CN108841994B - 冬小麦中麦895遗传背景下持绿相关基因标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了冬小麦中麦895遗传背景下持绿相关基因的标记及应用。本发明提供了用于检测小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段(SEQ ID No.4)的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G的物质在如下任一中的应用：(A)鉴定或辅助鉴定小麦NDVI；(B)选育NDVI高的小麦品种；(C)鉴定或辅助鉴定小麦持绿性；(D)选育具有持绿性的小麦品种。本发明提供了一个小麦NDVI主效基因位点QNDVI.caas‑5A及该位点的辅助筛选小麦NDVI相关基因的SNP位点。利用该SNP位点可以筛选小麦持绿性状优良的小麦，在培育耐旱小麦品种中发挥重要作用。

Description

冬小麦中麦895遗传背景下持绿相关基因标记及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及冬小麦中麦895遗传背景下持绿相关基因标记及应用。

背景技术

随着全球变暖的趋势和极端气候的不断发生，干早对小麦持续增产的限制作用越来越明显，分析小麦抗旱相关性状遗传机制及选育携有高产抗旱性状的近等基因系可为选育高产品种提供基础。近年来通过植物表型组学研究増强作物应对胁迫机制成为作物遗传研究领域的热点，表型研究将加深我们对作物基因组、环境和表型三者间互作机制的理解,提高作物应对胁迫的预测能力，为基因克隆和分子机理研究提供理论指引。

生理调控是小麦应对干旱胁迫的主要途径，抗旱相关生理性状的应用有助于育种家由“经验选择”转变为高效定向的“精准选择”，从而提高抗旱育种效率(Reynolds等，2001)。冠层温度、植被覆盖指数和叶绿素含量是小麦重要的抗旱相关生理性状(Bort etal等,2005；Reynolds等,2007；Lobos et al.,2014；Yousfi等，2016)。其中，NormalizedDifference Vegetation Index(NDVI)是反映土地复盖植被状况的一种遥感指标，能很好的反映植被生长状况，解析生物量及养分含量(如氮素)等冠层相关特性(Troy等，2016)。由于其测定过程高效快速，应用广泛(可用于预测籽粒产量和品质、评估生物量的积累及生长速率等方面)，已被普遍用于大田作物的监测(Zhao等，2013)。在小麦不同生育期，光谱反射率随植被与土壤信息不断变化，NDVI也随时间发生动态变化(Ren等，2006)。植被覆盖指数从群体水平反映了植株的持绿性，干旱胁迫下持绿性作物叶片仍能保持绿色进行光合作用，利于延长干物质积累，减轻对产量和品质的影响。

对植株持绿特性传统的监测方法是借助田间高通量数据采集手段，测定生育后期叶绿素含量、叶面积指数、冠层温度等的动态变化，但此方法耗时耗力，常受外界环境和人工因素等影响，其中植被覆盖指数受种植密度影响较大，限制了生理性状在小麦抗旱性改良中的应用(Pask等，2011)。

分子标记能够为不同生理性状建立“分子指纹”，具有环境稳定性、操作简便性、评价客观性等优点，为生理育种提供了新的思路，目前已经在多种作物的分子改良中得到应用。例如，S.Dixit等(2017)利用抗旱相关数量性状位点qDTY辅助选择，进一步提高了水稻主栽品种Sabitri的抗旱性；F.Bankole等(2017)研究表明分子标记聚合育种能有效提高旱地玉米产量。在小麦中，NDVI和产量一样能够反应胁迫环境下植株的耐旱能力，最终体现在调控耐旱性状相关的数量性状位点(QTL)。众所周知，探究开花期单基因的影响是小麦植株干旱适应性的重要性状(Tuberosa等，2012)，并已定位出一系列影响开花期，NDVI和其他耐旱性状的关键基因(PPD-A1,PPD-B1,FT-7A-indel,Rht-B1b,and VRN-A1)，(Milner等，2016)。因此，在探究与耐旱性状相关的基因位点时，应对开花期及花后不同时段进行独立测定来提高表型数据准确性，结合高密度遗传图谱进一步发掘分子标记是目前小麦抗旱性研究的重要内容。

中麦895是中国农业科学院作物科学研究所、中国农业科学院棉花研究所以周麦16为母本、荔垦4号为父本杂交选育而成的半冬性多穗型中晚熟品种，具备叶片功能期长、分蘖能力强、灌浆速度快等特性。2009年9月通过国家黄淮麦区南片审定。在2013-2015年三年品种比较试验和大田示范中，中麦895表现出高产广适、抗病抗倒、灌浆后期耐高温等特点。扬麦16是长江中下游麦区种植面积最大的品种，具有灌浆速度快、粒重高等特点。

发明内容

本发明的目的是提供一种冬小麦中麦895遗传背景下持绿相关基因标记及应用。

第一方面，本发明要求保护用于检测小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G的物质在如下任一中的应用：

(A)鉴定或辅助鉴定小麦NDVI相关基因；

(B)选育NDVI高的小麦品种；

(C)鉴定或辅助鉴定小麦持绿性；

(D)选育具有持绿性的小麦品种。

所述小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的核苷酸序列为SEQ IDNo.4。

其中，所述用于检测小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G的物质可为任何能够检测小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G的物质，如下述成套引物或含有所述成套引物的试剂或试剂盒。

所述成套引物中含有两条上游引物和一条下游引物；

所述上游引物根据所述小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸及其上游序列进行设计，且一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为所述小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸A，另一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为所述小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸G；所述下游引物根据所述小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸的下游序列进行设计。

进一步地，所述成套引物可为由SEQ ID No.1的第22-39位所示的单链DNA分子或其衍生物、SEQ ID No.2的第22-39位所示的单链DNA分子或其衍生物和SEQ ID No.3所示的单链DNA分子组成的成套引物。

更进一步地，所述SEQ ID No.1的第22-39位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQID No.1的第22-39位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧光序列A。所述SEQ ID No.2的第22-39位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ ID No.2的第22-39位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧光序列B。

在所述试剂或试剂盒中，还可含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B。

所述荧光探针A为与所述特异荧光序列A一致的序列，5’末端连接荧光报告基团A；所述淬灭探针A为所述特异荧光序列A的反向互补序列，3’末端连接荧光淬灭基团。

所述荧光探针B为与所述特异荧光序列B一致的序列，5’末端连接荧光报告基团B；所述淬灭探针B为所述特异荧光序列B的反向互补序列，3’末端连接荧光淬灭基团。

进一步地，所述特异荧光序列A和所述特异荧光序列B，其一可为荧光序列FAM，另一可为荧光序列HEX。相应的，所述荧光报告基团A和所述荧光报告基团B，其一可为FAM，另一可为HEX；所述荧光淬灭基团可为BHQ。

第二方面，本发明要求保护如下任一方法：

方法A：一种检测小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G的方法。该方法可包括如下步骤(A1)或(A2)：

(A1)直接测序；

(A2)用前文第一方面中所述的试剂或试剂盒对待测小麦基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR产物，将所述PCR产物用荧光酶标仪(如PHERAstar^plus荧光酶标仪)进行照射，然后按照如下确定所述待测小麦基因中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G：

若所述PCR产物仅显示SEQ ID No.1所示的单链DNA分子5'端连接的特异荧光序列对应的荧光报告基团的颜色，则所述待测小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体；

若所述PCR产物仅显示SEQ ID No.2所示的单链DNA分子5'端连接的特异荧光序列对应的荧光报告基团的颜色，则所述待测小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体；

若所述PCR产物显示SEQ ID No.1所示的单链DNA分子5'端连接的特异荧光序列对应的荧光报告基团的颜色和SEQ ID No.2所示的单链DNA分子5'端连接的特异荧光序列对应的荧光报告基团的颜色，则所述待测小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A和G的杂合体；

在本发明的具体实施方式中，上述第一方面中所述特异荧光序列A具体为荧光序列FAM；所述特异荧光序列B具体为荧光序列HEX；所述荧光序列FAM具体为SEQ ID No.1的第1-21位；所述荧光序列HEX具体为SEQ ID No.2的第1-21位(即所述成套引物具体为由SEQID No.1所示的单链DNA分子、SEQ ID No.2所示的单链DNA分子和SEQ ID No.3所示的单链DNA分子组成的成套引物)。相应的，所述荧光报告基团A具体为FAM，所述荧光报告基团B具体为HEX。

相应的，在第二方面中的所述方法A中，若所述PCR产物显示蓝色，则所述待测小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体；若所述PCR产物显示红色，则所述待测小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体；若所述PCR产物显示绿色，则所述待测小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A和G的杂合体。

方法B：一种鉴定或辅助鉴定小麦NDVI的方法。该方法可包括如下步骤：

(B1)检测小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G；

(B2)按照如下确定小麦NDVI：基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体的待测小麦的NDVI高于基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体或者是A和G的杂合体的待测小麦的NDVI。

方法C：一种选育NDVI高的小麦品种的方法。该方法可包括如下步骤：

(C1)检测小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G；

(C2)选择基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育，得到NDVI高的小麦品种。

方法D：一种鉴定或辅助鉴定小麦持绿性的方法。该方法可包括如下步骤：

(D1)检测小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G；

(D2)按照如下确定小麦持绿性：基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体的待测小麦的持绿性好于基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体或者是A和G的杂合体的待测小麦的持绿性。

方法E：一种选育具有持绿性的小麦品种的方法。该方法可包括如下步骤：

(E1)检测小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G；

(E2)选择基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育，得到具有持绿性的小麦品种。

进一步地，在所述方法B、所述方法C、所述方法D和所述方法E中，所述检测小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G的方法均可为所述方法A。

第三方面，本发明要求保护具有如下(A)-(D)中至少一种功能的物质：

(A)鉴定或辅助鉴定小麦NDVI相关基因；

(B)选育NDVI高的小麦品种；

(C)鉴定或辅助鉴定小麦持绿性；

(D)选育具有持绿性的小麦品种。

所述物质为前文第一方面中所述的用于检测小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G的物质。

第四方面，本发明要求保护前文所述的方法或所述的物质在培育具有如下性状中至少一种的小麦品种中的应用：

(a)NDVI高；

(b)具有持绿性；

(c)具有抗旱性。

在本发明中，所述NDVI为归一化植被指数。

在前文各方面中，所述NDVI高是指0.40≤NDVI≤0.66。

在前文各方面中，所述NDVI为灌浆中后期NDVI(或所述小麦NDVI为小麦灌浆中后期NDVI)。

进一步地，在本发明中，所述灌浆中后期NDVI具体为花后21天NDVI。

在前文各方面中，所述小麦可为如下品种中的任一种或任几种：阿夫、CA1055、CA1133、轮选987、京冬8号、秦农731、皖麦52、济宁16、济麦21、鲁麦15、洛麦21、川农52、绵阳26、宁麦9号、镇麦6号。

在本发明中，所述基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体的待测小麦的所述花后21天NDVI指数具体为0.40≤NDVI≤0.66。

本发明在开花期至成熟期，田间每7天测定扬麦16/中麦895DH群体NDVI，利用660kSNP芯片对不同时期NDVI结果进行QTL定位，得到一个花后21天调控NDVI的主效QTL位点，利用紧密连锁的SNP标记转化为KASP标记，为小麦分子标记辅助选择育种提供理论参考。

实验证明，本发明提供了一个小麦NDVI主效基因位点QNDVI.caas-5A及该位点的辅助筛选小麦NDVI相关基因的SNP位点。利用该SNP位点可以筛选小麦持绿性状优良的小麦，在培育耐旱小麦品种中发挥重要作用。

附图说明

图1为扬麦16和中麦895花后21天的表型及NDVI对比图。A为表型(左为中麦895，右为扬麦16)；B为花后21天NDVI(右为中麦895，左为扬麦16)。图中，中麦895的持绿性更强。

图2为SNP标记AX95084118与QNDVI.caas-5A基因的连锁图。

图3为供试小麦品种NDVI基因的KASP标记检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

所有引物合成均由北京奥科生物技术有限责任公司完成。以下实施例中所有用到的小麦材料均来自中国农业科学院国家农作物种质保存中心。

实施例1、与小麦NDVI相关的SNP标记的获得

选用扬麦16/中麦895DH群体，包括亲本共200个家系。

图1为扬麦16和中麦895花后21天NDVI对比图。

一、持绿表型调查

采用GreenSeeker 505在晴朗无风的天气测定植被覆盖指数(NDVI)，测定时始终保持探头在植株顶端上方60cm处。测定时期为开花期及花后每7天直至成熟，共4个时期，记为S1—S4。

二、引物获得和标记分析

SNP(单核苷酸多态性)标记在博奥生物有限公司(CapitalBio Corporation,Beijing,China；http://bioservices.capitalbio.com)利用Illumina SNP基因分型检测，主要分为以下步骤：1)将待测小麦品种基因组DNA进行全基因组扩增；2)扩增产物用随机内切酶酶切断化；3)将DNA片段与将DNA片段与芯片进行杂交，芯片的微珠上连接有50-mers长度特异性捕获探针，gDNA酶切后产物与探针互补序列结合；4)清洗去除未杂交上的或错配杂交上的DNA片段；5)二硝基酚(dinitrophenol)和生物素(biotin)标记的核苷酸底物(A/T和C/G)在捕获探针上进行单碱基延伸，只有与gDNA发生互补结合的探针才能得到延伸；通过染色，A/T和C/G将分别标记不同的荧光染料；6)芯片扫描，并利用软件根据两种荧光判读并输出分型结果。

利用Illumina SNP基因分型研究平台对扬麦16/中麦895DH群体进行660k SNP芯片分型，包括BS、BobWhite、CAP、D_contig等系列标记，共计630518个，其中626276个SNP标记在扬麦16/中麦895DH群体内存在差异。

三、关联基因定位和连锁标记AX95084118的发现

利用SAS9.2软件(SAS Institute.2000)进行基本统计量、多重比较分析，并结合SAS的Glmselect程序对SNP数据和叶绿素进行逐步回归，根据P值(P<0.01)判断关联位点。利用IciMappingV4.1定位出AX95084118与位点QNDVI.caas-5AL关联(P<0.001)。

四、AX95084118位点的等位基因特异标记鉴定

分别提取15个扬麦16/中麦895DH群体的全基因组DNA。以各个基因组DNA为模板用SNP标记AX95084118位点的等位基因特异标记KASP^TM基因分型检测(所用引物为SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3)，出现A:A分型的片段表明SNP标记AX95084118能够有效鉴定小麦花后21天NDVI指数(表1)。表1显示分型结果表1AX95084118标记等位变异在扬麦16/中麦895DH群体中的分离

结果表明，AX95084118位点的基因型仅为A:A时，与小麦花后21天NDVI指数范围相符，说明AX95084118位点能够有效鉴定小麦花后21天NDVI指数。

根据Wheat DArT maps Version 1.2(http://www.triticarte.com.au)和Allen等(2011)公布的小麦分子标记图谱，将标记AX95084118整合到小麦遗传图谱上，结果如图2所示，确定QNDVI.caas-5A在染色体5A上的624cM位置。

标记AX95084118所对应的SNP位点为小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的核苷酸序列(即SEQ ID No.4)自5’末端起第36位核苷酸，该核苷酸为A或G。

实施例2、AX95084118SNP位点的应用

选用15个非扬麦16/中麦895DH群体的后代品种和两个亲本。其中15个非扬麦16/中麦895DH群体后代品种为测试组，中麦895和扬麦16为对照组；包括阿夫、CA1055、CA1133、轮选987、京冬8号、秦农731、皖麦52、济宁16、济麦21、鲁麦15、洛麦21、川农52、绵阳26、宁麦9号、镇麦6号。

一、检测不同品种小麦花后21天NDVI

小麦品种NDVI鉴定于2017年夏在中国农业科学院作物科学研究所东边农场进行。采用GreenSeeker 505在晴朗无风的天气测定植被覆盖指数(NDVI)，测定时始终保持探头在植株顶端上方60cm处。采用完全随机区组设计，行长1.5m，行距25cm，株距10cm，每个品种3行种植，3次重复。田间管理同一般大田生产。于开花期及花后每7天测定不同品种NDVI指数，共记5个时期。

二、检测不同品种小麦SNP位点的基因型

1、检测AX95084118SNP位点的引物组设计

根据AX95084118SNP位点在染色体5A上的624cM位置的基因片段的核苷酸序列(即SEQ ID No.4)，设计测AX95084118SNP位点的引物组如下：

上游引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCCGAGGTTGAGTCCACA-3’(SEQ ID No.1，下划线部分为特异荧光序列FAM)；

上游引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCCGAGGTTGAGTCCACG-3’(SEQ ID No.2，下划线部分为特异荧光序列HEX)；

下游引物：5’-ACAAGGTGCAATAGCTCAGG-3’(SEQ ID No.3)。

上述SEQ ID No.1所示的单链DNA分子与SEQ ID No.3所示的单链DNA分子扩增AX95084118SNP位点基因型为A:A的片段。

上述SEQ ID No.2所示的单链DNA分子与SEQ ID No.3所示的单链DNA分子扩增AX95084118SNP位点基因型为G:G的片段。

上述SEQ ID No.1所示的单链DNA分子、SEQ ID No.2所示的单链DNA分子与SEQ IDNo.3所示的单链DNA分子扩增AX95084118SNP位点基因型为A:G的片段。

扩增产物序列如SEQ ID No.5所示。

2、检测不同品种小麦SNP位点的基因型

分别提取各个品种小麦的基因组DNA，以基因组DNA为模板，用上述引物组(SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3)进行PCR扩增。

PCR扩增体系如下：PCR反应使用的扩增体系5.2μl，即为20ng/μl模板DNA 3.0μl，2×KASP reaction mix 2.0μl，引物混合试剂(Assay mix)0.1μl，ddH₂O 0.1μl。

其中，2×KASP reaction mix为LGC公司产品(货号为LGC-KBS-1016-002)。2×KASP reaction mix由荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真的Taq酶，dNTP等组成。荧光探针A的序列为5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′，5′末端连接1个荧光基团FAM；荧光探针B的序列为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，5′末端连接1个荧光基团HEX；淬灭探针A的序列为5′-AGCATGAACTTGG TCACCTTC-3′，3′末端连接淬灭基团BHQ；淬灭探针B的序列为5′-AATCCGTTGACT CCGACCTTC-3′，3′末端连接淬灭基团BHQ。

PCR扩增反应在PTC-200PCR扩增仪上进行，采用Touch down PCR扩增程序为：94℃预变性15min；(Touch down程序)94℃变性30s，61℃退火60s，72℃延伸30s，11个循环，每个循环退火温度下降0.6℃；(扩增程序)94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸30s，26个循环；72℃延伸5min；10℃保存。

将得到的PCR扩增产物在PHERAstar^plus荧光酶标仪上用荧光照射进行基因分型，然后在KlusterCaller^TM软件读取分型后的数据，仅显示红色图像则说明待测小麦5A染色体624cM位置的基因片段(即SEQ ID No.4)的第36bp处SNP位点为G的纯合体，基因型为G:G；仅显示蓝色图像则说明SNP位点碱基为A的纯合体，基因型为A:A；显示绿色图像则说明SNP位点碱基为A/G的杂合体，基因型为A:G。

三、小麦花后21天NDVI和AX95084118SNP位点基因型之间相关性研究

对各小麦品种PCR扩增产物进行两两比较，若A小麦PCR扩增产物显示蓝色(其5A染色体624cM位置的基因片段，即SEQ ID No.4的第36位脱氧核糖核苷酸为A的纯合体，基因型为A：A)，B小麦PCR扩增产物显示红色或绿色(其5A染色体624cM位置的基因片段，即SEQ IDNo.4第36位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体，基因型为G：G或其5A染色体624cM位置的基因片段，即SEQ ID No.4第36位脱氧核糖核苷酸为A/G的杂合体，基因型为A：G)，则A小麦NDVI指数高于B小麦。

上述各个小麦的基因型(图3)及花后21天NDVI指数见表2所示。

表2 15个小麦品种的SNP位点的基因型和总根长结果

注：中麦895为AA；扬麦16为GG。

以上结果表明：绵阳26、济宁16、济麦21、洛麦21、鲁麦15、皖麦52、京冬8号、秦农731、轮选987在SNP位点基因型为A:A，并且这些小麦在花后21天均具有较高的NDVI(0.40≤NDVI≤0.66)。从上述结果中还可看出，SNP位点的基因型为AA的小麦花后21天NDVI要高于基因型为AG或GG的小麦。

上述结果表明，上述SNP位点可以快速、准确地鉴定小麦品种灌浆中后期(花后10-30天)是否具有较高的NDVI。

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 冬小麦中麦895遗传背景下持绿相关基因标记及应用

<130> GNCLN181636

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

gaaggtgacc aagttcatgc tcccgaggtt gagtccaca 39

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat tcccgaggtt gagtccacg 39

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

acaaggtgca atagctcagg 20

<210> 4

<211> 71

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (36)..(36)

<223> r为a或g

<400> 4

catgctgcat actatggccc cgaggttgag tccacrgatc ctccttcctg attgctttga 60

agccgaggag a 71

<210> 5

<211> 90

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> r为a或g

<400> 5

cccgaggttg agtccacrga tcctccttcc tgattgcttt gaagccgagg agaggtctgt 60

gtatgagaca cctgagctat tgcaccttgt 90

Claims (22)

1.用于检测小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G的物质在如下任一中的应用：

（A）鉴定或辅助鉴定小麦NDVI；

（B）选育NDVI高的小麦品种；所述NDVI高是指0.40≤NDVI≤0.66；

（C）鉴定或辅助鉴定小麦持绿性；

（D）选育具有持绿性的小麦品种；

所述小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的核苷酸序列为SEQ IDNo.4。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述用于检测小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G的物质为成套引物或含有所述成套引物的试剂或试剂盒；

所述成套引物中含有两条上游引物和一条下游引物；

所述上游引物根据所述小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸及其上游序列进行设计，且一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为所述小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸A，另一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为所述小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸G；所述下游引物根据所述小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸的下游序列进行设计。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述成套引物为由SEQ ID No.1的第22-39位所示的单链DNA分子或其衍生物、SEQ ID No.2的第22-39位所示的单链DNA分子或其衍生物和SEQ ID No.3所示的单链DNA分子组成的成套引物；

所述SEQ ID No.1的第22-39位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ ID No.1的第22-39位所示的单链DNA分子的5 '端连接特异荧光序列A；

所述SEQ ID No.2的第22-39位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ ID No.2的第22-39位所示的单链DNA分子的5 '端连接特异荧光序列B；

所述特异荧光序列A和所述特异荧光序列B，其一为荧光序列FAM，另一为荧光序列HEX。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述试剂或试剂盒中还含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B；

所述荧光探针A为与所述特异荧光序列A一致的序列，5’末端连接荧光报告基团A；所述淬灭探针A为所述特异荧光序列A的反向互补序列，3’末端连接荧光淬灭基团；

所述荧光探针B为与所述特异荧光序列B一致的序列，5’末端连接荧光报告基团B；所述淬灭探针B为所述特异荧光序列B的反向互补序列，3’末端连接荧光淬灭基团；

所述荧光报告基团A和所述荧光报告基团B，其一为FAM，另一为HEX；所述荧光淬灭基团为BHQ。

5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：所述NDVI为灌浆中后期NDVI。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述灌浆中后期NDVI为花后21天NDVI。

7.一种检测小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G的方法，包括如下步骤（A1）或（A2）：

（A1）直接测序；

（A2）用权利要求4所述的试剂或试剂盒对待测小麦基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR产物，将所述PCR产物用荧光酶标仪进行照射，然后按照如下确定所述待测小麦基因中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G：

若所述PCR产物仅显示SEQ ID No.1所示的单链DNA分子5 '端连接的特异荧光序列对应的荧光报告基团的颜色，则所述待测小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体；

若所述PCR产物仅显示SEQ ID No.2所示的单链DNA分子5 '端连接的特异荧光序列对应的荧光报告基团的颜色，则所述待测小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体；

若所述PCR产物显示SEQ ID No.1所示的单链DNA分子5 '端连接的特异荧光序列对应的荧光报告基团的颜色和SEQ ID No.2所示的单链DNA分子5 '端连接的特异荧光序列对应的荧光报告基团的颜色，则所述待测小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A和G的杂合体；

所述小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的核苷酸序列为SEQ IDNo.4。

8.一种鉴定或辅助鉴定小麦NDVI的方法，包括如下步骤：

（B1）检测小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G；

（B2）按照如下确定小麦NDVI：基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体的待测小麦的NDVI高于基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体或者是A和G的杂合体的待测小麦的NDVI；

所述小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的核苷酸序列为SEQ IDNo.4。

9.一种选育NDVI高的小麦品种的方法，包括如下步骤：

（C1）检测小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G；

（C2）选择基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育，得到NDVI高的小麦品种；

所述NDVI高是指0.40≤NDVI≤0.66；

所述小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的核苷酸序列为SEQ IDNo.4。

10.一种鉴定或辅助鉴定小麦持绿性的方法，包括如下步骤：

（D1）检测小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G；

（D2）按照如下确定小麦持绿性：基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体的待测小麦的持绿性好于基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体或者是A和G的杂合体的待测小麦的持绿性；

所述小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的核苷酸序列为SEQ IDNo.4。

11.一种选育具有持绿性的小麦品种的方法，包括如下步骤：

（E1）检测小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G；

（E2）选择基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育，得到具有持绿性的小麦品种；

所述小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的核苷酸序列为SEQ IDNo.4。

12.根据权利要求8-11中任一所述的方法，其特征在于：所述检测小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A还是G还是A和G的方法为权利要求7所述方法。

13.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述NDVI为灌浆中后期NDVI。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述灌浆中后期NDVI为花后21天NDVI。

15.具有如下（A）-（D）中至少一种功能的物质：

（A）鉴定或辅助鉴定小麦NDVI相关基因；

（B）选育NDVI高的小麦品种；所述NDVI高是指0.40≤NDVI≤0.66；

（C）鉴定或辅助鉴定小麦持绿性；

（D）选育具有持绿性的小麦品种；

所述物质为成套引物或含有所述成套引物的试剂或试剂盒；

所述成套引物中含有两条上游引物和一条下游引物；

所述上游引物根据所述小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸及其上游序列进行设计，且一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为所述小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸A，另一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为所述小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸G；所述下游引物根据所述小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸的下游序列进行设计；

所述小麦基因组中染色体5A上的624cM位置处的基因片段的核苷酸序列为SEQ IDNo.4。

16.根据权利要求15所述的物质，其特征在于：所述成套引物为由SEQ ID No.1的第22-39位所示的单链DNA分子或其衍生物、SEQ ID No.2的第22-39位所示的单链DNA分子或其衍生物和SEQ ID No.3所示的单链DNA分子组成的成套引物；

所述SEQ ID No.1的第22-39位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ ID No.1的第22-39位所示的单链DNA分子的5 '端连接特异荧光序列A；

所述SEQ ID No.2的第22-39位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ ID No.2的第22-39位所示的单链DNA分子的5 '端连接特异荧光序列B；

所述特异荧光序列A和所述特异荧光序列B，其一为荧光序列FAM，另一为荧光序列HEX。

17.根据权利要求16所述的物质，其特征在于：所述试剂或试剂盒中还含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B；

所述荧光探针A为与所述特异荧光序列A一致的序列，5’末端连接荧光报告基团A；所述淬灭探针A为所述特异荧光序列A的反向互补序列，3’末端连接荧光淬灭基团；

所述荧光探针B为与所述特异荧光序列B一致的序列，5’末端连接荧光报告基团B；所述淬灭探针B为所述特异荧光序列B的反向互补序列，3’末端连接荧光淬灭基团；

所述荧光报告基团A和所述荧光报告基团B，其一为FAM，另一为HEX；所述荧光淬灭基团为 BHQ。

18.根据权利要求15-17中任一所述的物质，其特征在于：所述NDVI为灌浆中后期NDVI。

19.根据权利要求18所述的物质，其特征在于：所述灌浆中后期NDVI为花后21天NDVI。

20.权利要求7-12中任一所述的方法或权利要求15-17中任一所述的物质在培育具有如下性状中至少一种的小麦品种中的应用：

（a）NDVI高；所述NDVI高是指0.40≤NDVI≤0.66；

（b）具有持绿性；

（c）具有抗旱性。

21.根据权利要求20所述的应用，其特征在于： 所述NDVI为灌浆中后期NDVI。

22.根据权利要求21所述的应用，其特征在于：所述灌浆中后期NDVI为花后21天NDVI。

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