagctaaga ttccattcca atcgctaaac 180

tctcacg 187

<210> 2

<211> 540

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 2

acatgtaaaa tacaaatgtt aacgagcaga tatcctggca gctaccagaa aacattttta 60

cctagagttg tcttttgtct acagaattcg tttgttaacc ttggtggcta gtaaatgtga 120

tgaaaccatg aaagaacaca tggaccacct ccaaaatcca gtgaactctg gtgctcttga 180

acaaaatggc tgaatacctt actatcttag cagctttaac gagagaggaa aaaaaaagga 240

caaccaactg tttttttcta atattatgtt aagaaagccg ctaggattgt cagcatatgt 300

tcccaaatgc tactgctaca ccgcgcatgg aacaaccatt tcaacttgaa caaatcacat 360

tatcaccctt gattttattg tggtgtaaac aaattgacgc ttagacaact taataacaca 420

ttgcggacgt ttttaatgta ctgaattaac gccgaattaa ttagtgagaa agcttgcatg 480

cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag ataatgagca ttgcatgtct 540

<210> 3

<211> 566

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 3

gcactgaagt tggtgacagc tcgaatttcc ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt 60

tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt 120

acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta 180

tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa 240

actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agatcgggaa ttaaactatc 300

agtgttttag aactagtcaa taattatgat gggcgacatt gggcagccat tgatccaaca 360

cgctttccta cacaaacagc tcttgacttt atggtagccc aacatggaca gctaagattc 420

cattccaatc gctaaactct cacgactctg ctaaaaaaat gagaacgcaa tatggatcga 480

gatgcctccg gcggtggggc ccgcgcgtca gcctgacgcg ggaagtcaag gtggcgactg 540

gcgagcttag aaagggaaga gtttgg 566

Claims (6)

1.探针，其特征在于：所述探针的核苷酸序列为5'-TGATGGGCGACATTGGGCAGC-3'；

任选地，所述探针5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；

任选地，所述荧光基团包括FAM、TET、HEX、CY3、JOE、VIC、ROX、CY5、TAMRA或Texas中的任一种；所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ-X、TAMRA、DABCYL或MGB中的任一种；

任选地，所述荧光基团和淬灭基团的组合为FAM/BHQ1、FAM/BHQ2、CY3/BHQ-X、

HEX/DABCYL、JOE/TAMRA或VIC/BHQ2中的任一种；

任选地，所述荧光基团和淬灭基团的组合为FAM/BHQ1。

2.探针和引物组合，其特征在于：包括权利要求1所述的探针和一条引物，所述引物的核苷酸序列为5'-CGCGCGGTGTCATCTATGT-3'；

任选地，所述探针和引物组合还包括另外一条引物，另外一条引物的核苷酸序列为5'

-CGTGAGAGTTTAGCGATTGGAAT-3'；或5'-AGAGTTTAGCGATTGGAATGGAAT-3'任意一个。

3.检测标准品，其特征在于：所述标准品为浓度不低于64拷贝/μL的一个或多个核酸样品；所述核酸样品含有SEQ ID NO.1所示序列的核酸分子；

任选地，所述检测标准品为5个浓度分别为200000拷贝/μL、40000拷贝/μL、8000拷贝/μL、1600拷贝/μL、320拷贝/μL的DNA样品；所述DNA样品含有SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

任选地，所述标准品的制备方法为：将浓度为1μg/μL的玉米T抗-4纯合转化体基因组DNA溶液分别稀释2倍、10倍、50倍、250倍、1250倍。

4.检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括权利要求2所述的探针和引物组合以及权利要求3所述的标准品；

任选地，所述检测试剂盒包括：

引物1，序列为5'-CGCGCGGTGTCATCTATGT-3'；

引物2，序列为5'-CGTGAGAGTTTAGCGATTGGAAT-3'；

探针，序列为5'-TGATGGGCGACATTGGGCAGC-3'；

标准品，为5个浓度分别为200000拷贝/μL、40000拷贝/μL、8000拷贝/μL、1600拷贝/μL、320拷贝/μL的DNA样品；所述DNA样品含有SEQ ID NO.1所示序列的核酸分子；

其中，所述探针5’端标记荧光基团FAM，3’端标记淬灭基团BHQ1。

5.Real-time PCR检测方法，其特征在于：使用权利要求4所述的检测试剂盒进行Real-time PCR检测；

其中，PCR反应体系中的引物1和引物2终浓度均为0.2μM，探针终浓度为0.1μM。

6.权利要求1所述的探针、权利要求2所述的探针和引物组合、权利要求3所述的检测标准品、权利要求4所述的检测试剂盒、权利要求5所述的检测方法在定性或定量检测核酸样品中的应用；

其中，所述核酸样品含有SEQ ID NO.1所示序列的核酸分子。

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