CN108977439B - 一种辅助鉴定小麦冠层温度性状的方法及其专用引物组 - Google Patents

一种辅助鉴定小麦冠层温度性状的方法及其专用引物组 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种辅助鉴定小麦冠层温度性状的方法及其专用引物组。本发明提供了特异引物组，由序列1所示引物A、序列2所示引物B和序列3所示引物C组成。本发明还保护一种鉴定待测小麦的冠层温度性状的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于特异SNP的基因型；CC基因型小麦的冠层温度低于AA基因型小麦。本发明还保护一种鉴定待测小麦的冠层温度性状的方法，包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述引物组进行KASP，进行荧光扫描，确定待测小麦基于特异SNP的基因型，CC基因型小麦的冠层温度低于AA基因型小麦。本发明可以用于筛选冠层温度性状优良的小麦，在培育抗旱小麦品种中发挥重要作用。

Description

一种辅助鉴定小麦冠层温度性状的方法及其专用引物组
技术领域
本发明涉及一种辅助鉴定小麦冠层温度性状的方法及其专用引物组。
背景技术
冠层温度、植被覆盖指数和叶绿素含量是小麦重要抗旱相关生理性状。其中冠层温度指作物冠层不同高度茎、叶等器官表面温度的平均值，由气孔导度、维管束强度及根系深度等多种性状共同调节，反应了植株整体水分状况。干旱胁迫下，作物冠层吸收太阳辐射，一部分用于光合作用中光化学反应，一部分用于辐射荧光，剩余部分转化为热能，使得植株冠层温度升高。持绿型小麦叶片能将较多太阳辐射能用于光合作用中光化学反应，释放较少热能，冠层温度显著低于高温敏感性小麦，获得更高的生物量与产量。综上，冠层温度不仅被认为是评价小麦抗旱性品系筛选重要指标，也可为拓宽持绿型小麦应用范围提供辅助选择。然而，抗旱生理性状易受环境影响，测定过程技术要求高。例如冠层温度受种植密度和植被覆盖指数影响较大，测定时由于红外线投射角度不同可能造成1℃以上偏差。
分子标记技术将复杂的数量性状分解成简单的质量性状来研究，具有环境稳定性、操作简便性等优点。小麦遗传结构复杂，通过构建高密度遗传图谱发掘分子标记，可从基因层面瞄定抗旱相关生理性状，缩短从复杂环境中筛选理想株系的鉴定过程，为推进小麦抗旱育种提供技术支撑。
发明内容
本发明的目的是提供一种辅助鉴定小麦冠层温度性状的方法及其专用引物组。
本发明提供了一种特异引物组，由引物A、引物B和引物C组成；
引物A为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
引物B为如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
引物C为如下(c1)或(c2)：
(c1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子。
本发明还保护所述引物组的应用，为如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)或(d5)或(d6)或(d7)或(d8)：
(d1)鉴定小麦基于特异SNP的基因型；
(d2)鉴定或辅助鉴定小麦的冠层温度性状；
(d3)筛选或选育具有低冠层温度的小麦单株或株系或品系或品种；
(d4)筛选或选育具有高冠层温度的小麦单株或株系或品系或品种；
(d5)制备鉴定小麦基于特异SNP的基因型的产品；
(d6)制备鉴定或辅助鉴定小麦的冠层温度性状的产品；
(d7)制备筛选或选育低冠层温度小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(d8)制备筛选或选育高冠层温度小麦单株或株系或品系或品种的产品。
本发明还保护一种试剂盒，包括所述特异引物组。
所述试剂盒还包括特异引物组。所述特异探针组由荧光探针A、淬灭探针A、荧光探针B和淬灭探针B；荧光探针A如序列表的序列6所示，5’末端连接荧光基团；荧光探针B如序列表的序列7所示，5’末端连接荧光基团；荧光探针A和荧光探针B中的荧光基团不同；淬灭探针A如序列表的序列8所示，3’末端连接淬灭基团；淬灭探针B如序列表的序列9所示，3’末端连接淬灭基团。荧光探针A具体连接FAM荧光基团。荧光探针B具体连接HEX荧光基团。淬灭探针A具体连接淬灭基团BHQ。淬灭探针B具体连接淬灭基团BHQ。
所述试剂盒还包括KASP 2×Master Mix。
本发明还保护所述试剂盒的应用，为如下(f1)或(f2)或(f3)或(f4)：
(f1)鉴定小麦基于特异SNP的基因型；
(f2)鉴定或辅助鉴定小麦的冠层温度性状；
(f3)筛选或选育具有低冠层温度的小麦单株或株系或品系或品种；
(f4)筛选或选育具有高冠层温度的小麦单株或株系或品系或品种。
本发明还保护一种鉴定待测小麦的冠层温度性状的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于特异SNP的基因型；CC基因型小麦的冠层温度低于AA基因型小麦。
本发明还保护一种小麦育种的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于特异SNP的基因型；选择CC基因型小麦进行育种。所述小麦育种的目的为选育低冠层温度的小麦。
本发明还保护一种鉴定待测小麦的冠层温度性状的方法，包括如下步骤：
(1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述引物组进行KASP；
(2)完成步骤(1)后，进行荧光扫描，确定待测小麦基于特异SNP的基因型；
(3)根据基因型结果进行判断：CC基因型小麦的冠层温度低于AA基因型小麦。
所述方法中，确定待测小麦基于特异SNP的基因型的方法为：采用Kluster Caller软件对酶标仪扫描数据进行分析，显示为红色的样本的基因型为CC纯合型，显示为蓝色的样本的基因型为AA纯合型。
所述方法中，确定待测小麦基于特异SNP的基因型的方法为：采用Kluster Caller软件对酶标仪扫描数据进行分析，显示为红色的样本的基因型为CC纯合型，显示为蓝色的样本的基因型为AA纯合型，显示为绿色的样本的基因型为AC杂合型。
所述方法中，KASP的反应体系：模板溶液3μL、引物工作液0.1μL、KASP 2×MasterMix 2.0μL、无菌超纯水0.1μL。
所述方法中，KASP在PTC-200PCR扩增仪上进行。
所述方法中，KASP的反应程序：
第一步：94℃预变性15min；
第二步：94℃20s、65℃60s，95℃20s、64℃60s，95℃20s、63℃60s，95℃20s、62℃60s，95℃20s、61℃60s，95℃20s、60℃60s，95℃20s、59℃60s，95℃20s、58℃60s，95℃20s、57℃60s；
第三步：94℃变性20s、57℃退火60s，32个循环；
第四步：72℃延伸5min。
本发明还保护一种小麦育种的方法，包括如下步骤：
(1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述引物组进行KASP；
(2)完成步骤(1)后，进行荧光扫描，确定待测小麦基于特异SNP的基因型；
(3)选择CC基因型小麦进行育种。
所述方法中，确定待测小麦基于特异SNP的基因型的方法为：采用Kluster Caller软件对酶标仪扫描数据进行分析，显示为红色的样本的基因型为CC纯合型，显示为蓝色的样本的基因型为AA纯合型。
所述方法中，确定待测小麦基于特异SNP的基因型的方法为：采用Kluster Caller软件对酶标仪扫描数据进行分析，显示为红色的样本的基因型为CC纯合型，显示为蓝色的样本的基因型为AA纯合型，显示为绿色的样本的基因型为AC杂合型。
所述方法中，KASP的反应体系：模板溶液3μL、引物工作液0.1μL、KASP 2×MasterMix 2.0μL、无菌超纯水0.1μL。
所述方法中，KASP在PTC-200PCR扩增仪上进行。
所述方法中，KASP的反应程序：
第一步：94℃预变性15min；
第二步：94℃20s、65℃60s，95℃20s、64℃60s，95℃20s、63℃60s，95℃20s、62℃60s，95℃20s、61℃60s，95℃20s、60℃60s，95℃20s、59℃60s，95℃20s、58℃60s，95℃20s、57℃60s；
第三步：94℃变性20s、57℃退火60s，32个循环；
第四步：72℃延伸5min。
所述小麦育种的目的为选育低冠层温度的小麦。
以上任一所述特异SNP为如下(e1)或(e2)：
(e1)位于小麦基因组中的序列表的序列4所示DNA分子的第36位核苷酸；
(e2)位于小麦基因组中的序列表的序列5所示DNA分子的第45位核苷酸。
以上任一所述特异SNP为A/C多态。
本发明还保护一种特异DNA分子，如序列表的序列4或序列表的序列5所示。
本发明还保护所述特异DNA分子在鉴定或辅助鉴定小麦的冠层温度性状中的应用。所述应用中，所述特异DNA分子作为检测靶标。
以上任一所述冠层温度为植株花后14天的冠层温度。
以上任一所述冠层温度是采用Optris LS双功能便携式红外测温仪进行检测的。
以上任一所述待测小麦为：扬麦16、中麦895、阿夫、CA1055、CA1133、轮选987、京冬8号、秦农731、皖麦52、济宁16、济麦21、鲁麦15、洛麦21、川麦52、绵阳26或宁麦9号。
本发明提供了一个小麦冠层温度主效基因位点QCT.caas-2BL(1292cM)及该位点的辅助筛选小麦冠层温度相关基因的SNP位点。利用该SNP位点可以筛选冠层温度性状优良的小麦，在培育抗旱小麦品种中发挥重要作用。
附图说明
图1为遗传连锁图谱。
图2为基因型检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中的冠层温度均是在植株花后14天(从植株开花开始记天数的第14天)，采用Optris LS双功能便携式红外测温仪进行检测的。
实施例1、与小麦冠层温度相关基因的SNP标记AX94392210的获得
一、DH群体的获得
中麦895是中国农业科学院作物科学研究所、中国农业科学院棉花研究所以周麦16为母本、荔垦4号为父本杂交选育而成的半冬性多穗型中晚熟品种，具备叶片功能期长、分蘖能力强、灌浆速度快等特性。2009年9月通过国家黄淮麦区南片审定。在2013-2015年三年品种比较试验和大田示范中，中麦895表现出高产广适、抗病抗倒、灌浆后期耐高温等特点。
扬麦16是长江中下游麦区种植面积最大的品种，具有灌浆速度快、粒重高等特点。
以扬麦16为母本，中麦895为父本，构建DH群体，含多个家系。
二、冠温表型调查
检测冠层温度。
三、SNP标记分析
1、将待测小麦基因组DNA进行全基因组扩增。
2、扩增产物用随机内切酶酶切断化。
3、将DNA片段与将DNA片段与芯片进行杂交，芯片的微珠上连接有50-mers长度特异性捕获探针，gDNA酶切后产物与探针互补序列结合。
4、清洗去除未杂交上的或错配杂交上的DNA片段。
5、二硝基酚(dinitrophenol)和生物素(biotin)标记的核苷酸底物(A/T和C/G)在捕获探针上进行单碱基延伸，只有与gDNA发生互补结合的探针才能得到延伸；通过染色，A/T和C/G将分别标记不同的荧光染料。
6、芯片扫描，并利用软件根据两种荧光判读并输出分型结果。
利用Illumina SNP基因分型研究平台进行660k SNP芯片分型(包括BS、BobWhite、CAP、D_contig等系列标记，共计630518个)，其中626276个SNP标记在扬麦16/中麦895DH群体内存在差异。
四、关联基因定位和连锁标记AX94392210的发现
利用SAS9.2软件(SAS Institute.2000)进行基本统计量、多重比较分析，并结合SAS的Glmselect程序对SNP数据和NDVI结果进行逐步回归，根据P值(P<0.01)判断关联位点。利用IciMappingV4.1定位出AX94392210与位点QCT.caas-2BL关联(P<0.001)。
根据Wheat DArT maps Version 1.2(http://www.triticarte.com.au)和Allen等(2011)公布的小麦分子标记图谱，将标记AX94392210整合到小麦遗传图谱上，结果见图1，QCT.caas-2BL在染色体2BL上的1292cM位置。
五、将SNP标记AX94392210转换为KASP标记并设计用于检测该标记的引物组
将SNP标记AX94392210转化为KASP标记，以用于分子标记辅助选择育种。
设计基于KASP技术检测KASP标记的引物组，简称KASP引物组。KASP引物组由两条上游引物(引物A和引物B)和一条下游引物(引物C)组成。
引物A的核苷酸序列如序列表的序列1所示。
序列1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGCCCTCCTCCTCATCTTT-3’。
引物B的核苷酸序列如序列表的序列2所示。
序列2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGCCCTCCTCCTCATCTTG-3’。
引物C的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
序列3：5’-CGACATGGGATGCAGCTG-3’。
特异SNP位于小麦基因组中的序列表的序列4所示DNA分子的第36位核苷酸，相应的特异SNP位于小麦基因组中的序列表的序列5所示DNA分子的第45位核苷酸。
基于特异SNP，扬麦16为AA基因型(已经测序验证)，中麦895为CC基因型(已经测序验证)。
实施例2、方法的建立
1、提取待测小麦的叶片的基因组DNA，经稀释得到模板溶液。模板溶液中的DNA浓度约为20ng/μL。
2、进行KASP。
引物工作液：取引物A、引物B和引物C，用无菌超纯水补至100μL，充分混匀。引物工作液中，引物A、引物B和引物C的浓度均为100μM。
KASP 2×Master Mix为LGC公司产品(货号KBS-1016-002)。KASP 2×Master Mix中含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A、淬灭探针B、高保真Taq酶、dNTP、Mg2+等。荧光探针A的序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，5’末端连接FAM荧光基团。荧光探针B的序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，5’末端连接HEX荧光基团。淬灭探针A的序列为5’-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3’，3’末端连接淬灭基团BHQ。淬灭探针B的序列为5’-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3’，3’末端连接淬灭基团BHQ。
KASP的反应体系：步骤1制备的模板溶液3μL、引物工作液0.1μL、KASP 2×MasterMix 2.0μL、无菌超纯水0.1μL。
KASP在PTC-200PCR扩增仪上进行，采用Touch down PCR扩增程序。
KASP的反应程序：
第一步：94℃预变性15min；
第二步：94℃20s、65℃60s，95℃20s、64℃60s，95℃20s、63℃60s，95℃20s、62℃60s，95℃20s、61℃60s，95℃20s、60℃60s，95℃20s、59℃60s，95℃20s、58℃60s，95℃20s、57℃60s；
第三步：94℃变性20s、57℃退火60s，32个循环；
第四步：72℃延伸5min；10℃保存。
3、进行荧光扫描。
完成步骤2后，采用多功能酶标仪进行扫描。FAM激发波长为485nm，发射波长为520nm。HEX激发波长为535nm，发射波长为556nm。系统参比荧光ROX激发波长为575nm，发射波长为610nm。
4、进行等位基因分型。
完成步骤3后，采用Kluster Caller软件对酶标仪扫描数据进行分析(具体方法参照Kluster Caller软件说明书，公众可从LGC公司获得)，根据分析结果确定待测小麦基于特异SNP的基因型。
显示为红色的样本的基因型为CC纯合型，显示为蓝色的样本的基因型为AA纯合型，显示为绿色的样本的基因型为AC杂合型。
实施例3、应用KASP引物组检测DH群体中的家系
待测小麦：实施例1中得到的DH群体中的14个家系。
1、检测待测小麦基于特异SNP的基因型，方法同实施例2。
2、检测待测小麦的冠层温度。
结果见表1。
表1AX94392210标记等位变异在扬麦16/中麦895DH群体中的分离
Figure BDA0001786798320000071
CC基因型的小麦的冠层温度低于AC/AA基因型的小麦。
实施例4、应用KASP引物组检测现有小麦材料
待测小麦：阿夫、CA1055、CA1133、轮选987、京冬8号、秦农731、皖麦52、济宁16、济麦21、鲁麦15、洛麦21、川麦52、绵阳26、宁麦9号。
1、检测待测小麦基于特异SNP的基因型，方法同实施例2。
结果见图2和表2。
2、待测小麦2017年夏种植于在中国农业科学院作物科学研究所东边农场。采用完全随机区组设计，行长1.5m，行距25cm，株距10cm，每个品种3行种植，3次重复。田间管理同一般大田生产。检测冠层温度。
结果见表2。CC纯合型小麦的平均冠层温度显著低于AA纯合型小麦。
表2 15个小麦品种SNP位点基因型和冠层温度结果
Figure BDA0001786798320000081
上述结果表明，上述SNP位点可以快速、准确地鉴定小麦的冠层温度性状。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 一种辅助鉴定小麦冠层温度性状的方法及其专用引物组
<130> GNCYX181738
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc tggccctcct cctcatcttt 40
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat tggccctcct cctcatcttg 40
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
cgacatggga tgcagctg 18
<210> 4
<211> 71
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)
<223> m =a or c
<400> 4
atgcagctgg gtttggtggc accggtccat aataamaaga tgaggaggag ggccggttca 60
gtaagtaagt a 71
<210> 5
<211> 80
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)
<223> m =a or c
<400> 5
cgacatggga tgcagctggg tttggtggca ccggtccata ataamaagat gaggaggagg 60
gccggttcag taagtaagta 80
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
gaaggtgacc aagttcatgc t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
gaaggtcgga gtcaacggat t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
agcatgaact tggtcacctt c 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
aatccgttga ctccgacctt c 21

Claims (6)

1.特异引物组，由引物A、引物B和引物C组成；
引物A为序列表的序列1所示的单链DNA分子；
引物B为序列表的序列2所示的单链DNA分子；
引物C为序列表的序列3所示的单链DNA分子。
2.权利要求1所述引物组的应用，为如下（d1）或（d2）或（d3）或（d4）或（d5）或（d6）或（d7）或（d8）：
（d1）鉴定小麦基于特异SNP的基因型；
（d2）鉴定或辅助鉴定小麦的冠层温度性状；
（d3）筛选或选育具有低冠层温度的小麦单株或株系或品系或品种；
（d4）筛选或选育具有高冠层温度的小麦单株或株系或品系或品种；
（d5）制备鉴定小麦基于特异SNP的基因型的产品；
（d6）制备鉴定或辅助鉴定小麦的冠层温度性状的产品；
（d7）制备筛选或选育低冠层温度小麦单株或株系或品系或品种的产品；
（d8）制备筛选或选育高冠层温度小麦单株或株系或品系或品种的产品；
所述特异SNP为如下（e1）或（e2）：
（e1）位于小麦基因组中的序列表的序列4所示DNA分子的第36位核苷酸；
（e2）位于小麦基因组中的序列表的序列5所示DNA分子的第45位核苷酸。
3.一种试剂盒，包括权利要求1所述特异引物组。
4.权利要求3所述试剂盒的应用，为如下（f1）或（f2）或（f3）或（f4）：
（f1）鉴定小麦基于特异SNP的基因型；
（f2）鉴定或辅助鉴定小麦的冠层温度性状；
（f3）筛选或选育具有低冠层温度的小麦单株或株系或品系或品种；
（f4）筛选或选育具有高冠层温度的小麦单株或株系或品系或品种；
所述特异SNP为如下（e1）或（e2）：
（e1）位于小麦基因组中的序列表的序列4所示DNA分子的第36位核苷酸；
（e2）位于小麦基因组中的序列表的序列5所示DNA分子的第45位核苷酸。
5.一种鉴定待测小麦的冠层温度性状的方法，包括如下步骤：
（1）以待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述引物组进行KASP；
（2）完成步骤（1）后，进行荧光扫描，确定待测小麦基于特异SNP的基因型；
（3）根据基因型结果进行判断：CC基因型小麦的冠层温度低于AA基因型小麦；
所述特异SNP为如下（e1）或（e2）：
（e1）位于小麦基因组中的序列表的序列4所示DNA分子的第36位核苷酸；
（e2）位于小麦基因组中的序列表的序列5所示DNA分子的第45位核苷酸。
6.一种小麦育种的方法，包括如下步骤：
（1）以待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述引物组进行KASP；
（2）完成步骤（1）后，进行荧光扫描，确定待测小麦基于特异SNP的基因型；
（3）选择CC基因型小麦进行育种；
所述特异SNP为如下（e1）或（e2）：
（e1）位于小麦基因组中的序列表的序列4所示DNA分子的第36位核苷酸；
（e2）位于小麦基因组中的序列表的序列5所示DNA分子的第45位核苷酸。
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