CN106337086B - 与芝麻每叶腋蒴果数调控基因SiACS紧密连锁的SNP分子标记与应用 - Google Patents

与芝麻每叶腋蒴果数调控基因SiACS紧密连锁的SNP分子标记与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子标记领域，具体涉及与芝麻每叶腋蒴果数调控基因SiACS紧密连锁的SNP分子标记与应用。本发明公开了一个与芝麻每叶腋蒴果数调控基因SiACS紧密连锁的SNP分子标记，所述的每叶腋蒴果数调控基因在芝麻SNP遗传图谱中位于第5条连锁群上，与其紧密连锁的分子标记的序列如SEQ ID NO.1所示；另一个与芝麻每叶腋蒴果数调控基因SiACS紧密连锁的SNP分子标记，序列如SEQ ID NO.2所示。自然群体验证表明这两个分子标记可以有效预测芝麻种质每叶腋蒴果数，应用于芝麻选育。

Description

与芝麻每叶腋蒴果数调控基因SiACS紧密连锁的SNP分子标记 与应用
技术领域
本发明属于分子标记领域，具体涉及与芝麻每叶腋蒴果数调控基因SiACS紧密连锁的SNP分子标记与应用。
背景技术
芝麻(Sesamum indicum L.)，属胡麻科胡麻属，是世界上最古老的特色优质油料作物之一，也是我国特色的农产品，因其具有较好的营养和保健价值，在食品加工中具有重要地位。近30年，中芝11号、中芝13号、中芝16号和中芝20号等品种的成功选育，对我国芝麻产量提高起到了重要的推动作用，但是和其他油料作物相比，芝麻产量仍然较低。芝麻产量主要由单株蒴果数、每蒴粒数和千粒重构成，其中单株蒴果数对芝麻产量影响最大，增加芝麻单株蒴果数是提高芝麻产量的关键。
芝麻单株蒴果数由果节数和每叶腋蒴果数决定，其中每叶腋蒴果数主要包括单蒴型和三蒴型，在果节数相当的情况下，三蒴型芝麻的单株蒴果数是单株型芝麻的两倍以上。因此，培育三蒴型芝麻品种是芝麻高产优质育种的重要途径。因此，急需开发与芝麻每叶腋蒴果数紧密连锁的分子标记。随着高通量测序技术的发展，全基因组关联分析(GWAS)已经成为重要农艺性状相关QTL精细定位的有力工具。其利用的是群体水平遗传变异和标记直接的LD连锁不平衡信息，通过大量SNP标记与表型的关联来定位与复杂性状关联的SNP和基因位点。将关联分析得到的SNP和传统分子标记相结合用于分子辅助育种，其分辨率大幅提高，将有效加速分子育种进程。
发明内容
本发明的目的是提供一种与芝麻每叶腋蒴果数调控基因SiACS紧密连锁的SNP分子标记，及芝麻每叶腋蒴果数调控基因SiACS紧密连锁的SNP分子标记引物，同时提供一种利用PCR技术检测分子标记的检测方法，通过检测该分子标记，从而对每叶腋蒴果数目做出预判，进而为芝麻育种提供参考依据。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一个与芝麻每叶腋蒴果数调控基因SiACS紧密连锁的SNP分子标记，所述的每叶腋蒴果数调控基因在芝麻SNP遗传图谱中位于第5条连锁群上，与其紧密连锁的分子标记的序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
TCAGGATCGGCATGATCTATTTCAACAGTAAAACCCTGATTGCTGCTGCAACAAAAATGTCGAGTTTTGGGCTGGTCTCTTCTCAATCCCAGTTCCTACTG
一个与芝麻每叶腋蒴果数调控基因SiACS紧密连锁的SNP分子标记，所述的每叶腋蒴果数调控基因在芝麻SNP遗传图谱中位于第5条连锁群上，与其紧密连锁的分子标记的序列如SEQ ID NO.2所示，其为上述序列的等位位点序列，具体为：
TCAGGATCGGCATGATCTATTCCAACAGTAAAACCCTGATTGCTGCTGCAACAAAAATGTCGAGTTTTGGGCTGGTCTCTTCTCAATCCCAGTTCCTACTG
需要说明的是，上述SNP位点序列中第22个碱基T变为C时，芝麻每叶腋蒴果数目发生变化，由每叶腋蒴果数3个变为1个。
与
芝麻每叶腋蒴果数调控基因SiACS紧密连锁的SNP分子标记引物，引物序列为：
正向引物1F序列：5’-TCAGGATCGGCATGATCTAGTT-3’，如SEQ ID NO.3所示；
反向引物1R序列：5’-CAGTAGGAACTGGGATTG-3’，如SEQ ID NO.4所示；
或为：
正向引物2F序列：5’-TCAGGATCGGCATGATCTAGTC-3’，如SEQ ID NO.5所示；
反向引物2R序列：5’-CAGTAGGAACTGGGATTG-3’，如SEQ ID NO.6所示。
与芝麻每叶腋蒴果数调控基因SiACS紧密连锁的SNP分子标记鉴定方法，其特征在于：用SNP分子标记引物1F与1R配对扩增从芝麻叶片中提取的基因组DNA，如果能扩增出条带大小为101bp的产物，则该待测芝麻种质的每叶腋蒴果数为3个；用SNP分子标记引物2F与2R配对扩增从芝麻叶片中提取的基因组DNA，如果能扩增出条带大小为101bp的产物，则该待测芝麻种质的每叶腋蒴果数为1个。
上述SNP分子标记在芝麻新品种培育中的应用，应用方法为：提取待测芝麻种质资源的基因组DNA；利用SNP分子标记引物扩增芝麻种质资源的基因组DNA，如果用SNP分子标记引物1F与1R配对扩增，能扩增出条带大小为101bp的产物，表明其SNP分子标记第22个碱基为T，则该待测芝麻种质的每叶腋蒴果数为3个，可用于选育芝麻高质高产品种；用SNP分子标记引物2F与2R配对扩增从芝麻叶片中提取的基因组DNA，能扩增出条带大小为101bp的产物，表明其SNP分子标记第22个碱基为C，则该待测芝麻种质的每叶腋蒴果数为1个，为单蒴品种。
具体包括以下步骤：
(1)提取待测芝麻种质资源的基因组DNA；
(2)利用Primerpremier5.0软件设计引物对，引物设计时，为区分被检测基因组DNA中不同SNP等位位点，设计两对引物如下：
正向引物1F序列：5’-TCAGGATCGGCATGATCTAGTT-3’
反向引物1R序列：5’-CAGTAGGAACTGGGATTG-3’
正向引物2F序列：5’-TCAGGATCGGCATGATCTAGTC-3’
反向引物2R序列：5’-CAGTAGGAACTGGGATTG-3’
需要说明的是，在特异正向引物1F和2F序列的3’末端第3位的碱基引入错配以增加扩增产物的特异性；引入错配的原则是：引物3’端-3位错配碱基与3’末端的SNP错配碱基形成稳定性互补的错配结构；即强错配型(C/T或G/A)与弱错配型(C/A或G/T)搭配，中等错配型(A/A、C/C、G/G或T/T)与中等错配型搭配。
以步骤(1)中DNA为模板，进行PCR扩增，对步骤(2)中PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；如果基因组中该SNP分子标记第22个碱基为T，当采用其引物1F与1R配对进行PCR扩增时，能扩增出条带大小为101bp的产物，则该待测芝麻种质的每叶腋蒴果数为3个，可用于选育芝麻高质高产品种；如基因组中该SNP分子标记第22个碱基为C，当采用其引物2F与2R配对进行PCR扩增，能扩增出条带大小为101bp的产物，则该待测芝麻种质的每叶腋蒴果数为1个。
本发明的创新点主要体现在以下几个方面：
(1)随着高密度SNP芯片的出现，全基因组关联分析(GWAS)已经成为QTL精细定位的有力工具。GWAS利用分布在整个基因组的SNP来研究复杂性状遗传变异和表型变异之间的关系，从而找到生物学上有意义的候选基因。该方法可以大大缩小检测到的突变区域，为基因的功能研究提供方向和证据。本发明利用全基因组关联分析的方法，结合连锁分析，提供了与芝麻每叶腋蒴果数调控基因SiACS紧密连锁的SNP分子标记，同时提供了一种鉴定芝麻种质资源中是否含有该分子标记位点的PCR鉴定方法，该方法可以较为便捷和快速的初步预测芝麻品种的每叶腋蒴果数目。
(2)本发明所获得的每叶腋蒴果数目基因关联标记位点明确，检测结果稳定性好，对提高芝麻遗传育种工作效率、提升我国芝麻遗传育种研究技术水平具有重要意义。
本发明所述与芝麻每叶腋蒴果数调控基因SiACS紧密连锁的SNP分子标记及其同源序列可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本领域所了解。例如，可通过DNA的修改、等同替换和改进等来制备该SNP分子标记的序列变体或片段，其中用于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。本发明所述的SNP分子标记及其同源序列包括天然存在的序列和变体两种形式。“变体”意指基本相似的序列，对于本说明中的SNP分子标记及其同源序列，变体包含天然多核苷酸中一个或多个位点处一个或多个核苷酸的缺失、插入或/和替换。诸如此类天然存在的变体可通过现有的分子生物学技术来鉴定。在以上所述的不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
附图说明
图1为本发明的SNP分子标记引物对1F/1R引物对在芝麻种质资源中的基因组DNA中的扩增结果。
图2为本发明的SNP分子标记引物对2F/2R引物对在芝麻种质资源中的基因组DNA中的扩增结果。
图3为本发明的SNP分子标记引物对1F/1R引物对在芝麻种质资源中的基因组DNA中的扩增结果。
图4为本发明的SNP分子标记引物对2F/2R引物对在芝麻种质资源中的基因组DNA中的扩增结果。
具体实施方式
下面结合实例对本发明做进一步的解释说明。本发明中所用主要芝麻种质资源简要介绍如下：本申请中采用的芝麻品种来自于中国农业科学院油料作物研究所芝麻种质资源课题组。实施例中按照《分子克隆实验指南》(第三版)(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002)所述的条件进行DNA提取、PCR及琼脂糖凝胶电泳等。实验过程中涉及的所有试剂成分均可从商业途径获得，并按照实验手册中的条件或所用试剂制造厂商所建议的条件使用。
实施例1：与芝麻每叶腋蒴果数调控基因SiACS紧密连锁的SNP分子标记的获得与鉴定
一、与芝麻每叶腋蒴果数调控基因紧密连锁的SNP分子标记的获得
1、从国家芝麻中期库保存的7910份国内外资源中，根据产量相关性状的表型、地理来源和遗传多样性检测结果，采用分组、聚类分析、逐级取样和分子标记辅助等一套方法，综合考虑了我国七大生态区和国外五大洲的来源和分布、种质类型、形态和生物学特性，优先录选高抗逆、高抗病和高品质等育种目标突出的优异种质，选取了705份芝麻核心种质进行全基因组重测序，包含单蒴型芝麻283份，三蒴型芝麻422份。
2、2015年1月将全部材料种植在海南三亚，于芝麻初花期(播种后45天)选择健康单株取第三对和第四对真叶，迅速用液氮冷冻后转移至干冰中保存。将嫩叶带回实验室后用DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)试剂盒提取其余300份材料的总DNA，然后用超声处理将基因组DNA打碎，用T4DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Klenow DNA聚合酶修复末端后，再用Klenow Fragment(3'→5'exo-)在3'末端接上A碱基，将不同的材料分别与不同类型的3碱基接头进行连接。多个样品混合后用2％的琼脂糖凝胶进行电泳，回收300-400bp的片段，PCR扩增9个循环。利用Illumina Hiseq2500测序平台，用2×76双末端测序法对300份芝麻材料进行低覆盖度的全基因组重测序。705份材料的全基因组重测序共计产生原始测序数据264Gb，平均测序深度为芝麻基因组大小的2.6倍。
3、用SMALT软件将双末端测序得到的短序列与已完成的芝麻基因组序列进行比对，选取一致性较高且不重复的序列。利用Ssaha Pileup包从一致性序列读取单倍体序列，去除杂合位点。对705份芝麻的单倍型序列进行比对，提取SNP，结合物理谱图和连锁图谱，标记它们在基因组中的位置，记录变异在芝麻群体中发生的频率。
4、采用EIGENSOFT和PHYLIP分别进行主成分分析和系统发育分析，探索对世界芝麻资源的群体结构。用Haploview软件分析芝麻基因组的连锁不平衡水平，确定该群体的LD衰减水平。结合种质资源群体中的每叶腋蒴果数目数据、基因型数据和群体结构，采用EMMAX软件包和Peal程序对芝麻每叶腋蒴果数目性状进行全基因组关联分析(GWAS)。
5、通过全基因组关联分析，发掘一个与芝麻每叶腋蒴果数显著相关的SNP位点。该SNP位点位于第5连锁群6738735bp，p值高达10-128，对表型解释达到72.1％，该SNP位点位于SIN_1006338基因的编码区，其拟南芥同源基因为ACS，为乙烯合成基因。当该SNP为C时，编码丝氨酸，芝麻表现为单蒴型，当该SNP为T时，该基因编码苯丙氨酸，芝麻表现为三蒴型。
二、与芝麻每叶腋蒴果数调控基因紧密连锁的SNP引物设计与SNP位点验证
引物设计时，为区分被检测基因组DNA中不同SNP等位位点，设计两对引物如下：
正向引物1F序列：5’-TCAGGATCGGCATGATCTAGTT-3’
反向引物1R序列：5’-CAGTAGGAACTGGGATTG-3’
正向引物2F序列：5’-TCAGGATCGGCATGATCTAGTC-3’
反向引物2R序列：5’-CAGTAGGAACTGGGATTG-3’
需要说明的是，在特异正向引物1F和2F序列的3’末端第3位的碱基引入错配以增加扩增产物的特异性；引入错配的原则是：引物3’端-3位错配碱基与3’末端的SNP错配碱基形成稳定性互补的错配结构；即强错配型(C/T或G/A)与弱错配型(C/A或G/T)搭配，中等错配型(A/A、C/C、G/G或T/T)与中等错配型搭配。
在芝麻种质资源群体中随机选取8份每叶腋蒴果数为3个的芝麻品种和8份每叶腋蒴果数目为1个的芝麻品种，提取芝麻种质资源的基因组DNA，以所提DNA为模板，进行PCR扩增；如果SNP分子标记第22个碱基为T，当采用引物1F与1R配对进行PCR扩增时，能扩增出条带大小为101bp的产物；如含SNP分子标记SiACS-1第22个碱基为C，当采用引物2F与2R配对进行PCR扩增，则能扩增出条带大小为101bp的产物。
PCR反应采用25ul反应体系，设置如下：
PCR扩增程序：
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，凝胶浓度1％，200V恒压交流电电泳20min，在紫外灯下检测扩增条带。电泳结果如图1所示，用引物对1F/1R进行扩增，1至8孔道的芝麻基因组DNA能扩增出101bp大小条带，表明其SNP分子标记第22个碱基为T，表型为每叶腋蒴果数目为3个，9至16孔道芝麻基因组DNA的SNP分子标记第22个碱基为C，没有扩增出条带，表型为每叶腋蒴果数为1个(如图1)；同理，用引物对2F/2R进行扩增，1至8孔道芝麻基因组DNA中其SNP分子标记SiACS的第22个碱基为T，没有扩增出条带，表现出每叶腋蒴果数目为3个，9至16孔道芝麻基因组DNA则扩增出大小为101bp条带，表明其含有SNP分子标记的第22个碱基为C，表型为每叶腋蒴果数目为1个(如图2)。
实施例2：与芝麻每叶腋蒴果数目紧密连锁的分子标记在芝麻种质资源中的应用
一、提取待测芝麻种质资源的基因组DNA
发明人从芝麻种质资源库中随机选取已纯化的12份每叶腋朔果数为三个的芝麻品种和12份每叶腋朔果数为一个的芝麻品种作为自然群体进行验证。种质资源信息见下表1。取适量上述24份品种资源的种子，种植于培养箱(28℃,16小时光照/8小时黑暗)中，采集嫩叶，利用CTAB法提取叶片基因组总DNA，具体步骤如下：
A.将芝麻品种叶片适量放入超低温冰箱-70℃存放，备用。使用时，自超低温冰箱(-70℃)取适量叶片样品，立即放入冰冻处理的研钵中，加入液氮研磨成粉状；快速装入50ml离心管中，加入在65℃的水浴锅中预热过的CTAB提取液(2％CTAB，0.1M Tris-Cl，1.4MNaCl，20mM EDTA，pH 7.5)，混合均匀，放入65℃的水浴锅中水浴40min；
B.取出离心管，加入等体积的氯仿和异戊醇按体积比为24:1混合的混合液，缓慢上下颠倒离心管30-50次，使充分混匀，1300g离心10min；
C.取离心后的上清于另一离心管中，重复B步骤一次。然后再取上清加入0.6倍体积冰冷异戊醇中，缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀集结为止。然后置于-20℃静置30min，挑出沉淀，用75％(体积比)酒精漂洗2-3次，干燥后加无菌水溶解；
D.再次重复B步骤一次，取上清，向其中加入0.1倍体积的NaAc(3mol/L，PH5.2)，混匀后缓慢加入2倍体积的冰冷无水乙醇，静止5min后缓慢转动离心管直至絮状沉淀出现，挑出沉淀转入1.5ml离心管中，75％(体积比)酒精漂洗2-3次，干燥后加无菌水溶解，于-20℃冰箱中保存备用，即得各芝麻品种叶片基因组总DNA。
表一24份芝麻地方品种材料的每叶腋蒴果数目及SNP位点
二、与芝麻每叶腋蒴果数目紧密连锁的分子标记验证
根据实施例1中的标记和引物序列，合成SiACS标记的引物，序列如下：
正向引物1F序列：5’-TCAGGATCGGCATGATCTAGTT-3’
反向引物1R序列：5’-CAGTAGGAACTGGGATTG-3’
正向引物2F序列：5’-TCAGGATCGGCATGATCTAGTC-3’
反向引物2R序列：5’-CAGTAGGAACTGGGATTG-3’
如果该SNP分子标记的第22个碱基为T，当采用引物1F与R配对进行PCR扩增时，能扩增出条带大小为101bp的产物；如该SNP分子标记的第22个碱基为C，当采用引物2F与R配对进行PCR扩增，则能扩增出条带大小为101bp的产物。
利用上述引物，我们对24份芝麻种质资源库中随机选取的自然群体，分单株取样，提取各植株基因组DNA，并以此为模板，进行PCR扩增。
从扩增结果可以看出，用引物对1F/1R进行扩增，1至12孔道芝麻基因组DNA中的SNP分子标记第22个碱基为T，能扩增出101bp大小条带，表型出每叶腋蒴果数目为3个，13至24孔道芝麻基因组DNA的SNP分子标记第22个碱基为C，没有扩增出条带，表型为每叶腋蒴果数为1个(如图3)；同理，用引物对2F/2R进行扩增，1至12孔道芝麻基因组DNA的SNP分子标记第22个碱基为T，没有扩增出条带，表现出每叶腋蒴果数目为3个，13至24孔道芝麻基因组DNA的SNP分子标记第22个碱基为C，则扩增出大小为101bp条带，表型出每叶腋蒴果数目为1个(如图4)；标记可靠度为100％。
综上，我们认为SNP分子标记SiACS-1与芝麻每叶腋蒴果数目性状紧密连锁，具有较好的可靠性和稳定性，可用于预测芝麻品种的每叶腋蒴果数目为3个或者1个，即可用于优质芝麻新品种选育。
序列表
<110> 中国农业科学院油料作物研究所
<120> 与芝麻每叶腋蒴果数调控基因SiACS紧密连锁的SNP分子标记与应用
<130> 1
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 101
<212> DNA
<213> 芝麻
<400> 1
tcaggatcgg catgatctat ttcaacagta aaaccctgat tgctgctgca acaaaaatgt 60
cgagttttgg gctggtctct tctcaatccc agttcctact g 101
<210> 2
<211> 101
<212> DNA
<213> 芝麻
<400> 2
tcaggatcgg catgatctat tccaacagta aaaccctgat tgctgctgca acaaaaatgt 60
cgagttttgg gctggtctct tctcaatccc agttcctact g 101
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 芝麻
<400> 3
tcaggatcgg catgatctag tt 22
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 芝麻
<400> 4
cagtaggaac tgggattg 18
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 芝麻
<400> 5
tcaggatcgg catgatctag tc 22
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 芝麻
<400> 6
cagtaggaac tgggattg 18

Claims (5)

1.一个与芝麻每叶腋蒴果数调控基因SiACS紧密连锁的SNP分子标记，其特征在于：所述的每叶腋蒴果数调控基因在芝麻SNP遗传图谱中位于第5条连锁群上，与其紧密连锁的分子标记的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一个与芝麻每叶腋蒴果数调控基因SiACS紧密连锁的SNP分子标记，其特征在于：所述的每叶腋蒴果数调控基因在芝麻SNP遗传图谱中位于第5条连锁群上，与其紧密连锁的分子标记的序列如SEQ ID NO.2所示。
3.芝麻每叶腋蒴果数调控基因SiACS紧密连锁的SNP分子标记引物，其特征在于：引物序列为：
正向引物1F序列：5’-TCAGGATCGGCATGATCTAGTT-3’，如SEQ ID NO.3所示；
反向引物1R序列：5’-CAGTAGGAACTGGGATTG-3’，如SEQ ID NO.4所示；
或为：
正向引物2F序列：5’-TCAGGATCGGCATGATCTAGTC-3’，如SEQ ID NO.5所示；
反向引物2R序列：5’-CAGTAGGAACTGGGATTG-3’，如SEQ ID NO.6所示。
4.与芝麻每叶腋蒴果数调控基因SiACS紧密连锁的SNP分子标记鉴定方法，其特征在于：用权利要求3所述的SNP分子标记引物1F与1R配对扩增从芝麻叶片中提取的基因组DNA，如果能扩增出条带大小为101bp的产物，则该待测芝麻种质的每叶腋蒴果数为3个；用SNP分子标记引物2F与2R配对扩增从芝麻叶片中提取的基因组DNA，如果能扩增出条带大小为101bp的产物，则该待测芝麻种质的每叶腋蒴果数为1个。
5.权利要求1或2所述的SNP分子标记在芝麻新品种培育中的应用，应用方法为：提取待测芝麻种质资源的基因组DNA；利用SNP分子标记引物1F与1R配对扩增芝麻种质资源的基因组DNA，如果用SNP分子标记引物1F与1R配对扩增，能扩增出条带大小为101bp的产物，表明其SNP分子标记第22个碱基为T，则该待测芝麻种质的每叶腋蒴果数为3个，可用于选育芝麻高质高产品种；用SNP分子标记引物2F与2R配对扩增从芝麻叶片中提取的基因组DNA，能扩增出条带大小为101bp的产物，表明其SNP分子标记第22个碱基为C，则该待测芝麻种质的每叶腋蒴果数为1个，为单蒴品种；
正向引物1F序列：5’-TCAGGATCGGCATGATCTAGTT-3’，如SEQ ID NO.3所示；
反向引物1R序列：5’-CAGTAGGAACTGGGATTG-3’，如SEQ ID NO.4所示；
正向引物2F序列：5’-TCAGGATCGGCATGATCTAGTC-3’，如SEQ ID NO.5所示；
反向引物2R序列：5’-CAGTAGGAACTGGGATTG-3’，如SEQ ID NO.6所示。
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