CN107988416A - 一种用于鉴定苏州青的分子鉴别方法和引物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定苏州青的分子鉴别方法和引物。一条通能够在苏州青中扩增到的特异性DNA片段，该片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所述。根据此特异性片段的核苷酸序列，设计序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的一对引物，能够在苏州青中扩增出特定长度的片段，而在其他青菜品种中则不能扩增出该片段，从而实现对苏州青的特异性鉴别。本发明操作简便、稳定可靠，是第一个应用于苏州青品种的分子鉴定方法，可用于该品种的选种、育种、种植、采收和品种贸易等各环节中的快速鉴定，同时对保护苏州市优良地方品种的种质资源具有重要的意义。

Description

一种用于鉴定苏州青的分子鉴别方法和引物

技术领域

本发明属于分子标记鉴定领域，特别涉及一种用于鉴定苏州青的分子鉴别方法和引物。

背景技术

青菜(Brassica rapa var.chinensis(L.)Kitam.)又名不结球白菜，为十字花科(Brassicaceae)芸薹属(Brassica L.)植物，一年生或二年生草本，是我国常见的绿叶蔬菜之一。长江以南为青菜的主要产区，四季生产，市场需求量大。青菜原产中国，栽培历史悠久，品种繁多。目前对青菜种质资源的鉴别主要依据株型、茎、叶、种皮等形态学特征，但由于大部分青菜品种在苗期形态相似，直到成株才开始表现出品种的特性，且形态学的特征常常存在过渡和交叉，难以划定明确的界限，给青菜的品种鉴定造成了极大的困难。

苏州青是苏州市优良地方品种和主栽青菜品种，属于不结球白菜中的青梗菜类型，具有生长期短、适应性强、产量高、品质好、营养丰富等特点。其粗纤维的含量在国产品种中为最低，糖和叶绿素含量高，糯性品质好，质地鲜嫩，长江中下游地区的江苏、安徽、浙江、上海等地均有大面积栽培。80年代以后，经过不断的推广，已在我国普遍种植，并有部分种子出口到日本、东南亚等国，受到一致好评。苏州青青菜株型直立、较矮；叶片深绿色，椭圆形或近圆形，叶面平滑，全缘，叶脉明显凸出；叶柄短，绿色，基部肥厚。它在形态上与一些青菜品种十分相近，如与上海青仅在株高、叶柄长及叶色存在细微差别，因而易于同其他品种相混淆。因此，开发苏州青保护性、专一性鉴别分子标记具有重要的科学意义和应用价值。

近年来，随着DNA分子标记技术的逐渐成熟，在农作物的品种鉴定上也得到了广泛应用。DNA分子标记相对于传统的遗传标记具有遗传多态性高、变异丰富；稳定性高，不受取材部位、发育阶段和环境因素影响；检测手段便捷、准确率高等多项优势。目前常用的DNA分子标记主要有RFLP、RAPD、AFLP、SCAR、SSR、ISSR、SRAP等。其中SCAR(Sequencecharacterized amplified region)即序列特异性扩增区域，由Paran和Michelmore于1993年提出，是一种采用特定引物的基于PCR扩增的分子标记技术。通常是由RAPD、SRAP、ISSR标记转化而来，是将上述分子标记筛选出的特异标记片段进行克隆和测序，根据其碱基序列设计一对特异引物，用于对特征区域的特异性扩增。SCAR标记一般表现为扩增片段的有或无，是一种显性标记，具有特异性高、稳定性好、可重复性强等优点，且技术简单、检测迅速、样品用量少、实验成本低，因而成为育种实践中应用的首选标记。

目前对于青菜品种的分子鉴定研究大多利用RAPD、AFLP、SSR等方法，但这些方法操作繁琐、重复性差，并且不是可直接应用的专一性、特异性分子标记，因此不适合用于稳定、快速、准确的品种鉴别体系的开发。本发明是首次对苏州地方名特优品种——苏州青进行分子标记的研究，本发明提供的鉴定苏州青的ISSR-SCAR标记方法具有操作简单、灵敏度高、重复性好等优点，无需酶切、克隆、探针制备、分子杂交等工作，能够迅速、高效地实现对苏州青的特异性鉴定，对于保护地理标志产品的种质资源具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定苏州著名青菜农家品种——苏州青的特异性分子标记方法，通过筛选到的ISSR引物在苏州青中扩增出特异性条带，并针对该特异性条带设计SCAR引物，利用这对引物可通过简单的DNA片段扩增技术将苏州青和其它青菜品种区分开来，实现对苏州青的快速、准确鉴定。该发明为青菜的品种鉴别和种质资源保护提供了有力的技术支持。

本发明通过48条ISSR引物对苏州青和其他10种江淮地区主栽的青菜品种(包括上海青、小八叶、中其白、五月慢、矮脚黄、四月慢、黄心乌、黄种香青菜、黑种香青菜和绣花筋)进行PCR扩增，筛选出的能够在苏州青中扩增出特异性条带的ISSR引物，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。

本发明涉及一个苏州青特异性DNA片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。该片段是使用核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的ISSR引物在苏州青中扩增出的一条特异性条带，该扩增条带只出现在苏州青中，而在其它青菜品种中没有。将该特异性条带进行切胶回收和克隆测序获得其核苷酸序列。

本发明涉及一对特异性鉴别苏州青的SCAR引物，优选上游引物为SEQ ID NO.3，下游引物为SEQ ID NO.4，的引物；分别对应于SEQ ID NO.2片段的133-153nt及362-383nt位点，其扩增产物长度为251bp。

本发明所述的特异性DNA片段在鉴别青菜品种苏州青中的应用。

本发明所述的引物在鉴别青菜品种苏州青中的应用。

本发明所述的引物在制备鉴别苏州青的试剂中的应用。

一种苏州青的分子鉴别方法，包括待测青菜品种的基因组DNA中是否含有本发明所述的特异性DNA片段，如果含有所述的特异性DNA片段，则表明待测青菜品种为苏州青；若不含有所述的特异性DNA片段，则表明待测青菜品种不是苏州青。

所述的分子鉴定方法优选利用特异性鉴别苏州青的SCAR引物(SEQ ID NO:3和SEQID NO:4)对待检青菜品种的DNA样品进行PCR反应，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，在251bp处出现扩增条带的样品为苏州青，该部位没有出现条带的样品则不是苏州青。

本发明所述的鉴别苏州青的PCR反应体系为20μl，其组分及终浓度为：DNA模板(20ng/μl)1.0μl，2×Reaction Mix(含20mM Tris-HCl，100mM KCl，3mM MgCl2，400μM的dNTPs，溴酚蓝)10.0μl，引物(10mM)各0.8μl，Taq DNA聚合酶(2.5U/μl)0.4μl，最后用双蒸水补齐至20μl。PCR程序为：94℃，5min预变性；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸8min。PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(EB)染色，用2000bp的DNA ladder作为分子量标记，电压80V，电泳0.5h后用凝胶成像系统观察、拍照。

有益效果：

本发明提供了一种可以快速、准确地鉴定苏州青的特异性DNA片段、PCR引物以及ISSR-SCAR标记方法，具有重复性高、特异性好等优点，能够用于苏州青青菜品种的特异性鉴定，对于保护优良青菜地方品种的种质资源具有重要的意义。

附图说明

图1是苏州青和其余10个青菜品种的ISSR引物(SEQ ID NO.1)扩增图谱。泳道1-11从左至右依次为：苏州青、中其白、五月慢、黄种香青菜、矮脚黄、四月慢、黄心乌、上海青、小八叶、黑种香青菜、绣花筋，M表示DNA Marker。箭头所示400bp处为苏州青特有条带。

图2是苏州青和其他青菜品种各8个单株的ISSR-SCAR(SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4)验证图谱。A：苏州青，能扩增出251bp的特异性条带，B：中其白，C：五月慢；D：黄种香青菜；E：矮脚黄；F：四月慢；G：黄心乌；H：上海青；I：小八叶；J：黑种香青菜；K：绣花筋。泳道1-8为各品种的8个不同单株，M表示DNA Marker。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例进行详细说明。

1、待检样品DNA的提取

针对苏州青及邻近地区栽培的其他10个常见青菜品种(表1)，每个品种随机选取生长状况良好的植株8-10株，分别采集幼嫩且无病虫害的干净叶片约100mg，经TissueLyser LT组织破碎仪(QIAGEN，德国)将样品进行破碎，利用Easy Pure Plant Genomic DNAKit试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)提取样品总DNA，具体操作流程参照试剂盒说明书。用核酸蛋白检测仪(eppendorf，美国)检测DNA的浓度及纯度，调整DNA浓度为20ng/μl，并将DNA样品于-20℃保存备用。

表1实验材料表

2、ISSR引物的筛选

选择文献已报道的48条ISSR引物对11个青菜品种进行DNA片段扩增，引物由南京锐真生物技术有限公司合成，具体实施方式如下：

将11个青菜品种不同个体的DNA进行等量混合，以每个品种的DNA混合液作为模板，利用上述ISSR引物进行PCR反应。反应体系为20μl，其组分及终浓度为：DNA模板(20ng/μl)1.0μl，2×Reaction Mix(含20mM Tris-HCl，100mM KCl，3mM MgCl2，400μM的dNTPs，溴酚蓝)10.0μl，引物(10mM)1.5μl，Taq DNA聚合酶(2.5U/μl)0.4μl，最后用双蒸水补齐至20μl。PCR反应在BioMetra T1型PCR仪上进行，PCR程序为：94℃，7min预变性；94℃变性1min，55℃(不同引物的退火温度略有差异)退火45s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物利用3.0％琼脂糖凝胶进行电泳检测，凝胶用溴化乙锭(EB)染色，用2000bp的DNAladder(广州东盛生物科技有限公司)作为分子量标记，电压为80V。电泳1.5h后通过凝胶成像系统观察、拍照。

通过PCR扩增，在48条ISSR引物中筛选到一条能够在苏州青中扩增出特异性条带的引物，该引物序列如SEQ ID NO.1所示(图1)。

3、苏州青特异性条带的克隆及测序

将步骤2中得到的包含苏州青特异性条带的凝胶在紫外灯下切下，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自Axygen公司)对该特异性条带进行回收、纯化。将回收的目的DNA片段连接到pMD19-T载体(购自Takara公司)，反应体系10μl，包括以下组分：Vector 1μl，Solution I 5μl，DNA 4μl，4℃过夜连接。次日，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自Takara公司)。具体步骤为：取5μl连接产物加入感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴5min，加500μl液体SOC培养基，于37℃、180rpm的摇床中培养1小时，涂平板，放在37℃培养箱中倒置培养过夜。次日，挑取单菌落，用通用引物M13和RV-M进行菌落PCR检验，PCR体系和程序同前。将含有正确条带的克隆交由南京锐真生物技术有限公司以通用引物进行双向测序。测序结果用sequencer软件进行拼接，得到的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

4、ISSR-SCAR标记的开发和验证

根据步骤4中得到的苏州青序列SEQ ID NO.2，设计一对特异性引物(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)用于SCAR反应，并在11个青菜品种共88个个体中进行单株验证。反应体系为20μl，包含组分及终浓度为：DNA模板(20ng/μl)1.0μl，2×Reaction Mix(含20mM Tris-HCl，100mM KCl，3mM MgCl2，400μM的dNTPs，溴酚蓝)10.0μl，引物(10mM)各0.8μl，Taq DNA聚合酶(2.5U/μl)0.4μl，最后用双蒸水补齐至20μl。扩增程序为：94℃，5min预变性；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸8min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭(EB)染色，用2000bp的DNA ladder作为分子量标记，电压80V，电泳0.5h后用凝胶成像系统观察、拍照。结果如图2所示，可见本发明开发的引物具备良好的特异性，能实现苏州青的特异性鉴定。

序列表

<110> 江苏省中国科学院植物研究所

<120> 一种用于鉴定苏州青的分子鉴别方法和引物

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggagaggaga ggaga 15

<210> 2

<211> 424

<212> DNA

<213> 苏州青青菜(Brassica chinensis var chinensis)

<400> 2

tggagaggag aggagactaa tttgatctct caatctcaat atcggaaacg ctgccggaga 60

aaacatcgtt tagcggcggg actaatcttg ctgtcgacgg agctggaagc agcttctttt 120

tcttctccag atctctaacc gattctcacc tcctcctgtt tgaccggttc gttttctccg 180

cctacttttg gatctctttc ctcagctatt ggcatgatat tccgattacg ttgatcgtcc 240

attttctcga atccattgtg cattgacgac aaatcgttgt taagatcgat gccacgatag 300

atcgaaacgt cgccgtttcc gaatttaata acctcgtctt gacagatcag taaacatggc 360

ttacgattga taaaaagcct atacgttaca ttcaatctga ttggatcttc tcctctcctc 420

tcca 424

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctctaaccga ttctcacctc c 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tataggcttt ttatcaatcg ta 22

Claims (9)

1.一条能够在苏州青中扩增到的特异性DNA片段，其特征在于该片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所述。

2.用于检测权利要求1所述的特异性DNA片段的引物。

3.根据权利要求2所述的引物，其特征在于所述的引物核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

4.权利要求1所述的特异性DNA片段在鉴别青菜品种苏州青中的应用。

5.权利要求2或3所述的引物在鉴别青菜品种苏州青中的应用。

6.权利要求2或3所述的引物在制备鉴别苏州青的试剂中的应用。

7.一种苏州青的分子鉴别方法，其特征在于待测青菜品种的基因组DNA中是否含有权利要求1所述的特异性DNA片段，如果含有权利要求1所述的特异性DNA片段，则表明待测青菜品种为苏州青；若不含有权利要求1所述的特异性DNA片段，则表明待测青菜品种不是苏州青。

8.根据权利要求7所述的苏州青的分子鉴别方法，其特征在于该方法包括利用权利要求2或3所述的引物，在待测青菜品种的基因组DNA中通过常规的PCR反应对权利要求1所述的特异性DNA片段进行扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，电泳结果中出现一条251bp条带的样品为苏州青，而该位置没有出现条带的样品则不是苏州青。

9.根据权利要求8所述的分子鉴别方法，其特征在于所述的PCR反应的反应体系为20μl，其组分及终浓度为：20ng/μl的DNA模板1.0μl，2×Reaction Mix 10.0μl，10mM引物各0.8μl，2.5U/μl Taq DNA聚合酶0.4μl，最后用双蒸水补齐至20μl；PCR程序为：94℃，5min预变性；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸8min；PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，用2000bp的DNA ladder作为分子量标记，电压80V，电泳0.5h后用凝胶成像系统观察、拍照；其中所述的Reaction Mix含20mM Tris-HCl，100mM KCl，3mM MgCl2，400μM的dNTPs，溴酚蓝。