CN108165652A - 用于香榧苗期性别鉴定的特异性分子标记tgmi001 - Google Patents

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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits

Abstract

本发明公开了用于香榧苗期性别鉴定的特异性分子标记TGMI001。本分子标记TGMI001的上游引物TGMI001‑F核苷酸序列如SEQ.ID No1所示，下游引物TGMI001‑R核苷酸序列如SEQ.ID No2所示；所述标记在雄性个体中扩增所得特异性条带核苷酸序列如SEQ.ID No3所示。本特异性分子标记TGMI001可用于香榧苗期雌雄性别的早期鉴定检测，不但可以打击香榧幼苗掺假行为，减少损失，而且有助于造林时开展雌雄幼苗合理规划，避免大量雄株在生产中造成浪费；此外本特异性分子标记可用于雌雄性别标记辅助选择，提高育种效率，缩短育种周期，具有很大的应用潜力和较好的经济价值。

Description

用于香榧苗期性别鉴定的特异性分子标记TGMI001
技术领域
本发明属于经济林木分子鉴定技术领域，具体涉及到一种用于香榧苗期性别鉴定的特异性分子标记TGMI001。
背景技术
香榧(Torreya grandis Fort.ex Lindl.cv.Merrillii Hu)是我国特有珍稀干果,是榧树中唯一进行人工规模化栽培的优良变异类型，也是集材用、药用、果用、油用和观赏于一体的经济树种，据记载已有1300多年的栽培历史。香榧经济价值高，全国对香榧苗木的需求量大，播种育苗是香榧育苗的主要手段之一。但作为多年生雌雄异株树种，香榧生长缓慢，童期长，实生苗繁殖一般需要15～20年才能开花结实，未开花的幼树难以鉴别雌雄。生产上结合香榧风媒传粉的特点，多采用嫁接的方法来提早结实和提高产量。但接穗来自成年雌株，一方面采集接穗会影响母株产量，另一方面接穗价格高、且常有掺假现象。因此，开展香榧苗期的性别鉴定，首先可以防止和杜绝以雄株冒充雌株的现象，减少损失；其次，在香榧雌株优树实生苗繁育的过程中可以提高育种效率；第三，通过香榧生产林中合理的性别布植，可以使亩产最大化。截止本发明，虽然有从形态标记、生理生化、细胞染色体和AFLP标记等多方面关于香榧性别的早期鉴定的研究报道，但均未找到一种准确高效的方法。
发明内容
本发明的一个目的是为了改善上述问题，提供一种用于香榧苗期性别鉴定的特异性分子标记TGMI001。
本发明开发了一种鉴别香榧苗期性别的特异性分子标记引物，其特征在于该引物核苷酸序列如下：
上游引物TGMI001-F：5’-GCCCAGGCATTCTGAAACA-3’，如SEQ.ID No1所示；
下游引物TGMI001-R：5’-CCCCGTCCCAAAAAACAAA-3’，如SEQ.ID No2所示。
此对特异性分子标记引物是采用普通PCR技术，利用目标起始密码子多态性(Start condon targeted polymorphism，SCoT)标记通用引物对香榧雌株和雄株样品DNA进行扩增，对扩增产物进行电泳，筛选雌雄单株特异性条带进行测序，然后对测序获得的香榧雌雄差异条带序列进行比对，并以此设计特异性引物(TGMI001-F/R)。该引物对具有极高的专一性，用此对引物对香榧雌雄单株进行PCR扩增，只有雄株能获得461bp的DNA条带，而雌株没有；其雄株扩增得到的特异片段核苷酸序列如SEQ.ID No3所示。
本发明的另一个目的是提供利用上述特异性分子标记引物对不同香榧幼苗进行雌雄快速鉴定的方法。
本发明采用上述特异性分子标记引物(TGMI001-F/R)作为特异性扩增引物，以待测香榧样本基因组DNA为模板，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现一条461bp的DNA条带，则待测样本为雄性个体；若电泳结果未出现一条461bp的DNA条带，则待测样本为雌性个体。
上述方法中扩增引物的选择、基因组DNA的提取确定，以及电泳检测，这些步骤均可按照本领域常规方法进行。
需要说明的是，本发明特异性性分子标记引物和检测方法仅适用于香榧雌雄个体的鉴别，即待测样本是限定为香榧样本的范围内，本领域普通技术人员采用本发明方法可对香榧个体进行雌性性别的快速鉴定，方法简便、准确、快速，是其他现有鉴别方法不能实现的。
具体的所述方法如下：
(1)去待测香榧样本新鲜叶片0.1-0.3g，加入液氮研磨，利用植物基因组DNA提取试剂盒提取待测香榧的基因组DNA；
(2)以步骤(1)所得的基因组DNA为模板，以所述特异性分子标记引物(TGMI001-F/R)为扩增引物，进行普通PCR扩增：
PCR反应体系(总体积为10μl)组成如下：
PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；32个循环(94℃变性40秒，退火温度59℃复性40秒，72℃延伸90秒)；最后72℃延伸10分钟。
(3)用1％琼脂糖凝胶电泳检测步骤(2)所得的PCR扩增产物，利用凝胶成像系统进行成像拍照，若电泳结果出现一条461bp的DNA条带，则待测样本为雄性个体；若电泳结果未出现一条461bp的DNA条带，则待测样本为雌性个体。
本发明的有益效果主要体现在：本发明的特异性分子标记引物(TGMI001-F/R)可对香榧雌雄性别进行快速的分子鉴定，方法简单、准确、高灵敏度，是其他现有鉴别方法不能达到的。
附图说明
图1为采用本发明的特异性分子标记对香榧雌雄个体进行PCR扩增后的电泳图；其中通道M为DNA标准分子量Marker DL2000；通道1～5：雌性香榧个体；通道6～10：雄性香榧个体。其中通道1和6为淳安产地的雌雄样本，2和7为诸暨产地的雌雄样本，3和8为遂昌产地的雌雄样本，4和9为磐安产地的雌雄样本，5和10为临安产地的雌雄样本)
具体实施方式
以下实施例是对本发明的具体实施方式作进一步详述。
实施例1.
1.待测香榧样本基因组DNA提取
取待测香榧样本的新鲜叶片0.2-0.5g，加入液氮在研钵中研磨至粉末，然后使用上海生物工程技术有限公司的Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒提取待测香榧样本基因组DNA，用1％琼脂糖凝胶对所得DNA进行电泳以检测纯度，并利用美国赛默飞世尔公司的NanoDropTM 1000型超微量紫外分光光度计检测DNA浓度，然后稀释至20-50ng/μL，4度冰箱放置备用。
2.合成特异性分子标记引物
设计基于香榧雌雄性别差异序列的特异性分子标记引物，上游引物TGMI001-F：5’-GCCCAGGCATTCTGAAACA-3’和下游引物TGMI001-R：5’-CCCCGTCCCAAAAAACAAA-3’，由上海生物工程技术有限公司合成。
3.特异性分子标记引物(TGMI001-F/R)的PCR扩增
PCR扩增体系(总体积10μL)：10×PCR Buffer(含Mg2+)1μL，10mmol/L dNTPs 0.3μL，10μmol/L上游引物0.5μL，10μmol/L下游引物0.5μL，5U/μL Taq酶0.2μL，DNA模板(20ng/μL)1μL，ddH2O 6.5μL。
PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；32个循环(94℃变性40秒，退火温度59℃复性40秒，72℃延伸90秒)；最后72℃延伸10分钟。
4.电泳检测
取步骤(3)PCR扩增产物5～10μL，利用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳结果如图1所示。
按照上述方法，利用特异性分子标记TGMI001对香榧雌雄个体进行检测，电泳图见图1，其中编号为1～5的为雌性香榧个体，没有扩增出一条461bp的DNA条带；编号为6～10的雄性香榧个体，均扩增出一条461bp的DNA条带。这表明本发明的特异性分子标记TGMI001具有极高的专一性，因此可以用于香榧幼苗雌雄性别的早期快速鉴定。
序列表
<110> 杭州师范大学;桐庐县农业产业化办公室;景宁嘉树农业科技开发有限公司;桐庐翌鑫农业开发有限公司
<120> 用于香榧苗期性别鉴定的特异性分子标记TGMI001
<130> 1
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 1
gcccaggcat tctgaaaca 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 2
ccccgtccca aaaaacaaa 19
<210> 3
<211> 461
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 3
gcccaggcat tctgaaacag ggtgttttta attggagctt cacccaacct agaccagaac 60
tgattgagat tggaaacgtg cctgcaagga acattccacg ccctccacca caggtgccag 120
acttgaatag caaaagagca ttggaaaaag agatgggctc cagtttcctc actgttataa 180
cacaaagagc acatagaagg tccctgaaag cccctcctct ggagattgtc ccaggtgaga 240
catctcttgt gtgtgagcaa ccaaaggaaa aatttgcatt tgggccaagc ccatcgattc 300
caaatataca agagatatgt tatattatga agaggggtga actaagtttt ttaaaagatg 360
tcacgtcata atcttcatta ttagtgggta cattatcttg tcacacactt tgtagatgtt 420
agaggagtag ttgttgtttt gttttgtttt ttgggacggg g 461

Claims (5)

1.用于香榧苗期性别鉴定的特异性分子标记TGMI001，其特征在于该引物核苷酸序列如下：
上游引物TGMI001-F：5’-GCCCAGGCATTCTGAAACA-3’，如SEQ.ID No1所示；
下游引物TGMI001-R：5’-CCCCGTCCCAAAAAACAAA-3’，如SEQ.ID No2所示。
2.权利要求1所述的用于香榧苗期性别鉴定的特异性分子标记TGMI001在香榧苗期进行雌雄性别鉴定的应用。
3.一种利用如权利要求1所述的特异性分子标记进行香榧苗期性别鉴定的方法，其特征在于该方法首先提取待测香榧幼苗样本的基因组DNA为模板，利用如权利要求1所述的特异性分子标记TGMI001进行PCR扩增得到扩增产物；对得到的扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现一条461bp的DNA条带，则待测样本为雄性个体；若电泳结果未出现一条461bp的DNA条带，则待测样本为雌性个体。
4.如权利要求3所述的鉴别方法，其特征在于PCR扩增体系(总体积10μL)：10×PCRBuffer(含Mg2+)1μL，10mmol/L dNTPs 0.3μL，10μmol/L上游引物0.5μL，10μmol/L下游引物0.5μL，5U/μL Taq酶0.2μL，DNA模板(20ng/μL)1μL，ddH2O 6.5μL。
5.如权利要求3所述的鉴别方法，其特征在于PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；32个循环(94℃变性40秒，退火温度59℃复性40秒，72℃延伸90秒)；最后72℃延伸10分钟。
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