CN112063740B - 一种与小麦抗白粉病基因Pm37紧密连锁的KASP分子标记及其应用 - Google Patents

一种与小麦抗白粉病基因Pm37紧密连锁的KASP分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与小麦抗白粉病基因Pm37紧密连锁的KASP分子标记及其应用，所述KASP分子标记为YTU37‑K85，其引物包括抗病位点上游引物、感病位点上游引物和共用下游引物；抗病位点上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；感病位点上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；共用下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。本发明提供分子标记YTU37‑K85不仅可以高效、准确、高通量地检测小麦抗白粉病基因Pm37的遗传作图大群体，应用于基因Pm37的精细定位和图位克隆，还可用该标记进行高通量的分子标记辅助选择，实现短时间内育种大群体中基因Pm37抗病基因的高通量筛选，有效提高育种效率，服务于小麦抗白粉病分子育种。

Description

一种与小麦抗白粉病基因Pm37紧密连锁的KASP分子标记及其 应用
技术领域
本发明涉及小麦分子生物技术与育种应用领域，具体地说是一种与小麦抗白粉病基因Pm37紧密连锁的KASP分子标记及其应用。
背景技术
小麦白粉病是一种由布氏白粉菌引起的叶部病害，严重影响小麦安全生产（Ma etal. Characterization of a powdery mildew resistance gene in wheat breedingline 10V-2 and its application in marker-assisted selection. Plant Disease.2018, 102:925–931）。为防控小麦白粉病，多种措施已被采用，比如改善田间条件、喷施化学药剂和种植抗病品种，在这些措施中，种植抗病品种是最为经济、有效的策略，广受育种家和种植者欢迎（Petersen et al. Mapping of powdery mildew resistance gene Pm53introgressed from Aegilops speltoides into soft red winter wheat. Theoreticaland Applied Genetics. 2015, 128:303-312.）。
要培育抗病品种，丰富的抗病基因资源是基础。截至到目前，已发现了80多个正式命名的小麦抗白粉病基因，分布在63个位点，这些基因来源于普通小麦、小麦近源种以及祖先种等不同层次的小麦基因资源库（McIntosh et al. Catalogue of gene symbols forwheat: 2017 supplement. http://www.shigen.nig.ac.jp/wheat/komugi/genes/symbolClassList.jsp. 2017；Li et al. A spontaneous wheat-Aegilops longissimatranslocation carrying Pm66 confers resistance to powdery mildew. Theoreticaland Applied Genetics, 2020, 133:1149–1159）。虽然目前已发掘了很多的抗白粉病基因，然而我国目前推广的抗病品种及一些育种品系的抗病能力并不乐观，很多抗病基因在长期的推广过程中由于宿主-病原菌群的互作逐渐丧失了抗性（李洪杰等，中国小麦品种对白粉病的抗性反应与抗病基因检测. 作物学报. 2011, 37:943-954；Li et al.Characterization of Pm65, a new powdery mildew resistance gene on chromosome2AL of a facultative wheat cultivar. Theoretical and Applied Genetics. 2019,132:2625–2632）。因此，行业内亟需发掘更多的广谱抗白粉病基因应用于小麦抗白粉病的育种中。
小麦的近源种及祖先种中，蕴含着丰富的基因资源，在小麦基因发掘中，充分利用小麦近源种及祖先种发掘广谱抗白粉病基因资源是一条重要的途径（Li et al. Aspontaneous wheat-Aegilops longissima translocation carrying Pm66 confersresistance to powdery mildew. Theoretical and Applied Genetics, 2020, 133:1149–1159）。在发掘到小麦优异基因以后，传统育种往往通过常规杂交方式，通过育种家的经验去选育后代品系、品种，具有一定的盲目性，无法保持稳定的增长。而且在小麦选育过程中，品种间的杂交越来越普遍，导致目前的小麦品种同源性越来越高，突破性抗病基因资源越来越难以发掘。随着小麦基因组学及现代生物技术的发展，分子育种逐渐在小麦育种中利用，因为利用分子育种目标明确地选育优异基因及关联性状，在较少的回交代数中去除不利基因，加速育种进程（Chhetri et al. Development of robust molecularmarkers for marker-assisted selection of leaf rust resistance gene Lr23 incommon and durum wheat breeding programs. Molecular Breeding. 2017, 37: 21）。
在小麦分子育种过程中，遗传标记的开发至关重要。目前已经发表了多张四倍体和六倍体小麦的遗传图谱，普通小麦参考基因组已更新到2.0版本，使得小麦分子标记的开发更为便捷，有效促进了小麦抗病分子育种的进程（The International Wheat GenomeSequencing Consortium. Shifting the limits in wheat research and breedingusing a fully annotated reference genome[J]. Science, 2018, 361(6403):eaar7191；Ling et al. Genome sequence of the progenitor of wheat A subgenomeTriticum urartu[J]. Nature, 2018, 557:424-428；Zhao et al. The Aegilopstauschii genome reveals multiple impacts of transposons[J]. Nature plants,2017, 3: 946-955。传统的分子标记主要依靠凝胶电泳实现，大大影响了目标基因的检测及分子标记辅助选择育种的效率，更是影响分子育种的产业化进程。随着分子标记技术的发展，尤其是以SNP（Single nucleotide polymorphism）为基础的第三代KASP（Kompetitive allele specific PCR）分子标记的出现，大大提升了基因分型的效率。KASP技术是一种基于PCR过程中引物末端碱基特异性匹配来实现SNP/InDel（Insertion-deletion）分型的方法，能够精确地进行双等位基因分型。而且KASP标记可避免实验室凝胶电泳，实现自动化、平台化操作，具有高通量、低成本、遗传稳定性好等特点。鉴于此特点，KASP标记目前已经在小麦基因定位、图位克隆及分子标记辅助选择育种中发挥了重要作用。
小麦抗白粉病基因Pm37是一个源于提莫菲维小麦（Triticum timopheevii，AAGG）的广谱抗白粉病基因，对本实验室鉴定的110个不同的白粉病菌株菌表现免疫，是一个具有广谱抗性的优秀抗白粉病基因。目前小麦抗白粉病基因Pm37经过多代回交和自交已被转育到普通小麦品系NC99BGTAG11背景下，定位在小麦7AL染色体上（Perugini et al. Pm37, anew broadly effective powdery mildew resistance gene from Triticumtimopheevii. Theoretical and Applied Genetics. 2008, 116:417–425）。虽然目前已有分子标记（Perugini et al. Pm37, a new broadly effective powdery mildewresistance gene from Triticum timopheevii. Theoretical and Applied Genetics.2008, 116:417–425）及育种可用标记报道（马朋涛等，一种与小麦抗白粉病基因Pm37连锁的分子标记及其应用，发明专利，已公示，申请号：201911265034.2），但已报道的分子标记都是基于凝胶电泳的普通PCR标记，大大影响了基因Pm37的检测效率，已报道的育种可用标记不但是普通PCR标记，还具有较远的遗传距离，影响了基因Pm37的检测精度。因此，开发小麦抗白粉病基因Pm37紧密连锁而又可以实现高通量检测的KASP标记，对于实现小麦抗白粉病基因Pm37的高通量检测和自动化、平台化分子育种，实现基因Pm37的高效转育利用具有非常重要的价值和意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种与小麦抗白粉病基因Pm37紧密连锁的KASP分子标记及其应用，以解决现有标记对小麦抗白粉病基因Pm37检测效率低、准确性相对较差的问题。
本发明是通过以下方法实现的：一种与小麦抗白粉病基因Pm37紧密连锁的KASP分子标记，所述KASP分子标记为YTU37-K85，其KASP分子标记YTU37-K85的引物包括抗病位点上游引物YTU37-K85-F、感病位点上游引物YTU37-K85-H和共用下游引物YTU37-K85-C；
所述抗病位点上游引物YTU37-K85-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述感病位点上游引物YTU37-K85-H的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述共用下游引物YTU37-K85-C的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明所述的与小麦抗白粉病基因Pm37紧密连锁的KASP分子标记在检测小麦抗白粉病基因Pm37及其精细定位和图位克隆中的应用。
本发明所述的与小麦抗白粉病基因Pm37紧密连锁的KASP分子标记在进行抗白粉病基因Pm37的小麦工程育种和分子标记辅助选择育种中的应用。
本发明所述的应用，检测小麦抗白粉病基因Pm37包括以下步骤：
（1）提取待测样品的小麦基因组DNA，作为模板；
（2）利用所述KASP分子标记YTU37-K85的引物对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；
所述KASP分子标记YTU37-K85的引物包括抗病位点上游引物YTU37-K85-F、感病位点上游引物YTU37-K85-H和公用下游引物YTU37-K85-C；所述抗病位点上游引物YTU37-K85-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述感病位点上游引物YTU37-K85-H的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述共用下游引物YTU37-K85-C的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
（3）采用荧光定量PCR检测仪分析PCR扩增产物基因型；37℃测量荧光信号，Bio-Rad CFX Manager 3.1读取分型结果；分型结果中若等位型为Allele1/Allele1则为携带基因Pm37的纯合抗病的基因型，若等位型为Allele1/Allele2则为携带基因Pm37的杂合抗病基因型，若等位型为Allele2/Allele2则为不携带基因Pm37的感病基因型。
本发明所述的应用中所述PCR扩增的反应体系为：10-30ng/μL DNA 3.0μL，2×KASP Maseter Mix 5.0μL，引物混合液 0.12μL，ddH2O 1.88μL，总体系为10.0μL；其引物混合液中所述抗病位点上游引物YTU37-K85-F和感病位点上游引物YTU37-K85-H的浓度均为12μM；共用下游引物YTU37-K85-C的浓度为30 μM。
本发明所述的应用中所述PCR扩增的程序为：94℃预变性15分钟；94℃变性20秒，然后64℃梯度退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；94℃变性20秒，然后58℃退火并延伸60秒，38个循环。
基因Pm37是一个宝贵的小麦广谱抗白粉病基因，到目前为止，尚未公开过与该基因紧密连锁的育种可用KASP标记的相关报道。本发明提供的KASP标记YTU37-K85利用混池转录组测序技术（BSR-seq）对NC99BGTAG11（携带Pm37的抗病亲本）×宁麦13（感病亲本）杂交的F2群体组建抗病池和感病池，进行BSR-Seq分析，通过差异SNP分析，找到目标基因区段，利用区段内的差异SNP设计了KASP分子标记YTU37-K85。分子标记YTU37-K85不仅可以高效、准确、高通量地检测小麦抗白粉病基因Pm37的遗传作图大群体，应用于基因Pm37的精细定位和图位克隆，还可用该标记进行高通量的分子标记辅助选择，实现短时间内育种大群体中基因Pm37抗病基因的高通量筛选，有效提高育种效率，服务于小麦抗病分子育种。
具体来讲，本发明较现有技术的优点在于：
1. 检测精确度更高：本发明提供的分子标记YTU37-K85较行业内现有育种可用标记YTURGA与小麦抗白粉病基因Pm37的遗传距离更近，分子标记YTU37-K85与基因Pm37的遗传距离由之前的9.0cM缩小到1.0cM，大大提高了检测小麦抗白粉病基因Pm37的精度。
2. 检测通量大大提高，更为便捷：已报道的基因Pm37的育种可用标记YTURGA是一个普通PCR标记，需要利用实验室的凝胶电泳检测，检测效率低。而本发明提供的分子标记YTU37-K85是一个KASP标记，不但可以摆脱凝胶电泳的限制，而且检测通量可以提高成千乃至数万倍，可以真正实现高通量检测。
3. 可以区分杂合体：已报道的基因Pm37的育种可用标记YTURGA是一个显性标记，无法区分纯合抗病和杂合抗病位点，影响了基因Pm37的定位及分子标记辅助选择育种的精度；而本发明提供的分子标记YTU37-K85是一个共显性标记，可以区分纯合抗病和杂合抗病位点，应用于精细定位、图位克隆和分子标记辅助育种的精度更高。
附图说明
图1为分子标记YTU37-K85检测亲本NC99BGTAG11、宁麦13及其F2:3家系分离群体的分型图。
图2为分子标记YTU37-K85对部分感病主栽品种中是否携带小麦抗白粉病基因Pm37的检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 与小麦抗白粉病基因Pm37连锁的分子标记YTU37-K85的开发
1、材料
抗病亲本和感病亲本分别为NC99BGTAG11和宁麦13，其中NC99BGTAG11是携带基因Pm37的普通小麦种质资源（Perugini et al. 2008），由国外引种，对小麦白粉病表现高抗；宁麦13江苏省农业科学院粮食作物研究所选育的国审小麦品种，对小麦白粉病表现感病。NC99BGTAG11和宁麦13杂交，所得F1自交，获得F2群体和F2:3家系。
2、小麦基因组DNA的提取
利用采用酚/氯仿法提取小麦基因组DNA，具体技术流程如下：
（1）剪取新鲜小麦叶片进行液氮研磨至粉磨状态，取约0.4g粉末置于2mL离心管中待用。
（2）加入DNA提取液（100 mM Tris, 50mM EDTA, 500 mM NaCl, 1.8% SDS, pH =8.0）600 μL，65℃水浴40-60 min，每隔5 min混匀一次。
（3）加入600 μL氯仿-异戊醇 (24:1, v/v)，置于摇床上轻摇10-15 min。
（4）静止5 min待分层后，4℃下以12000 rpm/min离心15 min，取上清于另一2 mL离心管中，加入3倍体积的预冷无水乙醇，置于-20 ºC冰箱中沉淀60 min。
（5）用枪头挑出絮状DNA沉淀，然后用75%预冷乙醇将沉淀洗涤2遍。
（6）用枪头将DNA沉淀挑出，置于1.5 mL离心管中，室内自然风干。
（7）待沉淀干燥后，加入60 μL TE缓冲液 (100 mM Tris-Hcl，10 mM的EDTA，pH =8.0) 将DNA沉淀溶解成DNA储存液，-20ºC冰箱中储存备用。
（8）用超纯水将DNA储存液稀释成20-30 ng/μL作为工作液备用。
3、小麦苗期抗白粉病鉴定及抗病遗传分析
小麦抗白粉病鉴定在温度和湿度可控的玻璃温室中完成。将抗感亲本、F1杂交种、F2群体和F2:3家系种植于128穴的穴盘（2×2cm）中，每个穴播种4粒种子，抗感亲本各播种20粒种子，F1播种20粒杂交种、F2群体播种300粒种子，F2群体单株鉴定后移栽至大田，自交收获得到对应的F2:3家系，每个F2:3家系播种20粒种子，感病对照铭贤169随机分布（插红牌指示）。发苗期间条件控制为光照14h/黑暗10h，温度18-22℃，相对湿度30-40%。待长至一叶期，利用预先在感病材料上已经长满的白粉菌孢子接种白粉病菌株E09，接种后前24h条件控制为：全黑暗，温度18-22℃，相对湿度80-100%，24h之后条件控制为光照14h/黑暗10h，温度18-22℃，相对湿度80-100%。约10-14天后，当感病对照铭贤169第一片叶子布满孢子后开始调查抗感亲本及其F2群体的反应型。小麦白粉病反应型按0-4级标准记载，其中0-2级为抗病等级，3-4级为感病等级。结果显示，在接种白粉病菌株E09后，出苗的17株抗病亲本均表现为0级抗病，出苗的15感病亲本均表现为4级感病，出苗的18粒F1杂交种均表现0级抗病，说明NC99BGTAG11中的白粉病抗性受显性基因控制，这与预期基因Pm37的显隐性特征相符合，出苗的279株F2群体单株抗感分离比为205:74，卡方检验符合单显性基因的分离比例3:1（χ2=0.09, P=0.56），收获的265个F2:3家系，纯合抗病:抗感分离:纯合感病家系的比例为65:123:67（χ2=0.35, P=0.84），这也与预期的NC99BGTAG11只携带单个显性抗白粉病基因Pm37相符合。此外，根据抗谱分析表明，NC99BGTAG11苗期对110个具有不同毒性小麦白粉病菌株均表现0级抗性，说明基因Pm37对不同小麦白粉病菌株具有广谱抗性。因此，基因Pm37对小麦抗白粉病遗传育种具有重要意义，将基因Pm37导入到主栽品种后，高效、准确的检测和追踪抗白粉病基因Pm37对实现其育种价值极为重要。
4、与基因Pm37紧密连锁KASP标记的开发
对BSR-Seq数据差异区段及SNP进行分析，发现全基因组只有在7A染色体上680-690Mb区间存在明显的富集。进一步根据关联区域和等位基因频率差(snp_index)筛选出1个高可信度非同义突变的SNP位点。利用URGI网站获取该SNP在中国春参考基因组（IWGSCReference Sequence v1 .0）上两侧各100bp的序列，利用primer5.0软件设计引物，设计KASP标记，筛选出在抗感亲本、抗感池以及后代群体中明显分型，将该SNP位点的KASP标记命名为YTU37-K85，通过连锁分析发现，该标记与基因Pm37的遗传距离为1.0cM。
其分子标记YTU37-K85的引物包括一条抗病位点上游引物、一条感病位点上游引物和一条共用下游引物：
抗病位点上游引物为YTU37-K85-F，其核苷酸序列如下所示：
YTU37-K85-F：5' - 3'：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCCCATGTCTGAGAAGGCG；
感病位点上游引物YTU37-K85-H，其核苷酸序列如下所示；
YTU37-K85-H：5' - 3'：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCCCATGTCTGAGAAGGCA；
共用下游引物YTU37-K85-H，其核苷酸序列如下所示
YTU37-K85-C：5' - 3'：GCCTCCGCTGCTTTCCTT
所述PCR扩增的反应体系为：10-30ng/μL DNA 3.0μL，2×KASP Maseter Mix 5.0μL，引物混合液 0.12μL，ddH2O 1.88μL，总体系为10.0μL；其引物混合液中所述黑麦等位型上游引物YTU37-K85-F和小麦等位型上游引物YTU37-K85-H的浓度均为12μM；共用下游引物YTU37-K85-C的浓度为30 μM。
所述PCR扩增的程序为：94℃预变性15分钟；94℃变性20秒，然后64℃梯度退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；94℃变性20秒，然后58℃退火并延伸60秒，38个循环。
利用获得的引物，按照如上所述的PCR扩增反应体系及扩增程序对200个NC99BGTAG11×宁麦13的F2:3家系进行基因分型，分型结果如图1所示。图中，横轴远端样品群的6个样品为1个感病亲本宁麦13和5个纯感F2:3家系，等位型为“Allele1/Allele1”，荧光读取呈现1个黑色正方形点（宁麦13）和5个红色正方形点（5个纯感F2:3家系）；纵轴远端样品群的6个样品为1个抗病亲本NC99BGTAG11和5个纯抗的F2:3家系，等位型为“Allele2/Allele2”，荧光读取呈现1个绿色三角形点（NC99BGTAG11）和5个黄色三角形点（5个纯抗的F2:3家系）；中间样品群的5个绿色菱形点杂合抗病F2:3家系，等位型为“Allele1/Allele2”；近原点处2个灰色圆形点代表无模板对照。以上结果说明KASP分子标记YTU37-K85在抗病亲本、感病亲本及其杂交的F2:3群体中实现正确分型，可做为抗白粉病基因Pm37的分子标记。
实施例2 分子标记YTU37-K85在检测小麦抗白粉病基因Pm37中的应用
利用小麦抗白粉病基因Pm37的分子标记YTU37-K85检测现有品种中是否含有抗白粉病基因Pm37。
待测样品包括抗病亲本NC99BGTAG11以及30个前期经本实验室鉴定为感白粉病菌株E09的小麦品种。待测样品的30个材料分别为：烟农187、山农1538、山农202、周麦27、中育1311、烟1212、济麦229、泰农18、中育9398、涡麦8、邯麦13、岱麦2173、武农6、郑麦085、良星619、泰麦1918、石麦15、青麦6、济南17、烟农21、济麦21、石新633、济麦20、泰农1014、鲁辰185、淮麦226、冀麦268、西农979、辉县红、宁麦13。
按照实施例1所述的方法提取上述材料新鲜叶片的DNA为模板，利用本发明开发的分子标记YTU37-K85的引物进行扩增：
YTU37-K85的引物包括一条抗病位点上游引物、一条感病位点上游引物和一条共用下游引物：
抗病位点上游引物为YTU37-K85-F，其核苷酸序列如下所示：
YTU37-K85-F：5' - 3'：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCCCATGTCTGAGAAGGCG；
感病位点上游引物为YTU37-K85-H，其核苷酸序列如下所示；
YTU37-K85-H：5' - 3'：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCCCATGTCTGAGAAGGCA；
共用下游引物为YTU37-K85-H，其核苷酸序列如下所示
YTU37-K85-C：5' - 3'：GCCTCCGCTGCTTTCCTT
所述PCR扩增的反应体系为：10-30ng/μL DNA 3.0μL，2×KASP Maseter Mix 5.0μL，引物混合液 0.12μL，ddH2O 1.88μL，总体系为10.0μL；其引物混合液中所述黑麦等位型上游引物YTU37-K85-F和小麦等位型上游引物YTU37-K85-H的浓度均为12μM；共用下游引物YTU37-K85-C的浓度为30 μM。
所述PCR扩增的程序为：94℃预变性15分钟；94℃变性20秒，然后64℃梯度退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；94℃变性20秒，然后58℃退火并延伸60秒，38个循环。
按照如上所述的PCR扩增反应体系及优化扩增程序进行KASP分型，分型结果如图2所示。图中横轴远端样品群的30个样品为生产上的30个感病主栽品种（烟农187、山农1538、山农202、周麦27、中育1311、烟1212、济麦229、泰农18、中育9398、涡麦8、邯麦13、岱麦2173、武农6、郑麦085、良星619、泰麦1918、石麦15、青麦6、济南17、烟农21、济麦21、石新633、济麦20、泰农1014、鲁辰185、淮麦226、冀麦268、西农979、辉县红、宁麦13），等位型为“Allele1/Allele1”，荧光读取呈现绿色正方形点；纵轴远端样品群的6个样品为抗病亲本NC99BGTAG11的6个重复，等位型为“Allele2/Allele2”，荧光读取呈现蓝色三角形点；近原点处4个橙色圆形点代表无模板对照。以上结果说明本发明提供的KASP分子标记YTU37-K85可以在抗病亲本、感病主栽品种中实现正确分型，基因Pm37通过杂交转育到这些品种中后，可以利用YTU37-K85进行高通量检测。
将Pm37位点的其他等位基因导入到小麦主栽品种中，利用本发明开发的与基因Pm37紧密连锁的KASP标记YTU37-K85，可高效、准确、高通量地检测育种大群体，大大提高转移抗病基因Pm37位点的效率和精度，加快携带基因Pm37位点抗白粉病小麦新品种的培育，不仅能够缩短育种年限，而且能消除连锁累赘，实现目标基因的有效转移和聚合，有效提高小麦育种的效率。
因此，利用本发明开发的与基因Pm37连锁的分子标记YTU37-K85，可以对Pm37实现高通量检测，对基因Pm37的精细定位、图位克隆和分子标记辅助选择育种具有重要实践意义。
以上所述用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以做一些修改或改进，使之对本领域技术人员是易于操作的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 烟台大学
<120> 一种与小麦抗白粉病基因Pm37紧密连锁的KASP分子标记及其应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 抗病位点上游引物YTU37-K85-F
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc ttcccatgtc tgagaaggcg 40
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 感病位点上游引物YTU37-K85-H
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat ttcccatgtc tgagaaggca 40
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 共用下游引物YTU37-K85-H
<400> 3
gcctccgctg ctttcctt 18

Claims (6)

1.一种与小麦抗白粉病基因Pm37紧密连锁的KASP分子标记，其特征在于，所述KASP分子标记为YTU37-K85，其KASP分子标记YTU37-K85的引物包括抗病位点上游引物YTU37-K85-F、感病位点上游引物YTU37-K85-H和共用下游引物YTU37-K85-C；
所述抗病位点上游引物YTU37-K85-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述感病位点上游引物YTU37-K85-H的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述共用下游引物YTU37-K85-C的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.一种权利要求1所述的与小麦抗白粉病基因Pm37紧密连锁的KASP分子标记在检测小麦抗白粉病基因Pm37的应用，所述应用的范围是基因Pm37通过杂交转育到30种感病品种的后代；所述30种感病品种为烟农187、山农1538、山农202、周麦27、中育1311、烟1212、济麦229、泰农18、中育9398、涡麦8、邯麦13、岱麦2173、武农6、郑麦085、良星619、泰麦1918、石麦15、青麦6、济南17、烟农21、济麦21、石新633、济麦20、泰农1014、鲁辰185、淮麦226、冀麦268、西农979、辉县红、宁麦13。
3.一种权利要求1所述的与小麦抗白粉病基因Pm37紧密连锁的KASP分子标记在进行抗白粉病基因Pm37的小麦工程育种和分子标记辅助选择育种中的应用，所述应用的范围是基因Pm37通过杂交转育到30种感病品种的后代；所述30种感病品种为烟农187、山农1538、山农202、周麦27、中育1311、烟1212、济麦229、泰农18、中育9398、涡麦8、邯麦13、岱麦2173、武农6、郑麦085、良星619、泰麦1918、石麦15、青麦6、济南17、烟农21、济麦21、石新633、济麦20、泰农1014、鲁辰185、淮麦226、冀麦268、西农979、辉县红、宁麦13。
4.一种权利要求2所述的应用，其特征在于，检测小麦抗白粉病基因Pm37包括以下步骤：
（1）提取待测样品的小麦基因组DNA，作为模板；
（2）利用所述KASP分子标记YTU37-K85的引物对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；
所述KASP分子标记YTU37-K85的引物包括抗病位点上游引物YTU37-K85-F、感病位点上游引物YTU37-K85-H和公用下游引物YTU37-K85-C；所述抗病位点上游引物YTU37-K85-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述感病位点上游引物YTU37-K85-H的核苷酸序列如SEQID NO:2所示；所述共用下游引物YTU37-K85-C的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
（3）采用荧光定量PCR检测仪分析PCR扩增产物基因型；37℃测量荧光信号，Bio-RadCFXManager 3.1读取分型结果；分型结果为携带基因Pm37的纯合抗病的基因型、携带基因Pm37的杂合抗病基因型和不携带基因Pm37的感病基因型。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：10-30ng/μLDNA 3.0μL，2×KASP Maseter Mix 5.0μL，引物混合液 0.12μL，ddH2O 1.88μL，总体系为10.0μL；其引物混合液中所述抗病位点上游引物YTU37-K85-F和感病位点上游引物YTU37-K85-H的浓度均为12μM；共用下游引物YTU37-K85-C的浓度为30 μM。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性15分钟；94℃变性20秒，然后64℃梯度退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；94℃变性20秒，然后58℃退火并延伸60秒，38个循环。
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