CN112501337A - 与芝麻抗旱性状相关的kasp分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及与芝麻抗旱性状相关的KASP分子标记及其应用。该KASP分子标记命名为C12565472A，其位于芝麻第4条染色体上的第12565472位，所述KASP分子标记具有多态性的核苷酸为C/A。本发明开发出与KASP分子标记C12565472A，在92个株系组成的自然群体中与在干旱条件下株高性状显著相关，说明本发明中开发的KASP分子标记可对干旱条件下芝麻抗旱性实现辅助选择作用，为选育抗旱芝麻品种奠定理论基础且提供分子辅助选择手段。
Description
技术领域
本发明涉及芝麻分子标记技术领域，尤其涉及与芝麻抗旱性状相关的KASP分子标记及应用。
背景技术
近年来我国芝麻生产旱害发生不断加重，造成减产严重。芝麻产业技术体系对我国主产区7省138个县次的调查结果发现，2008-2019年旱害发生县频率逐年上升，近五年高达60-75％，造成减产13-26％。此外，芝麻干旱危害，在印度、埃塞俄比亚、尼日利亚、泰国、土耳其等非洲和南亚芝麻生产地区的大多数国家普遍存在。因此，提高芝麻抗旱能力，促进高产稳产，对促进我国芝麻生产发展、解决总量自给不足的问题十分必要。
芝麻抗旱性的研究比较薄弱，研究报道主要集中在干旱对芝麻植株形态、产量性状、品质性状及生理生化的影响，分子相关研究较少。利用传统育种手段进行抗旱芝麻种质资源的选育存在选择率低、周期长等问题。分子标记辅助育种是解决这一问题的有效手段。
相较其它作物，芝麻抗旱遗传和分子机制的研究报道相对较少，国内尚未有与芝麻抗旱相关的分子标记的报道。因此，发掘芝麻抗旱相关的分子标记，并利用该标记筛选抗旱性强的芝麻种质资源材料，为选育抗旱芝麻品种奠定了理论基础，并提供了分子辅助选择手段。
发明内容
有鉴于此，有必要提供一种与芝麻抗旱性状相关的KASP分子标记，为其抗旱型育种提供分子选育的技术手段。
本发明第一方面，提供一种与芝麻抗旱性状相关的KASP分子标记，所述KASP分子标记命名为C12565472A，其位于芝麻第4条染色体上的第12565472位，所述KASP分子标记具有多态性的核苷酸为C/A。
具体的，所述KASP分子标记中，具有多态性位点的基因型为AA，对应极端抗旱型芝麻；基因型为CC，对应中等抗旱型或干旱敏感型芝麻。
本发明第二方面，提供一种用于扩增所述KASP分子标记的引物组。
进一步的，所述引用组包括如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物，如SEQ ID NO.2-3所示的单链DNA分子或其衍生物，以及如SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子。
进一步的，如SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子的5’端连接一种荧光标签得到的；如SEQ ID NO.3所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ ID NO.3所示的单链DNA分子的5’端连接一种荧光标签得到的。
本发明第三方面，提供一种含有所述引物组的试剂或试剂盒。
本发明第四方面，提供所述KASP分子标记、所述引物组及所述试剂或试剂盒的以下任一应用：
(1)在鉴定芝麻抗旱表型中的应用；
(2)在抗旱型芝麻种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用；
(3)在筛选抗旱芝麻种质中的应用；
(4)在预测芝麻抗旱能力中的应用。
本发明第五方面，提供一种抗旱芝麻的育种方法，包括：检测待测芝麻基因组中所述KASP分子标记基因型，选择待测芝麻基因组中所述KASP分子标记基因型为CC的芝麻进行育种。
育种方法中，检测待测所述KASP分子标记C12565472A对应的芝麻基因型的方法具体为：用所述引物组、所述试剂或所述试剂盒对所述待测芝麻基因组DNA进行PCR扩增获得产物，对产物进行基因分型。
育种方法中，所述基因分型的方法包括检测产物的荧光信号，根据荧光信号确定基因型：
若所述产物显示如SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子的5’端连接的荧光标签的颜色，则所述待测芝麻KASP分子标记C12565472A的基因型为AA；
若所述产物仅显示如SEQ ID NO.3所示的单链DNA分子的5’端连接的荧光标签的颜色，则所述待测芝麻KASP分子标记C12565472A的基因型为CC。
有益效果：
本发明开发出与KASP分子标记C12565472A，在92个株系组成的自然群体中与在干旱条件下株高性状显著相关，说明本发明中开发的KASP分子标记可对干旱条件下芝麻抗旱性实现辅助选择作用，为选育抗旱芝麻品种奠定理论基础且提供分子辅助选择手段。
附图说明
图1为本发明实施例提供的KASP分子标记C12565472A对30个随机选择芝麻样本的基因分型结果。
图2为本发明实施例提供的KASP分子标记C12565472A对自然群体92个株系的基因分型结果。
图3为本发明实施例提供的2015年度干旱条件下自然群体92个株系相对株高聚类分析图。
图4为本发明实施例提供的2016年度干旱条件下自然群体92个株系相对株高聚类分析图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1干旱条件下芝麻株高相关KASP分子标记的发现与KASP分子标记开发及检
测方法的建立
一、干旱条件下芝麻株高相关KASP分子标记的发现
从国家芝麻中期库保存的7910份国内外资源中根据抗旱相关性状的表型、地理来源和遗传多样性检测结果，采取逐级取样策略，选取了400份抗旱性不同的芝麻材料进行重测序分析；
利用Illumina Hiseq2500测序平台，用2×76双末端测序法对400份芝麻材料进行低覆盖度的全基因组重测序，获得了2.6倍覆盖的基因组序列；
结合种质资源抗旱群体中的抗旱相关性状数据、基因型数据和群体结构，采用EMMAX软件包和Peal程序对芝麻相关性状进行全基因组关联分析，在P＝10-5.99水平检测到1个位于第4染色体上12565472的位置与干旱胁迫下的芝麻株高显著关联的标记位点C12565472A，解释14.48％的表型变异，该标记的优良等位类型为CC型，故将这个标记开发为KASP分子标记，利于进行分子标记辅助选择。
二、KASP分子标记开发及验证
(一)KASP分子标记的开发
将该KASP分子标记C12565472A的DNA序列与芝麻基因组参考序列进行比对后，延伸两端后得到801bp的序列。该序列对应如SEQ ID NO.1所示DNA序列，方向为5’→3’，KASP分子标记C12565472A位于如SEQ ID NO.1所示序列的第802位，代表C或A。
KASP分子标记C12565472A是芝麻基因组的一个SNP位点，KASP分子标记C12565472A位于芝麻第4条染色体上的第12565472位(对应于SEQ ID NO.1的第802位)，该核苷酸为C或A。
KASP分子标记C12565472A的基因型为CC、AA或CA。所述CC基因型是芝麻基因组中所述KASP分子标记C12565472A为C的纯合型，AA基因型是芝麻基因组中所述KASP分子标记C12565472A为A的纯合型，CA基因型是芝麻基因组中所述KASP分子标记C12565472A为C和A的杂合型。
(二)特异引物设计
针对目标KASP分子标记C12565472A的两个等位基因，设计成套KASP引物，KASP引物包含2个上游引物和1个通用下游引物，所述上游引物为5’末端添加荧光标签FAM的DNA分子、5’末端添加荧光标签HEX的DNA分子、所述通用下游引物为SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子；
5’末端添加荧光标签FAM的DNA分子为SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子(KASP-F1)的5’末端添加荧光标签FAM得到的，即FAM-KASP-F1。
5’末端添加荧光标签FAM的DNA分子为SEQ ID NO.3所示的单链DNA分子(KASP-F2)的5’末端添加荧光标签FAM得到的，即FAM-KASP-F2。
KASP分子标记C12565472A的引物序列为：
KASP-F1：5’-ATTTTATATCTAAGGTACTAACCATAACCTAT-3’(如SEQ ID NO.2所示)；
KASP-F2:5’-TATATCTAAGGTACTAACCATAACCTAG-3’(如SEQ ID NO.3所示)；
KASP-R：5’-CCTTTTTCAAATGAACTGGTTACATACATT-3’(如SEQ ID NO.4所示)；
FAM-KASP-F1：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATTTTATATCTAAGGTACTAA CCATAACCTAT-3’(带下划线的序列为荧光标签FAM，如SEQ ID NO.5所示)；
HEX-KASP-F2：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTATATCTAAGGTACTAACCAT AACCTAG-3’(带下划线的序列为荧光标签HEX，如SEQ ID NO.6所示)。
上述序列SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子的5’末端添加荧光标签FAM得到的单链DNA分子(FAM-KASP-F1)与序列SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子(KASP-R)扩增SNP位点基因型为AA(即KASP分子标记C12565472A为A的纯合型)的片段，携带FAM的序列PCR扩增后的产物经荧光照射显示蓝色。
上述序列SEQ ID NO.3所示的单链DNA分子的5’末端添加荧光标签HEX得到的单链DNA分子(FAM-KASP-F2)与序列SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子(KASP-R)扩增SNP位点基因型为CC(即KASP分子标记C12565472A为C的纯合型)的片段，携带HEX的序列PCR扩增后的产物经荧光照射显示红色。
(三)基因分型
利用酶标仪荧光检测系统进行基因分型。
具体步骤如下：
(1)利用CTAB法结合DNA纯化试剂盒提取30个芝麻样本的DNA，这30个阳性样本同时设计常规引物：
D1P1F：5’-AGGGAAGCATTATCCGACAC-3’，如SEQ ID NO.7所示；
D1P1R：5’-TTTATGGACACGGGCACAGC-3’，如SEQ ID NO.8所示；
通过PCR及测序方法鉴定C12565472A位点的基因型，PCR反应体系如表1所示；
(2)通过Replikator仪器将DNA样本从96孔板中转移到384孔板，最终再转移至1536孔板中；
(3)将装有DNA的1536孔板置于烘箱中烘干；
(4)干燥后的1536孔板通过Meridian仪器进行PCR体系构建，每个反应仅需1μL反应体系；
表1 PCR反应体系
其中，引物Mix由FAM-KASP-F1、HEX-KASP-F2和KASP-R组成，FAM-KASP-F1的终浓度为0.6μM、HEX-KASP-F2的终浓度为0.6μM、KASP-R的终浓度为1.5μM。
(5)将加好反应体系的孔板进行封膜，并快速进行低速离心；
(6)离心后进行水浴PCR反应；
(7)将完成反应的孔板，擦干水降温后，在酶标仪Pherastar上进行读板生成tif文件，通过软件转换成数据信号值，再通过分型软件SNPviewer进行分型，显示蓝色荧光的基因型为AA，显示红色荧光的基因型为CC。
如图1所示，图中左上方为KASP分子标记C12565472A基因型为CC的品种，右下方为KASP分子标记C12565472A基因型为AA的品种；结果表明该标记可以区分KASP分子标记C12565472A不同的基因型。经检测，KASP分子标记分型结果(如表2)与PCR测序获得的基因型结果一致，证明开发的KASP分子标记可以实现KASP分子标记C12565472A的基因分型。
表2 KASP分子标记在30个芝麻样本的基因分型结果与测序分型比较(X为图1中横坐标，Y为图1中纵坐标)
实施例2KASP分子标记C12565472A在自然群体中的验证
该试验于2015-2016年度，在干旱条件下，鉴定自然群体92个株系的株高性状。
试验在中国农业科学院油料作物研究所阳逻基地干旱棚进行，实验采用完全随机区组设计，6次重复。用开口直径30cm的塑料花，1盆一个重复，拌土、装盆(1袋进口泥炭土拌土装50盆，每盆先装底土，再添10粒左右复合肥，再装土至离花盆口5cm左右)，浇水播种，每盆播1个材料，每材料播种6盆；出苗后每盆定苗3株。每3-5d浇透水1次，保证幼苗正常生长，期间进行防虫防病管理，根据植株生长状况考虑是否进行叶面喷施N肥。当80％植株进入初花期时，随机3盆停止浇水，进行干旱胁迫处理，另3盆正常供水作为对照。待处理植株50％达到永久萎蔫状态时(第二天早晨萎蔫状态不恢复)，进行复水；如此反复干旱复水3次后进行正常供水直至成熟。终花期测定每个植株的高度。
利用CTAB法提取92个株系的DNA，利用上述实施例提供的KASP分子标记按照实施例1中基因分型方法对92个DNA样品进行分型。
KASP分子标记分型结果如表3所示：KASP分子标记C12565472A中，8个株系(8.70％)的基因型为AA；81个株系(88.04％)基因型为CC；3个株系(3.26％)为缺失。
根据干旱条件下群体的株高表型数据聚类分析(如图3和图4所示)，92个株系抗旱性可以分为3类，分别为极端抗旱型I、中等抗旱型II和干旱敏感型III。再结合SNP分型结果，KASP分子标记C12565472A的基因型为AA的芝麻株系都属于极端抗旱型，且2年表现型一致。综合以上结果，本发明提供的KASP分子标记在92个株系组成的自然群体中与干旱条件下芝麻株高性状显著相关，实验结果与预期一致，说明本发明提供的KASP分子标记可以对芝麻干旱条件下株高性状实现辅助选择作用。
表3 KASP分子标记C12565472A的基因型与干旱条件下芝麻相对株高情况(X为图1中横坐标，Y为图1中纵坐标)
注：“--”表示缺失。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院油料作物研究所
<120> 与芝麻抗旱性状相关的KASP分子标记及应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1603
<212> DNA
<213> 1(Sesamum indicum)
<400> 1
ttaaaattag gcatacttag cggactaaaa taatactttt ccctttatta tactatttac 60
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gaaatcactt ctctttcaga ctcatttgta tacgtttctt aaattcctcc ctaattcttt 540
ctctcatatt tgtctttctt tctctctctc tagattctgt gggacttgga actctttggc 600
tttgatatat tccatctttg aatgaaaata caattattac cttaatttta gttggacttg 660
gaaatatgtc gagtgtctac tgattaaaag aagaagcttt tgtacgagca acaagaaaaa 720
caccgcagca aaagaagaat ttaaatttat tattcatttt acctttttca aatgaactgg 780
ttacatacat tttttagagt cctaggttat ggttagtacc ttagatataa aatatgtcta 840
ttttatattt tatcttaata ttttttatgt tttaatttta agttaaattt ttatatagtt 900
atctcagtgc cgtgacgtat tttaattgtt taaaattttt cgtgccgctg tgcccgtgtc 960
cataaatttt atgtacgtac taataagcgt ccaagacaaa tgccacacgc ggttcccatg 1020
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Claims (10)
1.与芝麻抗旱性状相关的KASP分子标记，其特征在于，所述KASP分子标记命名为C12565472A，其位于芝麻第4条染色体上的第12565472位，所述KASP分子标记具有多态性的核苷酸为C/A。
2.根据权利要求1所述的KASP分子标记，其特征在于，所述KASP分子标记中，具有多态性位点的基因型为AA，对应极端抗旱型芝麻。
3.用于扩增权利要求1或2所述KASP分子标记的引物组。
4.根据权利要求3所述的引用组，其特征在于，包括如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示的引物，如SEQ ID NO.2-3所示的单链DNA分子或其衍生物，以及如SEQ IDNO.4所示的单链DNA分子。
5.根据权利要求4所述的引物组，其特征在于，如SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子的5’端连接一种荧光标签得到的；如SEQ ID NO.3所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ ID NO.3所示的单链DNA分子的5’端连接一种荧光标签得到的。
6.含有权利要求3-5任一项所述引物组的试剂或试剂盒。
7.权利要求1或2所述的KASP分子标记、权利要求3-5任一所述的引物组及权利要求6所述的试剂或试剂盒的以下任一应用：
(1)在鉴定芝麻抗旱表型中的应用；
(2)在抗旱型芝麻种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用；
(3)在筛选抗旱芝麻种质中的应用；
(4)在预测芝麻抗旱能力中的应用。
8.一种抗旱芝麻的育种方法，包括：检测待测芝麻基因组中如权利要求1所述的KASP分子标记基因型，选择待测芝麻基因组中所述KASP分子标记基因型为CC的芝麻进行育种。
9.根据权利要求8所述的育种方法，其特征在于：检测待测所述KASP分子标记C12565472A对应的芝麻基因型的方法为：用权利要求3-5任一所述引物组、权利要求6所述试剂或试剂盒对所述待测芝麻基因组DNA进行PCR扩增获得产物，对产物进行基因分型。
10.根据权利要求9所述的育种方法，其特征在于：所述基因分型的方法包括检测产物的荧光信号，根据荧光信号确定基因型：
若所述产物显示如SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子的5’端连接的荧光标签的颜色，则所述待测芝麻KASP分子标记C12565472A的基因型为AA；
若所述产物仅显示如SEQ ID NO.3所示的单链DNA分子的5’端连接的荧光标签的颜色，则所述待测芝麻KASP分子标记C12565472A的基因型为CC。
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