KR101788785B1 - 섬털사철란을 동정하는 방법, 동정용 조성물 및 키트 - Google Patents

섬털사철란을 동정하는 방법, 동정용 조성물 및 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하나 이상의 염기의 다형성을 확인하는 단계를 포함하는 섬털사철란(Goodyera x maximo - velutina)을 동정하는 방법, 하나 이상의 염기의 다형성을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 섬털사철란(Goodyera x maximo - velutina) 동정용 조성물 및 키트에 대한 것이다.

Description

섬털사철란을 동정하는 방법, 동정용 조성물 및 키트 {A method, composition, and kit for the identification of Goodyera x maximo-velutina}
본 발명은 핵내 ITS 부위의 염기 다형성에 근거한 섬털사철란의 신규 동정 기술에 관한 것으로, 보다 상세하게, 본 발명은 하나 이상의 염기의 다형성을 확인하는 단계를 포함하는 섬털사철란(Goodyera x maximo - velutina)을 동정하는 방법, 하나 이상의 염기의 다형성을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 섬털사철란 동정용 조성물 및 키트에 대한 것이다.
사철란속(Goodyera) 식물은 난초과(Orchidaceae)에 속하는 상록성 다년생 식물로, 전세계적으로 아프리카를 제외한 북반구의 온대 및 열대 지역에서 약 100여종이 분포한다고 알려져 있다. 한국에서 보고된 사철란속 식물로는 사철란(G. schlechtendaliana), 털사철란(흰줄사철란, G. velutina), 붉은사철란(G. biflora), 섬사철란(G. maximowicziana), 애기사철란(G. repens), 로젯사철란(G. rosulacea)과 본 연구자들에 의해 신종기재된 탐라사철란(G. x tamnaensis)을 포함하여 7종이 있으며, 주로 제주도, 남부지방, 및 울릉도에 분포하고 있는 것으로 알려져 있다.
사철란속 식물은 종에 따라 꽃과 잎, 줄기의 형태적 특징이 다양하여, 국내외적으로 관상용 등 원예적 가치가 매우 높고 보존 가치가 크다. 식물종간의 자연잡종현상은 여러 보고를 통해 알려져 왔다. 식물의 잡종현상은 종 분화의 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 식물의 진화적 관점에서 봤을 때 유전적 다양성을 증가시키고, 적응력을 높인다.
본 발명자는 2008년에 제주도에서 형태적 특징에 의해 섬사철란과 털사철란의 자연잡종으로 추정되는 식물 4개체를 최초로 발견하였다. 이후 2009년 제주도 서귀포시에서 섬사철란과 털사철란의 자연잡종으로 추정되는 개체군 3곳을 발견하였으며, 2012년에는 제주도 제주시에서도 추가로 발견하였다. 2014년에 털사철란, 섬사철란, 사철란, 탐라사철란이 함께 서식하고 있는 지역에서 자연잡종으로 추정되는 섬털사철란을 채집하여 형태관찰, 유전자분석을 포함한 본격적인 연구를 시작하였다. 이 지역은 기존에 탐라사철란이 발견된 지역의 인근이다.
기존에 사철란과 털사철란의 잡종으로 보고된 탐라사철란처럼 2008년부터 2014년까지 제주도에서 발견된 신분류군은 형태적 특징에 의해 섬사철란과 털사철란의 자연잡종으로 추정되었기 때문에 신분류군을 학술지에 공식적인 신종기재를 하지는 않았으나 잠정적으로 '섬털사철란(G. x maximo - velutina)'으로 명명하였다. 그러나, 이 섬털사철란은 섬사철란(G. maximowicziana) 및 털사철란(G. velutina)과 같은 다른 한국산 사철란속 식물과 형태적 특징을 공유하는 부분들로 인해 형태적 특징만으로 이 분류군의 실체를 밝히는데 한계가 있다.
따라서, 이 섬털사철란과 양친종으로 추정되는 섬사철란과 털사철란의 유전자를 비교분석한 분자적 연구결과를 토대로 잡종성 여부에 대한 규명이 필요하다. 또한 섬털사철란의 분류학적 실체 규명뿐 아니라 그 자원과 가치를 보존하고, 고유의 관상적 가치를 활용하며 인위적 배양 및 재배를 위한 제반 기술을 확립하기 위해서는 섬털사철란을 다른 사철란속 식물들과 비교하여 정확하게 동정할 수 있는 분자적 수준에서의 기술 개발이 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 섬사철란 및 털사철란과 같이 일부 형태적 특성이 유사한 다른 사철란속 식물들과 비교하여 섬털사철란을 신종기재하고, 섬털사철란의 잡종성 여부를 뒷받침하는 동시에 섬털사철란을 동정할 수 있는 분자표지(molecular marker)인 다형성 마커를 새로이 규명하고자 하였으며, 이를 위해 핵 유전자의 ITS(Internal Transcribed Spacer)구간을 분석하고, 아울러 모종을 규명하기 위하여 엽록체 유전자의 3구간(trnH - psbA , trnS - trnG , trnL)의 염기서열(sequence)를 조사하여 본 발명을 완성하였다.
한편, 본 발명은 정부(교육부)의 재원으로 한국연구재단의 BK21 플러스 사업(특화전문인재양성형, 에코과학 창조아카데미 사업단)의 부분적 지원을 받아 수행되었다(관리번호 31Z20130012990).
본 발명은 핵 내 ITS 부위의 염기 다형성에 근거한 섬털사철란의 신규 동정 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.
보다 상세하게, 본 발명의 목적은 사철란 속 식물의 핵DNA 시료로부터 하나 이상의 염기의 다형성을 확인하는 단계를 포함하는 섬털사철란을 동정하는 방법, 상기 염기의 다형성을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 섬털사철란 동정용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
더욱 상세하게, 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 ITS(Internal Transcribed Spacer) 영역 염기서열의 112번째 염기, 512번째 염기 및 652번째 염기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 염기의 다형성을 확인하는 단계를 포함하는 섬털사철란을 동정하는 방법, 동정용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서,
본 발명은 사철란속(Goodyera) 식물에서 추출한 핵DNA 시료에 대하여,
상기 추출된 핵DNA 시료에서 ITS(Internal Transcribed Spacer) 영역 유전자내의, 112번째 염기, 512번째 염기 및 652번째 염기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 염기의 다형성을 확인하는 단계를 포함하는, 섬털사철란(Goodyera x maximo -velutina)을 동정하는 방법에 관한 것이다.
사철란속(Goodyera) 식물은 난초과(Orchidaceae)에 속하는 식물로 전 세계에 약 100여종이 분포하는 것으로 알려져 왔으며, 섬털사철란(Goodyera x maximo -velutina) 은 사철난속에 속하는 여러해살이풀로 개화기가 9월이고 결실기가 10 내지 11월로 한국, 구체적으로 제주 지방의 그늘진 숲에서 자생하는 자생란이다. 본 발명자에 의해 확인된 섬털사철란의 형태적 특징으로는, 높이 7-(10)-16 cm이고, 줄기는 옆으로 길게 뻗으며, 잎은 난상 타원형으로 녹색이고 4-(6)-8 개가 나며, 길이 2-(3)-4 cm, 너비 1-2 cm이고, 주맥 1개와 측맥이 1-2쌍이 있고, 가장자리가 파상형이다. 잎자루는 아래쪽은 적갈색이고 위쪽은 연한 이며, 길이 8-(9)-11mm이다. 꽃차례는 수상꽃차례, 꽃의 수는 3-(5)-8 개이며, 꽃차례 축이 적갈색이며 짧은 털이 밀생한다. 꽃의 포는 곧게 서고, 피침형, 아래쪽은 적갈색이고 위쪽은 연녹색이며, 길이 7-(9)-12 mm, 아래쪽과 가장자리에 약간의 털이 있다. 꽃은 연한 분홍색이며, 등꽃받침의 길이 7-(8)-11mm이고, 아래쪽에 약간의 털이 있다. 자방은 적갈색이고, 길이 6-(8)-11 mm, 짧은 털이 밀생한다.
본 발명자들은, 최초로 제주도에서 형태적 특징에 기초하여 섬사철란과 털사철란의 자연잡종으로 추정되는 섬털사철란을 다른 추정 모종들과 함께 발견하였고, 형태학적 및 분자적 분석을 통해 섬털사철란이 털사철란과 사철란의 자연잡종임을 확인하여, 핵DNA의 ITS 부위 및 엽록체 유전자의 3구간(trnH - psbA, trnS - trnG, trnL)의 염기서열에서의 염기 다형성에 차이가 있음을 확인하였다. 이에, 섬털사철란에서 나타나는 염기 다형성 위치를 추출하여, 섬털사철란과 유사한 형태적 특징을 공유하는 양친종(털사철란과 섬사철란) 및 다른 사철란속 식물들과의 관계에서 섬털사철란을 동정할 수 있는 염기 다형성 마커를 발굴하게 되었다.
본 발명에서 "ITS(Internal Transcribed Spacer)" 는 핵 리보솜 DNA(nuclear ribosomal DNA) 로부터 전사되나 단백질로 발현되지는 않는 부위이다. ITS 염기서열은 식물, 균류, 곤충 등을 포함한 생물의 다양한 계열의 하위 분류군 수준의 계통을 추론하기 위해 이용되어 왔다. ITS 지역은 하위 분류군 수준에서 높은 정보를 가질 뿐만 아니라 피자식물의 보존된 염기서열 패턴과 높은 정렬성을 나타내는 것으로 알려져 있다. ITS 지역은 작은 크기의 프라이머들이 rRNA 유전자로부터 강하게 보존된 주변 염기서열을 나타내기 때문에 대부분의 피자식물에서 쉽게 증폭된다. 본 발명에서는 ITS 전체 지역 중에서 ITS-1 및 ITS-2 를 포함하는 일부 영역을 대상으로 염기 다형성을 조사하였고, 섬털사철란의 대표적인 서열을 서열번호 1에 나타내었다.
본 발명에서 "다형성(polymorphism)" 이란 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우, 개체가 어떤 형태와 형질 등에 관해 다양성을 나타내는 상태를 말한다. 생물의 형태는 원래 같은 것처럼 보여도 완전히 일치하는 개체는 전혀 없기 때문에 상대적으로 현저한 차이가 있는 경우, 특히 많은 수의 개체에 대해 정량적으로 비교하여 불연속적인 변이를 나타내는 경우에 다형성(polymorphism)이라는 단어가 사용된다.
본 발명에서 섬털사철란이 털사철란과 섬사철란 사이의 자연잡종임이 분자적 수준에서 명확히 규명되었으며, 잡종의 특성상, 섬털사철란 핵DNA의 특정 위치의 염기에서 털사철란 및 섬사철란의 특징적 염기가 동시에 나타나는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에서는 털사철란, 섬사철란 및 섬털사철란의 염기 다형성이 나타나는 부위를 토대로 하여 섬털사철란을 동정할 수 있는 정보를 제공한다.
본 발명의 "동정" 이란, 불명확한 개체를 생화학적, 형태적, 화학적 또는 분자생물학적 특성을 이용하여 분류학상의 위치 및 종명을 확인하는 것을 의미한다. 바람직하게, 본 발명에서 동정이란, 섬털사철란을 다른 사철란 속 식물들과 식별하는 것의 의미하며, 보다 바람직하게는 양친종과의 관계에서 섬털사철란을 식별하는 것을 의미할 수 있다.
구체적인 일 양태로서, 본 발명에서 상기 염기의 다형성을 확인하는 단계는, 다음과 같은 단계로 수행될 수 있다:
추출된 핵DNA 시료에서 ITS 영역 유전자내의, 112번째 염기, 512번째 염기 및 652번째 염기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 부위를 증폭시키는 단계; 및
상기 증폭된 핵 DNA에서 ITS 영역 유전자 내의, 112번째 염기, 512번째 염기 및 652번째 염기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 비교하는 단계를 포함하는 단계.
바람직하게, 본 발명에서 다른 사철란속 식물들과 구별되는 섬털사철란은 다음과 같은 특징 중 어느 하나를 가질 수 있다.
(a) 잎의 색이 녹색이며 가장자리가 파상형임;
(b) 잎맥이 주맥 1개와 1 내지 2쌍의 측맥을 가지고, 꽃의 길이가 2cm 이내임; 및
(c) 자방 및 화서축에 털이 밀생하고, 화서축 및 자방이 적갈색임;
(d) 꽃의 포의 색이 아래쪽은 적갈색이고 위쪽은 연한 녹색임
본 발명자들의 연구 결과, 섬털사철란은 잎의 모양, 꽃의 수나 꽃의 길이에 있어서는 섬사철란과 유사한 특징을 나타내고, 꽃의 형태, 구체적으로 화서축과 씨방의 색과 짧은 털의 밀생 특징은 털사철란과 공통된 특징을 나타내나, 화서의 형태, 잎의 수, 꽃의 포엽의 색은 섬사철란과 털사철란의 중간적 형태를 나타내었다.
따라서, 본 발명은 섬사철란 및 털사철란과 섬털사철란을 식별하는데 유용하게 사용될 수 있다.
보다 바람직하게, 본 발명은 상기 112번째 염기에서 A 및 C 가 함께 확인되고, 512번째 염기에서 G 및 T 가 함께 확인되고, 652번째 염기에서 A 및 T 가 함께 확인되는 경우 섬털사철란으로 동정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
보다 바람직하게, 상기 ITS 영역은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 발명에서는 제주도에서 사철란 14 개체, 털사철란 9 개체, 붉은사철란 5 개체, 섬사철란 14 개체, 탐라사철란(G. x tamnaensis) 7 개체, 애기사철란 2 개체, 및 로젯사철란 3 개 및 섬털사철란 21개체로 총 75개체의 생체와 표본을 사용하여 이들로부터 추출된 핵DNA 시료로부터 ITS 부위 염기 변이를 조사하여 염기 다형성 마커를 발굴하였으며, 섬털사철란으로 분류된 개체들 중, 이들 몇몇 개체의 염기서열을 대표적으로 서열목록에 기재하였다.
보다 상세하게, 본원의 서열번호 1은 섬털사철란 920,921,925,926,937 및938 개체의 ITS 영역을 나타내고, 도 7a 내지 도 7f는 섬털사철란 438, 439, 440, 441, 625, 626, 793, 920, 921, 925, 926, 932, 935, 936, 937, 938, 978, 979, 980, 981 및 982 개체의 ITS 부위를 나타내었다.
본 발명은 또한, 상기와 같은 염기 다형성을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 섬털사철란 동정용 조성물 및 동정용 키트를 제공한다.
하나의 바람직한 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 ITS 영역 염기서열의 112번째 염기, 512번째 염기 및 652번째 염기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 염기의 다형성을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 섬털사철란 동정용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 염기 다형성을 검출할 수 있는 제제는 상기 특정 위치의 염기를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브인 것이 바람직하다.
본 발명에서 "프라이머(primer)" 는 작동인자에 의해 결정된 혼성화 조건 또는 반응조건에서 특이적으로 표적DNA 서열과 결합하는데 충분한 길이의 뉴클레오티드를 말한다. 이러한 길이는 선택되는 탐지 방법에 충분한 길이일 수 있다. 일반적으로 11개 이상 뉴클레오티드 길이, 18개이상 뉴클레오티드 길이, 및 22개 이상 뉴클레오티드 길이를 사용할 수 있다. 본 발명에서는 서열번호 1을 포함하는 ITS 영역 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용하여 상기 표적 부위를 증폭시킬 수 있으며, 서열 증폭 및 서열 확인 결과 원하는 염기 다형성이 나타났는지 여부를 통하여 섬털사철란을 동정할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프로브(probe)" 란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 서열번호 1을 포함하는 ITS 영역 서열에 특이적으로 결합하는 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 섬털사철란을 동정할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당 업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
이러한 프라이머와 프로브는 고도로 엄격한 혼성화 조건하에서 표적서열과 특이적으로 혼성화할 수 있다. 본 발명의 양태에 따르는 프라이머는 표적 서열과 인접한 뉴클레오티드와 DNA 서열 유사성을 지닐 수 있지만, 표적 DNA 서열과 상이하더라도 표적 DNA서열과 환성화 할 수 있는 능력을 보유하고 있는 프로브가 통상적인 방법에 의해 고안될 수 있다.
더욱 구체적으로 본 발명의 상기 프라이머 또는 프로브는 서열번호 1로 표시되는 ITS 영역 염기서열의 112번째 염기, 512번째 염기 및 652번째 염기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 염기를 포함하는 10개 내지 100개의 연속적인 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서 "동정용 키트" 는 본 발명의 방법 양태를 수행하기 위하여, 보다 상세하게는 생물학적 샘플 중 섬털사철란을 확인하기 위한 시약 세트를 지칭한다. 본 발명의 키트는 식물성 재료 또는 식물성 재료를 포함하거나 또는 PCR에 사용될 효소, PCR을 검출할 수 있는 수단, 및/또는 dNTP 및 사용설명서를 포함할 수 있고, PCR 산물의 증폭여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분 또는 공지된 품종에 대한 동정 기준표들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다. 상기 식물성 재료는 식물로부터 수득하거나 이로부터 유래되는 재료를 지칭한다.
본 발명에서 상기 염기 다형성 마커는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 일반 PCR, 실시간 PCR, 역전사 PCR (RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR (Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR) 등의 증폭 수단 및 서열 확인을 통하여 검출될 수 있다.
본 발명에 의한 동정 방법, 동정하기 위한 조성물 및 키트를 이용하여 본 발명자가 신분류군으로 발견한 섬털사철란을 신속하고 정확하게 구별할 수 있다. 본 발명의 동정 기술을 이용하여, 섬털사철란의 자원과 가치를 보존하고, 섬털사철란 고유의 관상적 가치를 활용하여 인위적 배양 및 재배를 위한 제반 기술을 확립할 수 있으며, 나아가 난과 식물자원보전 및 다양성 유지를 위한 체계적 관리시스템을 구축할 수 있는 기반을 마련할 수 있다.
도 1은 섬털사철란의 정기준 표본을 나타낸 사진이다.
도 2는 섬털사철란의 서식지(제주도 서귀포시, 2012년 9월 11일)를 촬영한 사진이다.
도 3은 섬사철란, 섬털사철란 및 털사철란의 자방, 화서축 및 주맥을 비교한 사진이다.
도 4는 섬사철란, 섬털사철란 및 털사철란의 화서, 꽃의 길이, 포엽의 색(점선원) 및 식물 전체를 비교한 사진이다.
도 5는 내부전사지역(ITS)의 엠피계통도(most parsimonious tree)를 나타낸 것이다.
도 6은 엽록체 비암호화 지역 psbA - trnH+trnSG+trnL의 엠피계통도를 나타낸 것이다.
도 7a 내지 도 7f는 사철란속 식물들 중 ITS 영역에서의 염기 변이를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해서만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 식물 재료의 준비
사철란(G. schlechtendaliana) 14 개체, 털사철란(G. velutina) 9개체, 붉은사철란(G. biflora) 5 개체, 섬사철란(G. maximowicziana) 14 개체, 탐라사철란(G. x tamnaensis) 7 개체, 애기사철란(G. repens) 2 개체, 로젯사철란(G. rosulacea) 3 개체 및 섬털사철란(G. maximo - velutina) 21 개체로 총 75개체의 생체와 표본을 본 발명의 연구에 사용하였으며, 구체적인 식물재료의 실험번호 및 채집정보를 표 1에 나타내었다.
식물재료의 실험번호 및 채집정보
국명(학명)
(개체수) 		실험번호 채집장소 채집날짜
내군(ingroup)
섬털사철란 (G. x maximo -velutina)
(21) 		438*, 439, 440, 441 제주도 2008/9/10
625, 626 제주도 2009/8/11
793* 제주도 제주시 2012/9/11
920*, 921, 925*, 926*, 932, 935, 936, 937*, 938, 978, 979, 980, 981, 982 제주도 서귀포시 2014/9/11
섬사철란 ( G. maximowicziana )
(14) 		44* 제주도 비자림 2003/5/21
138* 제주도 교천리 2004/7/29
94, 139*, 159 제주도 어리목 2004/8/29
268* 제주도 거린사슴 2005/10/22
795* 제주도 법정사 2012/9/11
797*. 798*, 800, 801 제주도 한림읍 2012/9/11
924*, 930, 931 제주도 서귀포시 2014/9/11
털사철란 ( G. velutina )
(9) 		71* 제주도 선돌 2004/5/19
29*, 30* 제주도 선돌 2004/7/21
61, 76* 제주도 제주시 2004/8/28
269*, 270*, 271* 제주도 거린사슴 2005/10/22
290* 제주도 돈네코 2005/10/24
사철란 ( G. schlechtendaliana )
(14) 		16*, 17, 18* 제주도 선돌 2004/7/21
77, 81*, 82 제주도 제주시 2004/8/28
156 고근산 2004/10/2
257*, 260*, 264* 제주도 거린사슴 2005/10/22
627, 628 제주도 서귀포시 법정악 2009/8/11
928, 929 제주도 서귀포시 2014/9/11
탐라사철란 ( G. x tamnaensis )
(7) 		79*, 140* 제주도 서호리 2004/8/28
241*, 244* 제주도 516도로 2005/9/26
276*, 277* 제주도 돈네코 2005/10/24
630* 제주도 거인오름 2009/8/11
붉은사철란 ( G. biflora )
(5) 		22*, 23 제주도 교천리 2004/7/21
33*, 34 제주도 교천리 2004/7/29
75* 제주도 제주시 2004/8/28
외군(outgroup)
애기사철란 ( G. repens )
(2) 		98*, 137* 태백산 2004/7/20
로젯사철란 ( G. rosulacea )
(3) 		4*, 5*, 6* 도봉산 2004/6/29
※ '*'표시는 cpDNA 분석을 실시한 재료를 나타냄
실시예 2. 형태학적 분석 및 DNA 분석 방법
형태학 및 DNA분석에 사용한 식물 재료들 및 모든 표본들은 이화여자대학교 식물표본실(EWH)에 보관되어 있다. 교배종과 양친으로 추정되는 3개의 분류군에서 14개의 형태학적 특징들을 관찰하고 측정하였다. 한국산 사철란속(Goodyera)에 속하는 총 7개의 종과 자연잡종(natural hybrid)로 추정된 섬털사철란(G. maximo -velutina)의 표본을 사용하였다. 한국산 사철란속에 속하는 종들 중 하나인 애기사철란(G. repens)와 로젯사철란(G. rosulacea)은 외집단(outgroup)으로 사용하였다. 핵의 내부전사지역(ITS) 계통연구를 위해 섬털사철란(G. x maximo - velutina )의 21개 식물체로부터 직접적인 염기서열(21 accessions)과 클로닝된 서열(51 accessions)을 포함하여 한국산 사철란속 식물 8종으로부터 총 126 accessions을 분석하였다. 이들 중 cpDNA의 계통연구를 위해서는 섬털사철란의 6개 개체를 포함하여 총 43 accessions 를 분석하였고, 세 개의 cpDNA 비암호화 지역(noncoding region), 즉 trnH - psbA, trnS - trnG, 및 trnL 인트론을 분석하였다.
전체 게놈 DNA를 DNeasy plant mini kit(Qiagen Inc., Valencia, California)를 이용하여 추출하였다. 증폭 및 염기서열결정(sequencing)반응에 쓰이는 프라이머(primer)는, 내부전사지역(ITS region)의 ITS4, ITS5; trnH - psbA intergenic spacer의 trnHR 및 psbA ; trnS - trnG intergenic spacer의 trnS(GCU)와 trnG(UCC); 및 trnL(UAA) 인트론 지역의 trnc, trnd 를 사용하였으며(표 2), 하기 표 3에 기재된 조건에서 PCR을 실시하였다. PCR을 수행하여 얻어진 결과물들은 AccuPrep PCR purification Kit(BIONEER)을 이용하여 정제하였다.
양친종으로 추정되는 섬사철란과 털사철란의 염기서열에 2개의 리보타입(ribotype)이 존재하는지 여부를 확인하기 위하여, 섬털사철란의 nrDNA의 내부전사지역(ITS)의 PCR 결과물들을 pGEM-T Easy Vector System Ⅱ (Promega, Madison, Wisconsin)을 사용하여 클로닝하였다. 형질전환된 세포들을 항생제 앰피실린(ampicillin)이 포함된 LB-agar 배지에 도말하였으며, 이로부터 섬털사철란의 51 흰색 콜로니(colony)가 나타났다. 나타난 콜로니들로부터 클로닝되어 들어간 DNA의 사이즈가 맞는지 여부를 PCR을 이용하여 확인하고, 스크리닝(screening)하였다.
정제된 PCR 결과물에 대해 Big Dye Terminator cycle sequencing reagent를 이용하여 염기서열결정(sequencing)반응을 진행하였다. 염기서열결정반응에 사용한 프라이머는 증폭에 사용한 프라이머와 동일하다. MEGA 6.0 프로그램을 이용하여 서열 조각을 모아서 편집하였고, 내부전사지역(ITS)와 cpDNA 지역을 ClustalW 방법으로 각각 정렬하였다. 핵유전자의 내부전사지역 서열(ITS sequence)을 전기영동상(electropherogram)의 피크(peak)와 겹쳐봄으로써 다형성을 확인하였다. 또한 상기로부터 얻어진 ITS와 combined cpDNA의 결과를 최대절약분석(maximum parsimony, MP) 하고, gap을 missing data로 처리하였다. 분석방법으로는 Heuristic MP search를 하였는데, tree-bisection-reconnection(TBR) branch swapping을 선택하여 분류군의 random stepwise addition과 함께 1,000회 반복하여 multiple tree를 작성하였다. 부트스트랩 값(bootstrap value)은 TBR branch swapping과 simple stepwise addition을 이용하여 1,000회 반복 분석한 후 계산하였다.
연구에 사용된 프라이머와 프라이머 서열
프라이머명 프라이머 서열
ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC
ITS5 GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G
trnS(GCU) GCC GCT TTA GTC CAC TCA GC
trnG(UCC) TTA CCA CTA AAC TAT ACC C
trnHR GTT ATG CAT GAA CGT AAT GCT C
psbAF CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT C
trnc CGA AAT CGG TAG ACG CTA CG
trnd GGG GAT AGA GGG ACT TGA AC
중합연쇄반응(PCR)에 사용된 조건
Denaturation 94, 1분
36 cycles
Annealing 52 ~ 54, 1분
Extension 72, 1분
실험결과
1. 형태학적 분석 결과
섬털사철란(G. x maximo - velutina)과 이의 양친종일 것으로 추정되는 섬사철란(G. maximowicziana) 및 털사철란(G. velutina)의 사진을 도 3과 도 4에 나타내었으며, 이들의 형태학적인 특징을 비교한 결과를 표 4에 나타내었다.
특징 섬사철란 섬털사철란 털사철란
잎의 색 녹색 녹색 어두운 자녹색/녹색
잎의 수 7 4-(6)-8 4-5
주맥 흐림 흐림 뚜렷
측맥 1-2쌍 1-2쌍 없다
잎자루 길이(mm) 10-17 8-(9)-11 10-15
잎의 길이(cm) 20-65 17-(24)-34 20-40
잎의 넓이(cm) 10-17 10-(13)-16 10-25
화서축 색 연녹색 적갈색 적갈색
꽃줄기 털유무 없다 있다 있다
포의 색 연녹색 하단부 적갈색, 상단부 연녹색 적갈색
꽃의 수(개) 3-7 3-(5)-8 6-12
꽃의 길이(mm) 8-12 7-(8)-11 5-10
씨방의 색 연녹색 적갈색 적갈색
씨방의 털유무 없다 있다 있다
일반적으로 신분류군인 섬털사철란(G. x maximo - velutina)의 잎의 모양이 섬사철란과 유사한 특징을 나타내는데, 예를 들면, 잎이 녹색이고 주맥이 털사철란에 비해 흐리며 측맥이 1-2쌍이 있는 것으로 관찰되었다. 꽃의 수와 꽃의 길이에 있어서도 섬털사철란(G. x maximo - velutina)은 털사철란 보다는 섬사철란에 가까웠으나, 화서축과 씨방이 적갈색이며 짧은 털이 밀생하는 것은 털사철란과 공통적으로 나타나는 특징으로 관찰되었다. 그러나 섬털사철란의 화서 형태, 잎의 수, 꽃의 포엽의 색은 섬사철란과 털사철란의 중간적 형태를 나타내었다. 포엽의 색의 경우, 섬사철란의 것이 연녹색이고 털사철란의 것이 적갈색인데 비하여 섬털사철란의 것은 하단부는 적갈색이고 상단부는 연녹색인 것이 특징이다.
2. 분자적 분석 결과 : nrITS 분석
내부전사지역- 핵 DNA의 ITS 지역은 673개의 염기로 정렬되었고, 이들 중에서 491개가(73 %) 일치하였고, 67개는(10.0%) 계통학적 정보를 나타내었다. 전체 내부전사지역(ITS) 서열을 최대절약분석(maximum parsimony, MP)한 결과, 224개의 tree length(TL), 0.77의 일치지수 (consistency index, CI), 0.92의 보존지수(retention index, RI)를 가지는 100개의 엠피계통도(most parsimonious tree)를 도출하였다. 도 5에 100개의 엠피계통도(most parsimonious tree)중 하나를 나타내었다. 섬털사철란의 서열들 모두, 섬사철란과 털사철란과 같은 분계조를 형성하였다.
또한, 내부전사지역 서열(ITS sequence)을 전기영동상(electropherogram)의 피크(peak)와 겹쳐봄으로써 다형성을 확인하였으며, 이로부터 탐라사철란의 3개의 뉴클레오티드(nucleotide) 부위인 112에서 섬사철란의 C와 털사철란의 A를, 512에서 섬사철란의 G와 털사철란의 T를, 652번 염기에서 섬사철란의 T와 털사철란의 A를 공유하는 다형성 마커가 나타났다(표 5). 또한 클로닝 결과를 통해 양친종 식물의 2개의 리보타입(ribotype)이 존재하는 것을 확인하였다.
내부전사지역(ITS)의 다형성 좌위
taxa/loci 112 512 652
G. maximowicziana(섬사철란) C G T
G. x maximo - velutina(섬털사철란) M(A/C) K(G/T) W(A/T)
G. velutina(털사철란) A T A
G. schlechtendaliana(사철란) A G T
G. x tamnaensis(탐라사철란) A T A
G. biflora(붉은사철란) A A T
G. rosulacea(로젯사철란) A G T
G. repens(애기사철란) A G T
** M은 A/C, K는 G/T, W는 A/T를 나타냄
다형성 분석 결과, 112(M), 512(K), 652(W) 위치에서 다른 종들(즉, G. velutina, G. schlechtendaliana , G. biflora , G. maximowicziana , G. repens 및 G. rosulacea) 에서는 다형성 부위가 나타나지 않은 반면, 섬털사철란에서는 양친종으로 추정되는 종들의 분자마커인 염기를 공유하는 것으로 분석되었다. 다른 종들(즉, G. velutina , G. schlechtendaliana , G. biflora , G. maximowicziana , G. repens 및 G. rosulacea) 에는 다형성 부위가 없었음을 생각해볼 때, 본 발명에서 확인한 섬털사철란의 다형성 뉴클레오티드(nucleotide) 부위는 섬털사철란이 잡종임을 뒷받침하는 것이다.
3. 분자적 분석 결과 : Combined cpDNA 분석
섬털사철란과 섬사철란 및 털사철란의 43 accession들에 대하여 trnH - psbA , trnS-trnG, trnL 인트론의 조합된 염기서열(sequence)를 조사하였다. 이 서열들을 다중정렬하여 1,888개의 위치에서 결과를 보았다. 정렬된 위치를 볼 때, 1,710개(90.6%) 부위가 일정했고, 75개 부위(4.0%)가 계통학적 정보를 나타내었다.
3개의 비전사 엽록체 구간의 서열을 통합하여 최대절약분석(maximum parsimony, MP)한 결과, 175개의 tree length(TL), 0.87의 일치지수 (consistency index, CI), 0.90의 보존지수(retention index, RI)를 가지는 3개의 엠피계통도(most parsimonious tree)를 도출하였다. 도 6에 3개의 엠피계통도(most parsimonious tree)중 하나를 나타내었다. 섬털사철란의 서열은 모두 섬사철란과 같은 분계조를 형성함으로써 섬털사철란의 모계가 섬사철란으로 나타났다.
<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> A method, composition, and kit for the identification of Goodyera x maximo-velutina <130> DPP20161305KR <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 673 <212> DNA <213> G.x_maximo-velutina_6_ids_920,921,925,926,973,938 <220> <221> unsure <222> (1)..(673) <223> m is a/c; k is g/t; w is a/t; and n is absent <400> 1 tcgagaccct aaaaggattg gatgactttt gacaacacgt gagcggttga cggcgattgc 60 tgtctataaa caccatccat ctattgtccc ttcttgattg gagctacaat gmaaagatgg 120 aaggaaaaat aanctcgggc gcagttatgt gccaaggaag tatgctgcat tagnncatcg 180 atggctattc gtaaaaagcc cggcggggtt agcggattgc tgttgttgct ttctaagtat 240 tgtatgactc tcggcaatgg atatcttggc tcttgcatcg atgaagagcg cagcgaaatg 300 cgatacgtgg tgtgaattgc agaatcccgt gaaccatcga gtttttgaac gcaagttgcg 360 cccgaggcca attggctaag ggcacgtccg cctgggcgtc aagcattacg tcgcttcatt 420 cgrcaccaat tgcccaatat tgtgtnttgc ggtgccggtt tggatgcgga gagtggccct 480 tcgcgcacac ttgtgcgacg ggttgaagaa ckgtttgctt tcctctggca atgttttgat 540 aaaggggtgg atgtatgctg ccatttggcc cacgctatca tctcattgtc tcgaggagga 600 tatgtgtaca cattcgtggc tgatcacccg ataaatgtcg taggtggcgc cwtgaaatgc 660 gaccccagga tgg 673 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> ITS4 primer <400> 2 tcctccgctt attgatatgc 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> ITS5 primer <400> 3 ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> trnS(GCU) primer <400> 4 gccgctttag tccactcagc 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> trnG(UCC) primer <400> 5 ttaccactaa actataccc 19 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> trnHR primer <400> 6 gttatgcatg aacgtaatgc tc 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> psbAF primer <400> 7 cgcgcatggt ggattcacaa tc 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> trnc primer <400> 8 cgaaatcggt agacgctacg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> trnd primer <400> 9 ggggatagag ggacttgaac 20

Claims (9)

  1. 사철란 속 식물에서 추출한 핵DNA 시료에 대하여,
    상기 추출된 핵DNA 시료에서 서열번호 1의 서열로 이루어진 ITS(Internal Transcribed Spacer) 영역 유전자내의, 112번째 염기, 512번째 염기 및 652번째 염기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 염기의 다형성을 확인하는 단계를 포함하는,
    섬털사철란(Goodyera x maximo-velutina)을 동정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 염기의 다형성을 확인하는 단계는,
    상기 추출된 핵DNA 시료에서 ITS 영역 유전자내의, 112번째 염기, 512번째 염기 및 652번째 염기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 부위를 증폭시키는 단계; 및
    상기 증폭된 핵 DNA에서 ITS 지역 유전자 내의, 112번째 염기, 512번째 염기 및 652번째 염기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 비교하는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 112번째 염기에서 A 및 C 가 함께 확인되고, 512번째 염기에서 G 및 T 가 함께 확인되고, 및 652번째 염기에서 A 및 T 가 함께 확인되는 경우 섬털사철란인 것으로 동정하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 섬털사철란은 다음의 특징을 가지는 것인 방법:
    (a) 잎의 색이 녹색이며 가장자리가 파상형임;
    (b) 잎맥이 주맥 1개와 1 내지 2쌍의 측맥을 가지고, 꽃의 길이가 2cm 이내임; 및
    (c) 자방 및 화서축에 털이 밀생하고, 화서축 및 자방이 적갈색임;
    (d) 꽃의 포의 색이 아래쪽은 적갈색이고 위쪽은 연한 녹색임.
  5. 삭제
  6. 서열번호 1로 표시되는 ITS 영역 염기서열의 112번째 염기, 512번째 염기 및 652번째 염기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 염기의 다형성을 검출할 수 있는 제제를 포함하는,
    섬털사철란 동정용 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 염기를 검출할 수 있는 제제는 상기 염기를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브인 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 프라이머 또는 프로브는 서열번호 1로 표시되는 ITS 영역 염기서열의 112번째 염기, 512번째 염기 및 652번째 염기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 염기를 포함하는 10개 내지 100개의 연속적인 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열로 이루어진 것인 조성물.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는,
    섬털사철란 동정용 키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN109328916A (zh) * 2018-11-23 2019-02-15 湖南科技大学 一种采用混种花卉减少油菜吸收重金属的方法

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