CN106434641A - 与大白菜紫色叶球基因BrPur连锁的分子标记 - Google Patents
与大白菜紫色叶球基因BrPur连锁的分子标记 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106434641A CN106434641A CN201610655453.7A CN201610655453A CN106434641A CN 106434641 A CN106434641 A CN 106434641A CN 201610655453 A CN201610655453 A CN 201610655453A CN 106434641 A CN106434641 A CN 106434641A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- purple
- sep
- chinese cabbage
- molecular labeling
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 235000010149 Brassica rapa subsp chinensis Nutrition 0.000 title claims abstract description 57
- 235000000536 Brassica rapa subsp pekinensis Nutrition 0.000 title claims abstract description 57
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 17
- 241000499436 Brassica rapa subsp. pekinensis Species 0.000 title claims abstract 11
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 title abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 29
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 24
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 claims 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 claims 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 claims 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 18
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 18
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 11
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 11
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 4
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 abstract 1
- 244000221633 Brassica rapa subsp chinensis Species 0.000 description 47
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 40
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 25
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 18
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000000463 material Substances 0.000 description 14
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 10
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 8
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 8
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 4
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium peroxydisulfate Substances [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 229940005654 nitrite ion Drugs 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 4
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 4
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 4
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 4
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000143437 Aciculosporium take Species 0.000 description 2
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 2
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 2
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- VAZSKTXWXKYQJF-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)OOS([O-])=O VAZSKTXWXKYQJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930014669 anthocyanidin Natural products 0.000 description 2
- 150000001452 anthocyanidin derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 235000008758 anthocyanidins Nutrition 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 239000005357 flat glass Substances 0.000 description 2
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 2
- 239000005337 ground glass Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000001426 native polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 2
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 2
- UDQVBNBCNDWBGY-UHFFFAOYSA-N oxalonitrile 1,2-xylene Chemical compound N#CC#N.CC1=C(C=CC=C1)C UDQVBNBCNDWBGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 1
- 235000011292 Brassica rapa Nutrition 0.000 description 1
- 240000008100 Brassica rapa Species 0.000 description 1
- 101100493713 Caenorhabditis elegans bath-45 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150064138 MAP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241001634432 Trillium ovatum Species 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 1
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 1
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 1
- 238000012214 genetic breeding Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 230000032696 parturition Effects 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Botany (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了与大白菜紫色叶球基因BrPur紧密连锁的SSR分子标记，该分子标记含有Sep ID NO.1和Sep ID NO.3所示的序列。本发明还公开该分子标记引物的筛选方法以及扩增方法。本发明的分子标记构建了大白菜紫色叶球基因BrPur的分子遗传图谱，有利于分子标记辅助紫色大白菜育种及BrPur基因的克隆；所述的分子标记引物B‑76和SSR14‑36与大白菜紫色叶球基因BrPur紧密连锁距离分别为1.1 cM和0.2 cM，具有检测方便，扩增稳定，重复性好和准确率高等优点。
Description
技术领域
本发明属于蔬菜育种及分子遗传学领域，具体涉及与大白菜紫色叶球基因BrPur连锁的分子标记，还涉及到扩增该分子标记的引物及在大白菜辅助育种中的应用。
背景技术
白菜 (Brassica rapa L.) 属十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种，是起源于我国的主要蔬菜作物之一，也是我国种植面积最大的蔬菜作物之一，同时还是世界三大油菜之一，与人们的日常生活密切相关。近年来，随着人们生活水平的提高，人们对大白菜品质的要求日益提高，而紫色大白菜花青素含量丰富，对于人类健康的营养价值极高，因此，紫色大白菜育种受到越来越多国内外学者和育种家的重视。
研究表明紫色大白菜类黄酮类次生代谢产物丰富，尤其是花青素含量较高，不仅有利于提高白菜类作物自身的抗逆能力，而且其具有抗癌、抗氧化及心血管疾病的功效，对于人类健康具有重要的营养价值，近年来受到国内外的广泛关注。但是，白菜叶球颜色需要在其结球期成熟后才能表现出，而且需要在田间切开叶球逐株观察，操作起来不仅对种质材料的破坏性极大，而且费时费力，极大的延缓了育种进程。因此为了加快紫色叶球大白菜的育种速度，利用现代的分子生物技术，进行分子标记辅助育种十分必要。
随着分子生物学技术的快速发展，多种基于DNA多态性的分子技术应运而生，并广泛应用于遗传育种研究的各个领域。简单序列重复（simple sequence repeats，SSR），又称为微卫星DNA（microsatellite，DNA），是一类由1 - 6个核苷酸串联重复组成的DNA序列如（CA）n，（ATG）n，（TAGG）n等重复，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置，由于重复次数的不同和重复程度的不完全造成了每个位点的多态性，包括SSR标记和EST-SSR标记两种类型。其中，SSR标记具有共显性、重复性好、多态性丰富、易于检测等优点，已广泛应用于植物遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等研究领域（Tautzand Schlötterer，1994；Powell et al.，1996）。
因此，基于以上SSR标记的优点，申请人利用大白菜的测序结果，开发并成功筛选出与大白菜叶球紫色基因BrPur紧密连锁的分子标记，并构建了BrPur基因的分子遗传图谱，为克隆该基因及利用该分子标记进行紫色叶球大白菜分子辅助育种，加快育种进程奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于，提供与大白菜叶球颜色基因BrPur紧密连锁的SSR分子标记。
本发明的还一个目的在于，提供可用于PCR扩增与大白菜叶球颜色基因BrPur紧密连锁的SSR分子标记的引物对，以及应用该分子标记引物，通过PCR方法，获得分子标记。以此在苗期即可鉴定区分紫色叶球大白菜和非紫色叶球大白菜，从而淘汰非目标植株，大大提高选择的效率。
为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：
本发明公开了与大白菜紫色叶球基因BrPur紧密连锁的SSR分子标记，所述分子标记Sep ID NO.1和Sep ID NO.3所示的序列。
本发明还公开了与大白菜紫色叶球基因BrPur连锁的SSR分子标记引物，已鉴定出的6对SSR引物，优选引物B-76（序列Sep ID NO.5、Sep ID NO.6）和引物SSR14-36（Sep IDNO.7、Sep ID NO.8）所示的序列，6对中的一对，即可将紫色叶球与非紫色叶球大白菜区分开，同时使用两个标记能提高选择的准确性。
[f1] 对SSR引物对的脱氧核糖核苷酸引物序列如下：
引物对B-31：
上游引物（F）：5＇－GGTCAAAACCTTTCAGAACTCCC－3＇；
下游引物（R）：5＇－AATCTTATCTTTTGGTTTGGTGCTG－3＇；
引物对B-51：
上游引物（F）：5＇－TGGATTTGGTTAGGTGGTCAGC－3＇
下游引物（R）：5＇－CATGCACTTTGGGTGGAGATAC－3＇
引物对B-76：
上游引物（F）：5＇－TGGAACGCAAATGAACCCTC－3＇
下游引物（R）：5＇－GATGGCAAAATTCACATAAGTTCAG－3＇
引物对SSR14-36：
上游引物（F）：5＇－TAAACCTAAAAATACATCTGCTTCC－3＇
下游引物（R）：5＇－TTTAACGTGAGAGCTTGAATGC－3＇
引物对SSR14：
上游引物（F）：5＇－CGAGTTGACCTGCGAACATTG－3＇
下游引物（R）：5＇－CGATTCCTTCATATTTGGTTTCAC－3＇
引物对SSR17：
上游引物（F）：5＇－CTCTCAATCCCTCAATCAAACC－3＇
下游引物（R）：5＇－AGGAGGCGTGCGGTTATG－3＇
本发明公开的分子标记，是由优选的引物对B-76（Sep ID NO.5、Sep ID NO.6）和引物对SSR14-36(Sep ID NO.7、Sep ID NO.8)经过PCR扩增获得的。
[A2]
采用上述与大白菜紫色叶球基因BrPur紧密连锁的SSR分子标记引物，通过DNA扩增在苗期即可鉴定区分紫色叶球和非紫色叶球大白菜，从而淘汰非目标植株，大大提高选择的效率。同时大白菜紫色叶球基因BrPur分子遗传图谱的构建可加快克隆该基因。
本发明首次获得了与大白菜紫色叶球基因BrPur最为紧密连锁的分子标记引物，具有检测方便，扩增稳定，重复性和准确率高等优点。其具体有益效果表现在：
（1）获得了在第7连锁群（A07）上大白菜紫色叶球基因BrPur的分子遗传图谱，且首次获得与BrPur基因紧密连锁的分子标记B-76和SSR14-36，可在紫色大白菜分子标记辅助育种及BrPur基因克隆中发挥重要的作用。
[A3] [A4]
（3）鉴定方便。这2个标记均为共显性标记，具有扩增稳定、检测方便、快速等优点。用这2个分子标记检测BrPur基因，可以确定BrPur的存在与否及存在的状态，进而快速筛选携有BrPur基因的植株，并用于紫色大白菜品种的选育。同时利用分子标记进行检测时还可以避免环境对品种的影响，提高选择的准确性。
（4）提高紫色大白菜的选择效率。在传统的紫色大白菜鉴定过程中，必须等到白菜结球期成熟后才能对叶球颜色性状进行观察统计，因此紫色大白菜的选育不仅费时费力，而且难度大，成本高，育种周期长。用本发明的分子标记引物，通过检查与大白菜紫色叶球基因BrPur紧密连锁的分子标记，可将表型鉴定的工作大大减少，在苗期即可区分紫色和非紫色叶球大白菜，从而淘汰非目标植株，因此，利用本发明的与BrPur基因紧密连锁的分子标记，不仅节约成本，而且大大的提高了育种效率，加快了育种进程。
（5）可用于克隆大白紫色叶球基因的研究。图位克隆大白菜紫色基因BrPur的前提在于获得与BrPur紧密连锁的分子标记。B-76和SSR14-36在所有已知的A07分子标记中是首次报道的位于BrPur两侧并且与之连锁最为紧密标记，这为克隆该基因提供了分子生物学基础和遗传学依据。
附图说明
图1是白菜紫色叶球基因BrPur的遗传连锁图，右侧为遗传连锁图的标记，左侧数据为标记间的遗传距离（cM）。
图2 是B-76在紫色和橙色亲本及F2代单株中的扩增结果；泳道信息：（从左到右）M，50 bp DNA ladder；5个纯合紫色单株；5个杂合紫色单株；6个纯合非紫色单株；P是紫色亲本；O是橙色亲本。
图3是SSR14-36在紫色和橙色亲本及F2代单株中的扩增结果；泳道信息：（从左到右）M，50 bp DNA ladder；P是紫色亲本；O是橙色亲本；5个纯合紫色单株；5个杂合紫色单株；5个纯合非紫色单株；。
图4是标记B-76的引物在亲本14S839和14S162间的扩增序列差异。B-76-14S839表示标记B-76的引物在亲本14S839中的扩增结果；B-76-14S162表示标记B-76的引物在亲本14S162中的扩增结果。
图5是标记SSR14-36的引物在亲本14S839和14S162间的扩增序列差异。SSR14-36-14S839表示标记SSR14-36的引物在亲本14S839中的扩增结果；SSR14-36-14S162表示标记SSR14-36的引物在亲本14S162中的扩增结果。
图6 P1、P2分别是紫色亲本材料14S839成熟期的叶球外观和紫色球叶性状；O1、O2分别是橙色亲本材料14S162成熟期的叶球外观和非紫色球叶性状。
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
以下实施例中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生化试剂。
本发明的与白菜紫色叶球基因BrPur紧密连锁的SSR分子标记引物是通过以下步骤获得的：
（1）群体材料准备
以紫色大白菜“14S839” （西北农林科技大学学报（自然科学版）2011（3）11：146-151）为父本，橙色大白菜“14S162”（秦白6号大白菜的亲本之一，陕西农业科学，1999 (3)，5-6）为母本杂交产生的F1群体，然后通过单株自交获得相应的F2群体。
（2）白菜单株基因组总DNA的提取
A、取0.2 g去掉主脉的新鲜嫩叶，塞入装有钢珠（钢珠需要由质量分数为75%的酒精清洗过）的2 mL的离心管中，放入液氮中速冻，利用组织研磨仪磨成粉末；
B、向离心管中加700 μL经65 ℃预热的CTAB提取液（CTAB：2％，Tris-HCl（pH 8.0）：100mmol/L，EDTA：20 mmol/L，NaCl：1.4 mol/L），再加入10 µL的β-巯基乙醇，迅速混匀；
C、随后将离心管放入65 ℃烘箱中，中间每间隔5-10 min分钟摇一次，温浴45 min；
D、取出离心管，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）的混合物，摇匀15 min后，常温下10000 r/min 离心10 min；
E、将上层液相（约700μL）转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿和异戊醇混合溶液（氯仿：异戊醇＝24：1），轻轻摇匀10 min，常温下10000 r/min离心10 min；
F、取上清（约500μL），加入2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30 min，4℃条件下8000 r/min离心5 min；
G、弃上清，加入500 μL质量百分数为75%的乙醇洗涤沉淀2次后，沉淀物室温晾干；
H、加入500 μL的无菌蒸馏水溶解DNA，加入0.29 μL的RNase A（10 µg/µl），混匀后稍离心，37 ℃保温30 min；
I、加入3 mol/L的NaAc溶液50 µL和2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20 ℃条件下沉淀30 min；
J、在4℃条件下，8000 r/min离心5 min，弃上清，加入质量百分数为75％的乙醇清洗沉淀1～2次后，沉淀物室温晾干，加入400～500 µL的灭菌ddH2O溶解使用，或加入质量百分数为75％的乙醇-20 ℃保存备用；
（3）SSR序列的获得
根据http://brassicadb.org/brad/index 中公布的已知引物，共选取大白菜10对染色体上已知的引物120对，利用亲本材料对120对引物进行筛选，共筛选出20对差异引物，然后选择紫色较深的F2单株和非紫色F2单株各10株，对这20对引物进行再次筛选，发现1对差异引物A710，随后继续选取A710引物两侧已知引物，发现了另一对差异引物A731。进一步沿A731到BrPur方向设计SSR引物。利用SSRHunter软件对该区间序列内的SSR位点进行检索，检索标准为：含二、三、四、五和六核苷酸类型的SSR基序（motif）的最小重复数分别为5，4，3，3和3次。将检索得到的含SSR位点的序列在芸薹属基因组网站（http://www.brassica.bbsrc.ac.uk/）进行同源性比对，SSR序列选取条件为比对相似性85%以上，同时有3条以上的同源序列与该序列存在SSR位点差异。
（4）SSR分子标记引物设计
根据SSR差异位点两端的序列，采用Primer 5.0 软件对符合条件的目标序列设计引物。设计引物参数原则：退火温度为50℃~70℃，最佳温度为57℃；引物长度18bp ~26bp；产物大小为100 bp ~300bp；引物（G+C）含量为40%~60%，引物不出现二级结构、发夹结构和二聚体。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，设计合成了SSR引物297对。
（5）多态性引物筛选和SSR分子标记分析
选用所设计的297对引物，将在紫色亲本和非紫色亲本间表现出相同多态性的引物重复分析3次，然后选择在F2群体中30株极端个体间进行多态性验证，如果扩增结果与在两亲本间扩增结果一致，则将确实存在多态性的引物用于F2代单株的SSR分析。最后根据连锁交换规律，结合单株基因型材料与田间对叶球颜色调查统计的结果，利用JoinMap4.0软件构建了大白菜紫色叶球基因BrPur的分子遗传连锁图1，获得了与BrPur紧密连锁的6个SSR标记，图1是白菜紫色叶球基因BrPur的遗传连锁图，右侧为遗传连锁图的标记，左侧数据为标记间的遗传距离（cM）。
6对SSR引物对的脱氧核糖核苷酸引物序列如下：
引物对B-31：
上游引物（F）：5＇－GGTCAAAACCTTTCAGAACTCCC－3＇；
下游引物（R）：5＇－AATCTTATCTTTTGGTTTGGTGCTG－3＇；
引物对B-51：
上游引物（F）：5＇－TGGATTTGGTTAGGTGGTCAGC－3＇
下游引物（R）：5＇－CATGCACTTTGGGTGGAGATAC－3＇
引物对B-76：
上游引物（F）：5＇－TGGAACGCAAATGAACCCTC－3＇
下游引物（R）：5＇－GATGGCAAAATTCACATAAGTTCAG－3＇
引物对SSR14-36：
上游引物（F）：5＇－TAAACCTAAAAATACATCTGCTTCC－3＇
下游引物（R）：5＇－TTTAACGTGAGAGCTTGAATGC－3＇
引物对SSR14：
上游引物（F）：5＇－CGAGTTGACCTGCGAACATTG－3＇
下游引物（R）：5＇－CGATTCCTTCATATTTGGTTTCAC－3＇
引物对SSR17：
上游引物（F）：5＇－CTCTCAATCCCTCAATCAAACC－3＇
下游引物（R）：5＇－AGGAGGCGTGCGGTTATG－3＇
所述的PCR扩增包括：20 μL PCR 反应体系为： 50ng/μL的模板 DNA 为2μL， 2×TaqMaster Mix 10μLM的上、下游引物各1μL，用无菌蒸馏水补充反应体系至20 μL；
PCR 反应程序为：
B-76引物：先94 ℃预变性5min；然后94 ℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共 30个循环；最后72℃再延伸10min，4℃保存。
SSR14-36引物：先94 ℃预变性5min；然后94 ℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共 30个循环；最后72℃再延伸10min，4℃保存。
以下是发明人给出的具体实施例。
实施例：SSR14-36引物的应用
（一）采用CTAB法提取大白菜基因组DNA，提取步骤如下所示：
A. 取0.2 g去掉主脉的新鲜嫩叶片，塞入装有钢珠（钢珠需要由质量分数为75%的酒精清洗过）的2 mL的离心管中，放入液氮中速冻，利用组织研磨仪磨成粉末；
B. 向离心管中加700 μL经65 ℃预热的CTAB提取液（CTAB：2％，Tris-HCl（pH 8.0）：100 mmol/L，EDTA：20 mmol/L，NaCl：1.4 mol/L），再加入8 µl的β-巯基乙醇，迅速混匀；
C. 随后将离心管放入65 ℃水浴中，中间每间隔5-10 min分钟摇一次，水浴45 min；
D. 取出离心管，加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物（酚：氯仿：异戊醇=25：24：1），摇匀15 min后，常温下10000 r/min离心10 min；
E. 将上层液相（约700 μL）转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿和异戊醇的混合物（氯仿：异戊醇=24：1），轻轻摇匀10 min，常温下10000 r/min离心10 min；
F. 取上清（约500 μL），加入2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30 min，4 ℃条件下8000 r/min离心5 min；
G. 弃上清，加入500 μL质量分数为75%的乙醇洗涤沉淀2次后，沉淀物室温晾干；
H. 加入500 μL的无菌蒸馏水溶解DNA，加入0.29 μL的RNaseA（10 µg/µL），混匀后离心，37 ℃保温30 min；
I.加入3 mol/L NaAc溶液50 µL和2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20 ℃条件下沉淀30 min；
J. 在4 ℃条件下，8000 r/min离心5 min，弃上清，加入质量分数为75％的乙醇清洗沉淀1～2次后，沉淀物室温晾干，加入400 -500 μL灭菌的ddH2O溶解使用，或加入质量百分数为75％乙醇-20℃保存备用；
（二）PCR扩增
用紫色亲本和非紫色亲本DNA作模板，按照下述PCR扩增条件和程序进行分析
PCR扩增条件：
20 μL PCR 反应体系为： 50ng/μL的模板 DNA 为2 μL，2×Taq Master Mix 10μL，10μ M的上、下游引物各1 μL，用无菌蒸馏水补充反应体系至20 μL；
② PCR反应程序为：先94 ℃预变性5 min；然后94 ℃变性30 s，53 ℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共 30个循环；最后72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。PCR反应在Bio-Rad S100096型PCR仪中进行。
（三）9%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
（1）9%非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备方法如下：
①玻璃板的清洗：用清水将玻璃板冲洗干净，再用无水乙醇冲洗并空置晾干，洗板时应将带有磨砂条的玻璃板和光滑玻璃板分开。
②装板：将带有磨砂条的玻璃板和光滑玻璃板两侧对齐，光滑玻璃板下侧突出插入到带有凹槽的橡皮封条中，利用1%的琼脂糖凝胶将磨砂玻璃板与橡皮封条之间的间隙封住，琼脂糖凝胶凝固后待用。
③灌胶：封底之后，取25 mL，9％的非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液，加250 μL浓度为10％的过硫酸氨（APS）和25 μL的TEMED，轻轻混匀，灌完后，将梳子插入适当位置，再将板调至水平，室温下胶板凝固30 min。
（2）电泳：
①点样：往胶槽内倒入适量1×TBE电泳缓冲液（中间槽的电泳液需要高于光滑玻璃板的高度，两侧液体高度10 cm以上），将梳子从胶板中轻轻地拔出，用移液器将梳孔中残余的凝胶和气泡清除干净，加入2 μL由SSR14-36引物扩增出的PCR扩增产物。
②电泳检测：接通电源，恒压180 V电泳检测，时间约为90 min，待二甲苯氰跑出胶底部，停止电泳。
③卸板：将电泳完毕的凝胶从玻璃板上剥离下来，该过程在水中进行，可以减少凝胶的损坏。
（3）银染步骤：
①冲洗：将电泳完毕的凝胶从玻璃板上剥离下来后，放入盛有蒸馏水的盘子里，轻晃5-6 s，倒掉，以洗去凝胶表面的残余电泳液；
②染色：将胶转入0.1 % 的硝酸银溶液中震荡染色8-10 min；
③水洗：将染完色的凝胶转入蒸馏水中漂洗2-3次，洗去凝胶表面的硝酸银残余；
④显色：将冲洗完毕的凝胶转入显色液（1.5% NaOH，0.4％甲醛）中显色至条带清楚显示；
⑤冲洗：将显色液倒掉，用自来水冲洗胶片2-3次；
⑥保存：将冲洗后的凝胶放在胶片观察灯上统计分析、照相，然后用保鲜膜封存，4 ℃可保存数月。
（四）结果判断
纯合紫色材料扩增出大约140bp的产物、纯合非紫色材料扩增出大约128bp的产物，杂合紫色材料扩增出共显性的产物见图3，图3是SSR14-36在紫色和橙色亲本及F2代单株中的扩增结果；泳道信息：（从左到右）M，50 bp DNA ladder；P是紫色亲本；O是橙色亲本；5个纯合紫色单株；5个杂合紫色单株；5个纯合非紫色单株。图5是标记SSR14-36的引物在亲本14S839和14S162间的扩增序列差异。SSR14-36-14S839表示标记SSR14-36的引物在亲本14S839中的扩增结果；SSR14-36-14S162表示标记SSR14-36的引物在亲本14S162中的扩增结果。
实施例：B-76引物的应用
（一）采用CTAB法提取大白菜基因组DNA，提取步骤如下所示：
A. 取0.2 g去掉主脉的新鲜嫩叶片，塞入装有钢珠（钢珠需要由质量分数为75%的酒精清洗过）的2 mL的离心管中，放入液氮中速冻，利用组织研磨仪磨成粉末；
B. 向离心管中加700 μL经65 ℃预热的CTAB提取液（CTAB：2％，Tris-HCl（pH 8.0）：100 mmol/L，EDTA：20 mmol/L，NaCl：1.4 mol/L），再加入8 μL的β-巯基乙醇，迅速混匀；
C. 随后将离心管放入65 ℃水浴中，中间每间隔5－10 min分钟摇一次，水浴45 min；
D. 取出离心管，加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物（酚：氯仿：异戊醇=25：24：1），摇匀15 min后，常温下10000 r/min离心10 min；
E. 将上层液相（约700 μL）转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿和异戊醇的混合物（氯仿：异戊醇=24：1），轻轻摇匀10 min，常温下10000 r/min离心10 min；
F. 取上清（约500 μL），加入2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20 ℃条件下沉淀30 min，4 ℃条件下8000 r/min离心5 min；
G. 弃上清，加入500 μL质量分数为75%的乙醇洗涤沉淀2次后，沉淀物室温晾干；
H. 加入500 μL的无菌蒸馏水溶解DNA，加入0.29 μL的RNaseA（10 µg/µL），混匀后离心，37 ℃保温30 min；
I.加入3 mol/L NaAc溶液50 µL和2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20 ℃条件下沉淀30 min；
J. 在4 ℃条件下，8000 r/min离心5 min，弃上清，加入质量分数为75％的乙醇清洗沉淀1～2次后，沉淀物室温晾干，加入400－500 μL灭菌的ddH2O溶解使用，或加入质量百分数为75％乙醇﹣20 ℃保存备用；
（二）PCR扩增
用紫色亲本和非紫色亲本DNA作模板，按照下述PCR扩增条件和程序进行分析
PCR扩增条件：
20 μL PCR 反应体系为： 50 ng/μL的模板 DNA 为2 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，10 μ M的上、下游引物各1 μL，用无菌蒸馏水补充反应体系至20 μL；
② PCR反应程序为：先94 ℃预变性5 min；然后94 ℃变性30 s，55 ℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共 30个循环；最后72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。PCR反应在Bio-Rad S100096型PCR仪中进行。
（三）9%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
（1）9%非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备方法如下：
①玻璃板的清洗：用清水将玻璃板冲洗干净，再用无水乙醇冲洗并空置晾干，洗板时应将带有磨砂条的玻璃板和光滑玻璃板分开。
②装板：将带有磨砂条的玻璃板和光滑玻璃板两侧对齐，光滑玻璃板下侧突出插入到带有凹槽的橡皮封条中，利用1%的琼脂糖凝胶将磨砂玻璃板与橡皮封条之间的间隙封住，琼脂糖凝胶凝固后待用。
③灌胶：封底之后，取25 mL，9％的非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液，加250 μL浓度为10％的过硫酸氨（APS）和25 μL的TEMED，轻轻混匀，灌完后，将梳子插入适当位置，再将板调至水平，室温下胶板凝固30 min。
（2）电泳：
①点样：往胶槽内倒入适量1×TBE电泳缓冲液（中间槽的电泳液需要高于光滑玻璃板的高度，两侧液体高度10 cm以上），将梳子从胶板中轻轻地拔出，用移液器将梳孔中残余的凝胶和气泡清除干净，加入2 μL由B-76引物扩增出的PCR扩增产物。
②电泳检测：接通电源，恒压180 V电泳检测，时间约为90 min，待二甲苯氰跑出胶底部，停止电泳。
③卸板：将电泳完毕的凝胶从玻璃板上剥离下来，该过程在水中进行，可以减少凝胶的损坏。
（3）银染步骤：
①冲洗：将电泳完毕的凝胶从玻璃板上剥离下来后，放入盛有蒸馏水的盘子里，轻晃5－6 s，倒掉，以洗去凝胶表面的残余电泳液；
②染色：将胶转入0.1 % 的硝酸银溶液中震荡染色8-10 min；
③水洗：将染完色的凝胶转入蒸馏水中漂洗2－3次，洗去凝胶表面的硝酸银残余；
④显色：将冲洗完毕的凝胶转入显色液（1.5% NaOH，0.4％甲醛）中显色至条带清楚显示；
⑤冲洗：将显色液倒掉，用自来水冲洗胶片2－3次；
⑥保存：将冲洗后的凝胶放在胶片观察灯上统计分析、照相，然后用保鲜膜封存，4 ℃可保存数月。
（四）结果判断
纯合紫色材料扩增出大约152bp的产物、纯合非紫色材料扩增出大约160bp的产物，杂合紫色材, 料扩增出共显性的产物见图2，图2是B-76在紫色和橙色亲本及F2代单株中的扩增结果；泳道信息：（从左到右）M，50 bp DNA ladder；5个纯合紫色单株；5个杂合紫色单株；6个纯合非紫色单株；P是紫色亲本；O是橙色亲本。图4是标记B-76的引物在亲本14S839和14S162间的扩增序列差异。B-76-14S839表示标记B-76的引物在亲本14S839中的扩增结果；B-76-14S162表示标记B-76的引物在亲本14S162中的扩增结果。
图6中的 P1、P2分别是紫色亲本材料14S839成熟期的叶球外观和叶球剖面；O1、O2分别是橙色亲本材料14S162成熟期的叶球外观和叶球剖面。
<110> 西北农林科技大学
<120> 与大白菜紫色叶球基因BrPur连锁的SSR分子标记扩增产物序列
<160> 16
<210> 1
<211> 152bp
<212> DNA
<213> B-76-14S839.sep
<400> 1
TGGAACGCAA ATGAACCCTC ATAGAACACT TTCGTTTTGA TTTTAGTTGA TAAAT 55
TTTCTCTTAG GATTAAATTT TGATATATAT ATATATATAT ATA....... .ACTT 102
TAATTGATCT TCTGATACGC TAAAACTGAA CTTATGTGAA TTTTGCCATC 152
<210> 2
<211> 160bp
<212> DNA
<213> B-76-14S162.sep
<400> 2
TGGAACGCAA ATGAACCCTC ATAGAACACT TTCGTTTTGA TTTTAGTTGA TAAAT 55
TTTCTCTTAG GATTAAATTT TGATATATAT ATATATATAT ATATATATAT AACTT 110
TAATTGATCT TCTGATACGC TAAAACTGAA CTTATGTGAA TTTTGCCATC 160
<210> 3
<211> 140bp
<212> DNA
<213> SSR14-36-14S839.sep
<400> 3
TAAACCTAAA AATACATCTG CTTCCATATA TATATATATA TATATATATA ACAAT 55
GATATACTAC ATTTTATCAA AATAAATTAA TAATCTATAT TAGTATTTAA AAAGT 110
AATTTTTCGC ATTCAAGCTC TCACGTTAAA 140
<210> 4
<211> 128bp
<212> DNA
<213> SSR14-36-14S162.sep
<400> 4
TAAACCTAAA AATACATCTG CTTCCATATA TATATGTA.. .......... ACAAT 43
GATATACT ACATTTTA TCAAAATA AATTAATA ATCTATAT TAGTATTT AAAAAGT 98
AATTTTTC GCATTCAA GCTCTCAC GTTAAA 128
<210> 5
<211> 20bp
<212> DNA
<213> 引物对B-76上游人工序列
<400> 5
TGGAACGCAA ATGAACCCTC 20
<210> 6
<211> 25bp
<212> DNA
<213> 引物对B-76下游人工序列
<400> 6
GATGGCAAAA TTCACATAAG TTCAG 25
<210> 7
<211> 25bp
<212> DNA
<213> 引物对SSR14-36上游人工序列
<400> 7
TAAACCTAAA AATACATCTG CTTCC 25
<210> 8
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 引物对SSR14-36上游人工序列
<400> 8
TTTAACGTGA GAGCTTGAAT GC 22
<210> 9
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 引物对B-31上游人工序列
<400> 9
GGTCAAAACC TTTCAGAACT CCC 23
<210> 10
<211> 25p
<212> DNA
<213> 引物对B-31下游人工序列
<400> 10
AATCTTATCT TTTGGTTTGG TGCTG 25
<210> 11
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 引物对B-51上游人工序列
<400> 11
TGGATTTGGT TAGGTGGTCA GC 22
<210> 12
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 引物对B-51下游人工序列
<400> 12
CATGCACTTT GGGTGGAGAT AC 22
<210> 13
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 引物对SSR14上游人工序列
<400> 13
CGAGTTGACC TGCGAACATT G 21
<210> 14
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 引物对SSR14下游人工序列
<400> 14
CGATTCCTTC ATATTTGGTT TCAC 24
<210> 15
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 引物对SSR17上游人工序列
<400> 15
CTCTCAATCC CTCAATCAAA CC 22
<210> 16
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 引物对SSR17下游人工序列
<400> 16
AGGAGGCGTG CGGTTATG 18
Claims (7)
1.与大白菜紫色叶球基因BrPur紧密连锁的分子标记，其特征在于：所述分子标记SepID NO.1和Sep ID NO.3所示的序列。
2.根据权利要求1所述的与大白菜紫色叶球基因紧密连锁的分子标记，其特征在于：所述分子标记Sep ID NO.1的上游引物为Sep ID NO.5所示的序列，下游引物为Sep ID NO.6所示的序列；
引物对B-76脱氧核糖核苷酸序列：
Sep ID NO.5（F）：5＇－TGGAACGCAAATGAACCCTC－3＇；
Sep ID NO.6（R）：5＇－GATGGCAAAATTCACATAAGTTCAG－3＇。
3.根据权利要求1所述的与大白菜紫色叶球基因紧密连锁的分子标记，其特征在于：所述分子标记Sep ID NO.3的上游引物为Sep ID NO.7所示的序列，下游引物为Sep ID NO.8所示的序列；
引物对SSR14-36脱氧核糖核苷酸序列：
Sep ID NO.7（F）：5＇－TAAACCTAAAAATACATCTGCTTCC－3＇；
Sep ID NO.8（R）：5＇－TTTAACGTGAGAGCTTGAATGC－3＇。
4.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于：分子标记Sep ID NO.1由权利要求2所述的引物对以紫色大白菜的基因组DNA为模板经PCR扩增得到。
5.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于：分子标记Sep ID NO.3由权利要求3所述的引物对以紫色大白菜的基因组DNA为模板经PCR扩增得到。
6.根据权利要求1所述的分子标记的检查方法，其特征在于,包括步骤：根据权利要求1的分子标记的核苷酸序列筛选引物，以紫色和非紫色亲本大白菜DNA为模板进行扩增，判断和筛选扩增产物中是否存在该分子标记。
7.根据权利要求6所述的检查方法，其特征在于：所述的引物为权利要求2或3所述的引物对。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610655453.7A CN106434641B (zh) | 2016-08-11 | 2016-08-11 | 与大白菜紫色叶球基因BrPur连锁的分子标记 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610655453.7A CN106434641B (zh) | 2016-08-11 | 2016-08-11 | 与大白菜紫色叶球基因BrPur连锁的分子标记 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106434641A true CN106434641A (zh) | 2017-02-22 |
| CN106434641B CN106434641B (zh) | 2022-06-14 |
Family
ID=58184446
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610655453.7A Expired - Fee Related CN106434641B (zh) | 2016-08-11 | 2016-08-11 | 与大白菜紫色叶球基因BrPur连锁的分子标记 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106434641B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110499381A (zh) * | 2018-05-17 | 2019-11-26 | 北京市农林科学院 | 白菜颜色分子标记及其在鉴定白菜植株颜色中的应用 |
| CN110894541A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-03-20 | 山西农业大学 | 一种紫菜薹花青素合成调控基因的功能性分子标记及应用 |
| CN113862392A (zh) * | 2021-11-15 | 2021-12-31 | 西北农林科技大学 | 大白菜黄子叶基因Bryc连锁的SSR分子标记引物及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104651497A (zh) * | 2015-01-21 | 2015-05-27 | 西北农林科技大学 | 与白菜黄色种皮基因Brsc-ye连锁的SSR分子标记引物及应用 |
| CN105506163A (zh) * | 2016-02-02 | 2016-04-20 | 北京市农林科学院 | 一种鉴定控制白菜紫色性状形成的snp分子标记及其应用 |
-
2016
- 2016-08-11 CN CN201610655453.7A patent/CN106434641B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104651497A (zh) * | 2015-01-21 | 2015-05-27 | 西北农林科技大学 | 与白菜黄色种皮基因Brsc-ye连锁的SSR分子标记引物及应用 |
| CN105506163A (zh) * | 2016-02-02 | 2016-04-20 | 北京市农林科学院 | 一种鉴定控制白菜紫色性状形成的snp分子标记及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| WANG W等: "Mapping the BrPur gene for purple leaf color on linkage group A03 of Brassica rapa", 《EUPHYTICA》 * |
| 吴俊清: "紫心大白菜遗传规律分析及紫色基因精细定位", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)农业科技辑》 * |
| 吴俊清等: "大白菜紫心性状遗传规律分析及其基因初步定位", 《园艺学报》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110499381A (zh) * | 2018-05-17 | 2019-11-26 | 北京市农林科学院 | 白菜颜色分子标记及其在鉴定白菜植株颜色中的应用 |
| CN110499381B (zh) * | 2018-05-17 | 2022-09-06 | 北京市农林科学院 | 白菜颜色分子标记及其在鉴定白菜植株颜色中的应用 |
| CN110894541A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-03-20 | 山西农业大学 | 一种紫菜薹花青素合成调控基因的功能性分子标记及应用 |
| CN110894541B (zh) * | 2019-12-27 | 2022-05-17 | 山西农业大学 | 基于分子标记的花青素合成调控基因的功能性鉴定系统及应用 |
| CN113862392A (zh) * | 2021-11-15 | 2021-12-31 | 西北农林科技大学 | 大白菜黄子叶基因Bryc连锁的SSR分子标记引物及其应用 |
| NL2033088B1 (en) * | 2021-11-15 | 2023-06-09 | Univ Northwest A&F | Simple sequence repeat (ssr) molecular marker primers linked with yellow cotyledon gene bryc in chinese cabbage and use thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106434641B (zh) | 2022-06-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104059971B (zh) | 一种芸薹属异源六倍体的ssr分子标记方法及其引物 | |
| CN105349671B (zh) | 适于清溪乌鳖群体分析的微卫星序列及筛选方法 | |
| CN107012243A (zh) | 一种鉴定荔枝真杂种的分子标记及其应用 | |
| CN102140506B (zh) | 与甜瓜抗蔓枯病基因Gsb-2连锁的分子标记及其应用 | |
| CN106434641A (zh) | 与大白菜紫色叶球基因BrPur连锁的分子标记 | |
| CN105802962B (zh) | 分子标记及其应用 | |
| CN106434944A (zh) | 与桃抗蚜基因紧密连锁的snp分子标记的应用 | |
| CN105803094B (zh) | 一种鉴定或辅助鉴定马铃薯熟性的scar标记及其应用 | |
| Lazarević et al. | Genetic variability in Balkan paleoendemic resurrection plants Ramonda serbica and R. nathaliae across their range and in the zone of sympatry | |
| CN104651497B (zh) | 与白菜黄色种皮基因Brsc‑ye连锁的SSR分子标记引物及应用 | |
| CN105802961B (zh) | 分子标记及其应用 | |
| CN102226189B (zh) | 一种油菜每角粒数性状主效基因位点及应用 | |
| CN103184280A (zh) | 鉴别或辅助鉴别花脸蘑原生质体单核体交配型的方法及其专用引物对is-818 | |
| CN106350606B (zh) | 一种用于日本沼虾生长性状分析的微卫星标记及其应用 | |
| CN102599047A (zh) | 一种分子标记辅助回交提高小麦抗赤霉病扩展的方法 | |
| CN105734145A (zh) | 一种草莓花青素调节基因功能标记 | |
| CN105734057B (zh) | 与甜瓜霜霉病抗性主效qtl连锁的ssr标记及其应用 | |
| CN107574258A (zh) | 与黄瓜果实软刺基因Ts共分离的InDel‑Ts2分子标记及其应用 | |
| CN105063201A (zh) | 玉米第9号染色体穗行数主效qtl的分子标记及其应用 | |
| CN105821135B (zh) | 与甜瓜抗霜霉病基因紧密连锁的分子标记及应用 | |
| CN113249442B (zh) | 一种筛查牡蛎不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因的方法 | |
| CN103184281A (zh) | 鉴别或辅助鉴别花脸蘑原生质体单核体交配型的方法及其专用引物对is-873 | |
| CN112575101B (zh) | 与西葫芦prsv-w病毒病抗性相关的分子标记及其应用 | |
| CN107022628A (zh) | 一种鉴定早、晚花荔枝杂交后代真杂种的分子标记 | |
| CN103184282A (zh) | 鉴别或辅助鉴别花脸蘑原生质体单核体交配型的方法及其专用引物对sr-5×13 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20220614 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |