CN105838785A - 与芝麻黑色种皮基因紧密连锁的ssr分子标记及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了与芝麻黑色种皮基因紧密连锁的SSR分子标记及应用。一个与芝麻黑色种皮基因SiPPO紧密连锁的SSR分子标记，命名为ZMM4056，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。SSR分子标记ZMM4056引物，引物序列为：ZMM4056F：5’‑GCAGAAGGGTCAATATCGGA‑3’ZMM4056R：5’‑ATCCAAACCCCAGAAAATCC‑3’。另一个芝麻黑色种皮基因SiPPO紧密连锁的SSR分子标记，命名为ZMM4067，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。SSR分子标记ZMM4067引物，引物序列为：ZMM4067F：5’‑GCTTAAACTTGGTTGTCGGG‑3’ZMM4067R：5’‑AAACCCTATCATTTCTTTGCCA‑3’自然群体验证表明这两个分子标记ZZM4056和ZZM6067可以有效筛选出黑芝麻和白芝麻，应用于黑芝麻分子标记辅助选择育种。

Description

与芝麻黑色种皮基因紧密连锁的SSR分子标记及应用
技术领域
本发明属于分子标记领域，具体涉及与芝麻黑色种皮基因紧密连锁的SSR分子标记及应用。
背景技术
芝麻(Sesamum indicum L.)隶属于胡麻科胡麻属，是一种古老的油料作物，栽培历史在5000年以上。目前，广泛分布在南纬40度至北纬45度之间，集中于亚洲和非洲的热带、亚热带地区。它作为一种营养丰富、功能性强、保健效果好的贵重油料深受人们喜爱。芝麻油不饱和脂肪酸含量高达85％，富含抗氧化、抗癌、降血脂的芝麻素，被誉为“油料皇后”。
芝麻种皮颜色主要是白色和黑色，白芝麻含油量高适合油用，黑芝麻含油量稍低，适合食用。黑芝麻除了含有大量的脂肪外，还含有大量有益于人体健康的黑色素、蛋白质、氨基酸、维生素、微量元素和芝麻酚等，具有较高的营养保健功效和药用价值。因此，阐述芝麻种皮颜色的遗传基础和分子机理有利于黑芝麻品种的选育。
连锁分析主要是基于基因数据、表型数据通过统计学的方法去判断感兴趣的基因位点与已知的标记位点间的相对位置，重组率是连锁分析的重要参数。常规连锁分析群体是运用有限亲本的人工控制授粉群体，因此其经过有限次数的重组，通常基于有限亲本，其等位基因的个数也有限。关联分析是基于自然变异群体，利用连锁不平衡规律来研究遗传变异与目标性状相关的研究方法，与传统QTL定位相比，关联分析不需要构建作图群体、广度大、精度高、能检测到同一位点多个等位基因。但由于群体背景复杂，存在亚群结构，导致易产生假阳性，而且自然群体的连锁衰减较快，因此在群体里想找到足够的变异，需要高密度的分子标记。关联分析结合连锁分析，可以发挥两者的优势，提高定位中的阳性率及精度，提高复杂数量性状的挖掘效率。
发明内容
本发明的一个目的在于提供与芝麻黑色种皮基因SiPPO紧密连锁的SSR分子标记。
本发明的另一个目的在于提供与芝麻黑色种皮基因SiPPO紧密连锁的SSR分子标记的引物。
本发明的再一个发明目的在于提供与芝麻黑色种皮基因SiPPO紧密连锁的SSR分子标记的引物的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一个与芝麻黑色种皮基因SiPPO紧密连锁的SSR分子标记，命名为ZMM4056，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
芝麻黑色种皮基因SiPPO紧密连锁的SSR分子标记ZMM4056引物，引物序列为：
ZMM4056F：5’-GCAGAAGGGTCAATATCGGA-3’
ZMM4056R：5’-ATCCAAACCCCAGAAAATCC-3’
一个与芝麻黑色种皮基因SiPPO紧密连锁的SSR分子标记，命名为ZMM4067，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
芝麻黑色种皮基因SiPPO紧密连锁的SSR分子标记ZMM4067引物，引物序列为：
ZMM4067F：5’-GCTTAAACTTGGTTGTCGGG-3’
ZMM4067R：5’-AAACCCTATCATTTCTTTGCCA-3’
与芝麻黑色种皮基因SiPPO紧密连锁的SSR分子标记鉴定方法，其特征在于：用ZMM4056扩增芝麻叶片总DNA，其中黑色种皮芝麻品种DNA的扩增片段大小为266bp，白色种皮芝麻品种DNA扩增片段大小为258bp。
与芝麻黑色种皮基因SiPPO紧密连锁的SSR分子标记鉴定方法，其特征在于：用ZMM4067扩增芝麻叶片总DNA，其中黑色种皮芝麻品种DNA的扩增片段大小为144bp，白色种皮芝麻品种DNA扩增片段大小为136bp。
一种与芝麻黑色种皮基因SiPPO紧密连锁的SSR分子标记的筛选获得方法，包括如下步骤：
(1)从国家芝麻中期库保存的7910份国内外资源中根据产量相关性状的表型、地理来源和遗传多样性检测结果，采取逐级取样策略，选取了705份芝麻材料进行重测序分析；
(2)利用Illumina Hiseq2500测序平台，用2×76双末端测序法对705份芝麻材料进行低覆盖度的全基因组重测序，获得了2.6倍覆盖的基因组序列；
(3)结合种质资源群体中的种皮颜色数据、基因型数据和群体结构，采用EMMAX软件包和Peal程序对芝麻相关性状进行全基因组关联分析，在P＝10-129水平检测到1个位于4号连锁群上11607514的位置与芝麻种皮颜色显著关联的标记位点，解释67％的表型变异；
(4)利用芝麻黑色种皮品种614为父本，芝麻白色种皮品种610为母本进行杂交，自交数代后获得F6代分离群体，即重组自交系(RIL)群体；
(5)根据芝麻(http://ocri-genomics.org/Sinbase/index.html)基因组序列在该SNP位点附近开发80对SSR引物，在步骤(4)构建的重组自交系(RIL)群体中进行基因型分析；
(6)采用CTAB法提取步骤(4)构建的芝麻RIL群体的叶片总DNA；
(7)利用(4)中的80个SSR标记引物对步骤(4)的RIL群体进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色及带型统计，筛选亲本间有多态性的引物；
(8)将筛选得到的多态性引物对重组自交系(RIL)群体进行基因型分析，获得两个与芝麻黑色种皮基因显著关联的标记位点ZMM4056和ZMM4067，将芝麻黑种皮基因定位在第4条连锁群上37kb的范围内。
利用上述技术措施，申请人最终获得了与芝麻黑色种皮基因关联的SSR标记ZMM4056和ZMM4067。其中，ZMM4056引物序列为：
ZMM4056F：5’-GCAGAAGGGTCAATATCGGA-3’，如SEQ.ID.NO.5所示。
ZMM4056R：5’-ATCCAAACCCCAGAAAATCC-3’，如SEQ.ID.NO.6所示。
ZMM4067引物序列为：
ZMM4067F：5’-GCTTAAACTTGGTTGTCGGG-3’，如SEQ.ID.NO.7所示。
ZMM4067R：5’-AAACCCTATCATTTCTTTGCCA-3’，如SEQ.ID.NO.8所示。
上述SSR分子标记ZMM4056在芝麻育种中的应用，具体应用方法为：用所述SSR分子标记ZMM4056扩增芝麻种质资源叶片总DNA，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，如果获得266bp的扩增片段，则表明该芝麻品种种皮颜色为黑色，如果获得258bp的扩增片段，则表明该芝麻品种种皮颜色为白色。
上述SSR分子标记ZMM4067在芝麻育种中的应用，具体应用方法为：用所述SSR分子标记ZMM4067扩增芝麻种质资源叶片总DNA，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，如果获得144bp的扩增片段，则表明该芝麻品种种皮颜色为黑色，如果获得136bp的扩增片段，则表明该芝麻品种种皮颜色为白色。
本发明的优点在于：
随着基因组测序技术的发展，利用生物信息学的方法大规模挖掘基因组特异分子标记已成为可能。本发明基于全基因组测序，对芝麻的群体结构进行分析，利用全基因组关联分析(GWAS)的方法，结合连锁分析，最终获得了与芝麻黑色种皮基因紧密连锁的SSR分子标记，并利用关联分析结合连锁分析对芝麻种皮颜色基因进行定位，将芝麻黑种皮基因定位在第4条连锁群上ZZM4056和ZZM6067标记间大约37kb的范围内。自然群体验证表明这两个分子标记ZZM4056和ZZM6067可以有效筛选出黑芝麻和白芝麻，可以应用于黑芝麻分子标记辅助选择育种。
附图说明
图1为利用SSR分子标记ZMM4056的引物在芝麻种质资源中的基因组DNA中的扩增结果。
图2为利用SSR分子标记ZMM4067的引物在芝麻种质资源中的基因组DNA中的扩增结果。
具体实施方式
下述实施例中按照《分子克隆实验指南》(第三版)(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002)所述的条件进行DNA提取、PCR及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。实验过程中涉及的所有试剂成分均可从商业途径获得，并按照实验手册中的条件或所用试剂制造厂商所建议的条件使用。
一种与芝麻黑色种皮基因SiPPO紧密连锁的SSR分子标记的获得方法，包括如下步骤：
(1)从国家芝麻中期库保存的7910份国内外资源中根据产量相关性状的表型、地理来源和遗传多样性检测结果，采取逐级取样策略，选取了705份芝麻材料进行重测序分析；
(2)利用Illumina Hiseq2500测序平台，用2×76双末端测序法对705份芝麻材料进行低覆盖度的全基因组重测序，获得了2.6倍覆盖的基因组序列；
(3)结合种质资源群体中的种皮颜色数据、基因型数据和群体结构，采用EMMAX软件包和Peal程序对芝麻相关性状进行全基因组关联分析，在p＝10-129水平检测到1个位于4号连锁群上11607514的位置与芝麻种皮颜色显著关联的标记位点，解释67％的表型变异；
(4)根据芝麻(http://ocri-genomics.org/Sinbase/index.html)基因组序列在该SNP位点附近开发80对SSR引物，在一个重组自交系(RIL)群体中进行基因型分析；
(5)利用芝麻黑色种皮品种614为父本，芝麻白色种皮品种610为母本进行杂交，自交数代后获得F6代分离群体，即重组自交系(RIL)群体；
(6)采用CTAB法提取芝麻RIL群体的叶片总DNA；
(7)利用(4)中的80个SSR标记引物对该RIL群体进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色及带型统计，筛选亲本间有多态性的引物；
(8)将筛选得到的多态性引物对重组自交系(RIL)群体进行基因型分析，获得两个与芝麻黑色种皮基因显著关联的标记位点ZMM4056和ZMM4067，将芝麻黑种皮基因定位在第4条连锁群上37kb的范围内。
实施例1：与芝麻种皮颜色基因紧密连锁标记的获得与鉴定
一、芝麻种皮颜色的全基因组关联分析
1、从国家芝麻中期库保存的7910份国内外资源中，根据产量相关性状的表型、地理来源和遗传多样性检测结果，采用分组、聚类分析、逐级取样和分子标记辅助等一套方法，综合考虑了我国七大生态区和国外五大洲的来源和分布、种质类型、形态和生物学特性，优先录选高抗逆、高抗病和高品质等育种目标突出的优异种质，选取了705份芝麻核心种质进行全基因组重测序。
2、2015年1月将全部材料种植在海南三亚，于芝麻初花期(播种后45天)选择健康单株取第三对和第四对真叶，迅速用液氮冷冻后转移至干冰中保存。将嫩叶带回实验室后用DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)试剂盒提取其余300份材料的总DNA，然后用超声处理将基因组DNA打碎，用T4DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Klenow DNA聚合酶修复末端后，再用Klenow Fragment(3'→5'exo-)在3'末端接上A碱基，将不同的材料分别与不同类型的3碱基接头进行连接。多个样品混合后用2％的琼脂糖凝胶进行电泳，回收300-400bp的片段，PCR扩增9个循环。利用Illumina Hiseq2500测序平台，用2×76双末端测序法对300份芝麻材料进行低覆盖度的全基因组重测序。705份材料的全基因组重测序共计产生原始测序数据264Gb，平均测序深度为芝麻基因组大小的2.6倍。
3、用SMALT软件将双末端测序得到的短序列与已完成的芝麻基因组序列进行比对，选取一致性较高且不重复的序列。利用Ssaha Pileup包从一致性序列读取单倍体序列，去除杂合位点。对705份芝麻的单倍型序列进行比对，提取SNP，结合物理谱图和连锁图谱，标记它们在基因组中的位置，记录变异在芝麻群体中发生的频率。
4、采用EIGENSOFT和PHYLIP分别进行主成分分析和系统发育分析，探索对世界芝麻资源的群体结构。用Haploview软件分析芝麻基因组的连锁不平衡水平，确定该群体的LD衰减水平。结合种质资源群体中的种皮颜色数据、基因型数据和群体结构，采用EMMAX软件包和Peal程序对芝麻种皮颜色性状进行全基因组关联分析(GWAS)。检测到一个与芝麻种皮颜色紧密连锁的SNP位点，该位点位于4号连锁群上，位置在11607514(P＝10-129)。
二、芝麻种皮颜色关联分子标记附近SSR标记的开发
1、构建黑色种皮/白色种皮芝麻重组自交系(RIL)群体
利用芝麻黑色种皮品种614和白色种皮品种610进行杂交，获得F1种子，F1植株自交产生F2代种子，F2植株自交产生F3代种子，F3代开始按株行种植并自交产生种子，每个株行只收获1个单株的种子，种植成为下一代的1个株行，以此类推，最终获得F6代分离群体，即重组自交系(RIL)群体。
利用CTAB法提取叶片基因组总DNA，具体步骤如下：
A.将各亲本及RIL分离群体叶片适量放入超低温冰箱-70℃存放，备用。使用时，自超低温冰箱(-70℃)取适量叶片样品，立即放入冰冻处理的研钵中，加入液氮研磨成粉状；快速装入50ml离心管中，加入在65℃的水浴锅中预热过的CTAB提取液(2％CTAB，0.1MTris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，pH 7.5)，混合均匀，放入65℃的水浴锅中水浴40min；
B.取出离心管，加入等体积的氯仿和异戊醇按体积比为24:1混合的混合液，缓慢上下颠倒离心管30-50次，使充分混匀，13000g离心10min；
C.取离心后的上清于另一离心管中，重复B步骤一次。然后再取上清加入0.6倍体积冰冷异戊醇中，缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀集结为止。然后置于-20℃静置30min，挑出沉淀，用75％(体积比)酒精漂洗2-3次，干燥后加无菌水溶解；
D.再次重复B步骤一次，取上清，向其中加入0.1倍体积的NaAc(3mol/L，PH5.2)，混匀后缓慢加入2倍体积的冰冷无水乙醇，静止5min后缓慢转动离心管直至絮状沉淀出现，挑出沉淀转入1.5ml离心管中，75％(体积比)酒精漂洗2-3次，干燥后加无菌水溶解，于-20℃冰箱中保存备用，即得各亲本及RIL分离群体叶片基因组总DNA。
2、SSR引物的开发及多态性的筛选
根据芝麻(http://ocri-genomics.org/Sinbase/index.html)基因组序列在4号连锁群附近开发SSR引物。SSR引物具体的开发方法是先利用SSRHunter软件在每个scaffiold搜索SSR，然后用Primer5.0软件设计SSR引物。共设计了80对SSR引物。
A.自父母本中各随机选择5株的DNA等量混合，总浓度调整至20ng/ul，用作筛选引物的DNA模板。
B.PCR扩增反应。具体反应体系及扩增程序如下：
PCR反应体系：
PCR扩增程序：
3、PCR扩增产物凝胶电泳测试获得多态性筛选结果
将以上获得的PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，以获得双亲多态性筛选结果，具体步骤如下：
胶板制备：
玻璃板用10％(质量比)NaOH溶液浸泡24小时，洗净，晾干。短胶板用餐巾纸均匀涂抹硅烷化剂(AMMRESCO)，长胶板涂抹1ml反硅烷化剂，放置5min后，将玻璃装好，并以边条隔开，四周用制胶夹夹紧。准备就绪后用注射器将6％(质量比)聚丙烯酰胺胶液60ml缓慢注入玻璃间的缝隙中，直至灌满到玻璃板模具的顶部，注意避免产生气泡。小心插入梳子不带齿的一边，并用夹子夹牢，聚合2小时以上。
反硅烷化剂：500ml稀释液(95％无水乙醇，0.5％冰醋酸，4.5％ddH2O)中加1-2ml亲和硅烷；
6％(质量比)聚丙烯酰胺胶液:5.7％(质量比)丙烯酰胺，0.3％(质量比)N,N’-甲叉二丙烯酰胺，42％(质量比)尿素，1×TBE缓冲液。灌胶前每60ml胶液加入10％(质量比)过硫酸铵390ul和TEMED 39ul；
电泳：
去掉制胶夹，取出胶板，小心的取出梳子，冲洗并擦净玻璃外侧，固定于电泳槽上，上下槽各加500ml 1×TBE缓冲液，以恒功率75W电泳30min直到电压回升，用注水器冲洗凝胶的上表面以冲走析出的尿素和碎胶，插上梳子。在PCR产物中加入0.5倍体积的上样缓冲液，95℃变性5min，冰浴冷却3min以上，每个点样孔点样5ul，1800伏恒压电泳约80min，当二甲苯青FF到达2/3胶板时停止电泳。取下胶板，用自来水冲洗降温。
1×TBE：Tris-base108g，硼酸55g，0.5M EDTA(PH8.0)40ml，定容至1000ml即成10×TBE，使用时稀释10倍即为1×TBE工作液；
上样缓冲液：98％(体积比)去离子甲酰胺,10mmol/LEDTA,0.005％(质量比)二甲苯青FF,0.005％(质量比)溴酚蓝。
银染法染色：
将两块玻璃板分离开来，长玻璃板连同凝胶用蒸馏水漂洗3次，每次3min，放入染色液(含0.15％的AgNO3)中染色10min，用蒸馏水快速漂洗5-6s。放入显影液(含0.2％的NaOH，0.04％的甲醛，35℃)中显影，至带型清晰，然后在蒸馏水中漂洗1次，室温下自然晾干，拍照保存。观察胶板上各引物在双亲中的扩增带型，双亲带型有差异的引物即为多态性引物。
4、筛选得到的多态性引物在RIL群体中的分析
以550个RIL群体为模板，利用目标区间的分子标记进行基因型检测。统计基因型结果，将与父本一致的带型记为A，与母本一致的带型记为B，杂合的记为H。在此基础上，采用JoinMap 4.0进行遗传图谱构建，从而计算出各标记在目标区间内的遗传位置。其中，ZMM4056和ZMM4067这两个标记与芝麻种皮颜色显著相关，将芝麻黑种皮基因定位在第4条连锁群上37kb的范围内。
实施例2：与芝麻种皮颜色基因紧密连锁的分子标记在芝麻种质资源中的应用
利用实施例1获得的与芝麻种皮颜色基因连锁的SSR标记在96份不同遗传背景材料上进行验证，其中48份材料为白色种皮芝麻品种，48份材料为黑色种皮芝麻品种，以确定该标记用于分子标记辅助选择的准确性。采用实施例1中步骤中的PCR扩增和检测方法。
表1 96份芝麻地方品种材料的种皮颜色
检测结果显示见图1。图1中从左到右各样品分别为编号为1,2,3…96的芝麻。分子标记引物ZMM4056F/ZMM4056R扩增的与黑色种皮基因连锁的SSR标记特征条带为266bp，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；分子标记引物ZMM4056F/ZMM4056R引物扩增的与白色种皮基因连锁的SSR标记特征条带为258bp，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。检测结果表明该SSR标记在96份材料中的验证结果准确性为100％。
另一检测结果见图2，图2中从左到右各样品分别为编号为1,2,3…96的芝麻。分子标记引物ZMM4067F/ZMM4067R扩增的与黑色种皮基因连锁的SSR标记特征条带为144bp，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；分子标记引物ZMM4056F/ZMM4056R引物扩增的与白色种皮基因连锁的SSR标记特征条带为136bp，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。检测结果表明该SSR标记在96份材料中的验证结果准确性为100％。

Claims (8)

1.一个与芝麻黑色种皮基因SiPPO紧密连锁的SSR分子标记，命名为ZMM4056，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的与芝麻黑色种皮基因SiPPO紧密连锁的SSR分子标记ZMM4056引物，其特征在于：引物序列为：
ZMM4056F：5’-GCAGAAGGGTCAATATCGGA-3’
ZMM4056R：5’-ATCCAAACCCCAGAAAATCC-3’。
3.一个与芝麻黑色种皮基因SiPPO紧密连锁的SSR分子标记，命名为ZMM4067，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.权利要求3所述的芝麻黑色种皮基因SiPPO紧密连锁的SSR分子标记ZMM4067引物，其特征在于：引物序列为：
ZMM4067F：5’-GCTTAAACTTGGTTGTCGGG-3’
ZMM4067R：5’-AAACCCTATCATTTCTTTGCCA-3’。
5.与芝麻黑色种皮基因SiPPO紧密连锁的SSR分子标记鉴定方法，其特征在于：用权利要求2所述的ZMM4056引物扩增芝麻叶片总DNA，其中黑色种皮芝麻品种DNA的扩增片段大小为266bp，白色种皮芝麻品种DNA扩增片段大小为258bp。
6.与芝麻黑色种皮基因SiPPO紧密连锁的SSR分子标记鉴定方法，其特征在于：用权利要求4所述的ZMM4067引物扩增芝麻叶片总DNA，其中黑色种皮芝麻品种DNA的扩增片段大小为144bp，白色种皮芝麻品种DNA扩增片段大小为136bp。
7.权利要求2所述的ZMM4056引物在芝麻育种中的应用，其特征在于：应用方法为：用权利要求2所述的ZMM4056引物扩增芝麻种质资源叶片总DNA，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，如果获得266bp的扩增片段，则表明该芝麻品种种皮颜色为黑色，如果获得258bp的扩增片段，则表明该芝麻品种种皮颜色为白色。
8.权利要求4所述的ZMM4067引物在芝麻育种中的应用，其特征在于：应用方法为：用权利要求4所述的ZMM4067引物扩增芝麻种质资源叶片总DNA，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，如果获得144bp的扩增片段，则表明该芝麻品种种皮颜色为黑色，如果获得136bp的扩增片段，则表明该芝麻品种种皮颜色为白色。
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