CN106434641B - 与大白菜紫色叶球基因BrPur连锁的分子标记 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了与大白菜紫色叶球基因BrPur紧密连锁的SSR分子标记，该分子标记含有Sep ID NO.1和Sep ID NO.3所示的序列。本发明还公开该分子标记引物的筛选方法以及扩增方法。本发明的分子标记构建了大白菜紫色叶球基因BrPur的分子遗传图谱，有利于分子标记辅助紫色大白菜育种及BrPur基因的克隆；所述的分子标记引物B‑76和SSR14‑36与大白菜紫色叶球基因BrPur紧密连锁距离分别为1.1 cM和0.2 cM，具有检测方便，扩增稳定，重复性好和准确率高等优点。
Description
技术领域
本发明属于蔬菜育种及分子遗传学领域，具体涉及与大白菜紫色叶球基因BrPur连锁的分子标记，还涉及到扩增该分子标记的引物及在大白菜辅助育种中的应用。
背景技术
白菜 (Brassica rapa L.) 属十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种，是起源于我国的主要蔬菜作物之一，也是我国种植面积最大的蔬菜作物之一，同时还是世界三大油菜之一，与人们的日常生活密切相关。近年来，随着人们生活水平的提高，人们对大白菜品质的要求日益提高，而紫色大白菜花青素含量丰富，对于人类健康的营养价值极高，因此，紫色大白菜育种受到越来越多国内外学者和育种家的重视。
研究表明紫色大白菜类黄酮类次生代谢产物丰富，尤其是花青素含量较高，不仅有利于提高白菜类作物自身的抗逆能力，而且其具有抗癌、抗氧化及心血管疾病的功效，对于人类健康具有重要的营养价值，近年来受到国内外的广泛关注。但是，白菜叶球颜色需要在其结球期成熟后才能表现出，而且需要在田间切开叶球逐株观察，操作起来不仅对种质材料的破坏性极大，而且费时费力，极大的延缓了育种进程。因此为了加快紫色叶球大白菜的育种速度，利用现代的分子生物技术，进行分子标记辅助育种十分必要。
随着分子生物学技术的快速发展，多种基于DNA多态性的分子技术应运而生，并广泛应用于遗传育种研究的各个领域。简单序列重复（simple sequence repeats，SSR），又称为微卫星DNA（microsatellite，DNA），是一类由1 - 6个核苷酸串联重复组成的DNA序列如（CA）n，（ATG）n，（TAGG）n等重复，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置，由于重复次数的不同和重复程度的不完全造成了每个位点的多态性，包括SSR标记和EST-SSR标记两种类型。其中，SSR标记具有共显性、重复性好、多态性丰富、易于检测等优点，已广泛应用于植物遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等研究领域（Tautzand Schlötterer，1994；Powell et al.，1996）。
因此，基于以上SSR标记的优点，申请人利用大白菜的测序结果，开发并成功筛选出与大白菜叶球紫色基因BrPur紧密连锁的分子标记，并构建了BrPur基因的分子遗传图谱，为克隆该基因及利用该分子标记进行紫色叶球大白菜分子辅助育种，加快育种进程奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于，提供与大白菜叶球颜色基因BrPur紧密连锁的SSR分子标记。
本发明的还一个目的在于，提供可用于PCR扩增与大白菜叶球颜色基因BrPur紧密连锁的SSR分子标记的引物对，以及应用该分子标记引物，通过PCR方法，获得分子标记。以此在苗期即可鉴定区分紫色叶球大白菜和非紫色叶球大白菜，从而淘汰非目标植株，大大提高选择的效率。
为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：
本发明公开了与大白菜紫色叶球基因BrPur紧密连锁的SSR分子标记，所述分子标记Sep ID NO.1和Sep ID NO.3所示的序列。
本发明还公开了与大白菜紫色叶球基因BrPur连锁的SSR分子标记引物，已鉴定出的6对SSR引物，优选引物B-76（序列Sep ID NO.5、Sep ID NO.6）和引物SSR14-36（Sep IDNO.7、Sep ID NO.8）所示的序列，6对中的一对，即可将紫色叶球与非紫色叶球大白菜区分开，同时使用两个标记能提高选择的准确性。
[f1] 对SSR引物对的脱氧核糖核苷酸引物序列如下：
引物对B-31：
上游引物（F）：5＇－GGTCAAAACCTTTCAGAACTCCC－3＇；
下游引物（R）：5＇－AATCTTATCTTTTGGTTTGGTGCTG－3＇；
引物对B-51：
上游引物（F）：5＇－TGGATTTGGTTAGGTGGTCAGC－3＇
下游引物（R）：5＇－CATGCACTTTGGGTGGAGATAC－3＇
引物对B-76：
上游引物（F）：5＇－TGGAACGCAAATGAACCCTC－3＇
下游引物（R）：5＇－GATGGCAAAATTCACATAAGTTCAG－3＇
引物对SSR14-36：
上游引物（F）：5＇－TAAACCTAAAAATACATCTGCTTCC－3＇
下游引物（R）：5＇－TTTAACGTGAGAGCTTGAATGC－3＇
引物对SSR14：
上游引物（F）：5＇－CGAGTTGACCTGCGAACATTG－3＇
下游引物（R）：5＇－CGATTCCTTCATATTTGGTTTCAC－3＇
引物对SSR17：
上游引物（F）：5＇－CTCTCAATCCCTCAATCAAACC－3＇
下游引物（R）：5＇－AGGAGGCGTGCGGTTATG－3＇
本发明公开的分子标记，是由优选的引物对B-76（Sep ID NO.5、Sep ID NO.6）和引物对SSR14-36(Sep ID NO.7、Sep ID NO.8)经过PCR扩增获得的。
[A2]
采用上述与大白菜紫色叶球基因BrPur紧密连锁的SSR分子标记引物，通过DNA扩增在苗期即可鉴定区分紫色叶球和非紫色叶球大白菜，从而淘汰非目标植株，大大提高选择的效率。同时大白菜紫色叶球基因BrPur分子遗传图谱的构建可加快克隆该基因。
本发明首次获得了与大白菜紫色叶球基因BrPur最为紧密连锁的分子标记引物，具有检测方便，扩增稳定，重复性和准确率高等优点。其具体有益效果表现在：
（1）获得了在第7连锁群（A07）上大白菜紫色叶球基因BrPur的分子遗传图谱，且首次获得与BrPur基因紧密连锁的分子标记B-76和SSR14-36，可在紫色大白菜分子标记辅助育种及BrPur基因克隆中发挥重要的作用。
[A3] [A4]
（3）鉴定方便。这2个标记均为共显性标记，具有扩增稳定、检测方便、快速等优点。用这2个分子标记检测BrPur基因，可以确定BrPur的存在与否及存在的状态，进而快速筛选携有BrPur基因的植株，并用于紫色大白菜品种的选育。同时利用分子标记进行检测时还可以避免环境对品种的影响，提高选择的准确性。
（4）提高紫色大白菜的选择效率。在传统的紫色大白菜鉴定过程中，必须等到白菜结球期成熟后才能对叶球颜色性状进行观察统计，因此紫色大白菜的选育不仅费时费力，而且难度大，成本高，育种周期长。用本发明的分子标记引物，通过检查与大白菜紫色叶球基因BrPur紧密连锁的分子标记，可将表型鉴定的工作大大减少，在苗期即可区分紫色和非紫色叶球大白菜，从而淘汰非目标植株，因此，利用本发明的与BrPur基因紧密连锁的分子标记，不仅节约成本，而且大大的提高了育种效率，加快了育种进程。
（5）可用于克隆大白紫色叶球基因的研究。图位克隆大白菜紫色基因BrPur的前提在于获得与BrPur紧密连锁的分子标记。B-76和SSR14-36在所有已知的A07分子标记中是首次报道的位于BrPur两侧并且与之连锁最为紧密标记，这为克隆该基因提供了分子生物学基础和遗传学依据。
附图说明
图1是白菜紫色叶球基因BrPur的遗传连锁图，右侧为遗传连锁图的标记，左侧数据为标记间的遗传距离（cM）。
图2 是B-76在紫色和橙色亲本及F2代单株中的扩增结果；泳道信息：（从左到右）M，50 bp DNA ladder；5个纯合紫色单株；5个杂合紫色单株；6个纯合非紫色单株；P是紫色亲本；O是橙色亲本。
图3是SSR14-36在紫色和橙色亲本及F2代单株中的扩增结果；泳道信息：（从左到右）M，50 bp DNA ladder；P是紫色亲本；O是橙色亲本；5个纯合紫色单株；5个杂合紫色单株；5个纯合非紫色单株；。
图4是标记B-76的引物在亲本14S839和14S162间的扩增序列差异。B-76-14S839表示标记B-76的引物在亲本14S839中的扩增结果；B-76-14S162表示标记B-76的引物在亲本14S162中的扩增结果。
图5是标记SSR14-36的引物在亲本14S839和14S162间的扩增序列差异。SSR14-36-14S839表示标记SSR14-36的引物在亲本14S839中的扩增结果；SSR14-36-14S162表示标记SSR14-36的引物在亲本14S162中的扩增结果。
图6 P1、P2分别是紫色亲本材料14S839成熟期的叶球外观和紫色球叶性状；O1、O2分别是橙色亲本材料14S162成熟期的叶球外观和非紫色球叶性状。
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
以下实施例中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生化试剂。
本发明的与白菜紫色叶球基因BrPur紧密连锁的SSR分子标记引物是通过以下步骤获得的：
（1）群体材料准备
以紫色大白菜“14S839” （西北农林科技大学学报（自然科学版）2011（3）11：146-151）为父本，橙色大白菜“14S162”（秦白6号大白菜的亲本之一，陕西农业科学，1999 (3)，5-6）为母本杂交产生的F1群体，然后通过单株自交获得相应的F2群体。
（2）白菜单株基因组总DNA的提取
A、取0.2 g去掉主脉的新鲜嫩叶，塞入装有钢珠（钢珠需要由质量分数为75%的酒精清洗过）的2 mL的离心管中，放入液氮中速冻，利用组织研磨仪磨成粉末；
B、向离心管中加700 μL经65 ℃预热的CTAB提取液（CTAB：2％，Tris-HCl（pH8.0）：100 mmol/L，EDTA：20 mmol/L，NaCl：1.4 mol/L），再加入10 µL的β-巯基乙醇，迅速混匀；
C、随后将离心管放入65 ℃烘箱中，中间每间隔5-10 min分钟摇一次，温浴45min；
D、取出离心管，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）的混合物，摇匀15 min后，常温下10000 r/min 离心10 min；
E、将上层液相（约700μL）转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿和异戊醇混合溶液（氯仿：异戊醇＝24：1），轻轻摇匀10 min，常温下10000 r/min离心10 min；
F、取上清（约500μL），加入2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30 min，4℃条件下8000 r/min离心5 min；
G、弃上清，加入500 μL质量百分数为75%的乙醇洗涤沉淀2次后，沉淀物室温晾干；
H、加入500 μL的无菌蒸馏水溶解DNA，加入0.29 μL的RNase A（10 µg/µl），混匀后稍离心，37 ℃保温30 min；
I、加入3 mol/L的NaAc溶液50 µL和2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20 ℃条件下沉淀30 min；
J、在4℃条件下，8000 r/min离心5 min，弃上清，加入质量百分数为75％的乙醇清洗沉淀1～2次后，沉淀物室温晾干，加入400～500 µL的灭菌ddH2O溶解使用，或加入质量百分数为75％的乙醇-20 ℃保存备用；
（3）SSR序列的获得
根据http://brassicadb.org/brad/index 中公布的已知引物，共选取大白菜10对染色体上已知的引物120对，利用亲本材料对120对引物进行筛选，共筛选出20对差异引物，然后选择紫色较深的F2单株和非紫色F2单株各10株，对这20对引物进行再次筛选，发现1对差异引物A710，随后继续选取A710引物两侧已知引物，发现了另一对差异引物A731。进一步沿A731到BrPur方向设计SSR引物。利用SSRHunter软件对该区间序列内的SSR位点进行检索，检索标准为：含二、三、四、五和六核苷酸类型的SSR基序（motif）的最小重复数分别为5，4，3，3和3次。将检索得到的含SSR位点的序列在芸薹属基因组网站（http://www.brassica.bbsrc.ac.uk/）进行同源性比对，SSR序列选取条件为比对相似性85%以上，同时有3条以上的同源序列与该序列存在SSR位点差异。
（4）SSR分子标记引物设计
根据SSR差异位点两端的序列，采用Primer 5.0 软件对符合条件的目标序列设计引物。设计引物参数原则：退火温度为50℃~70℃，最佳温度为57℃；引物长度18bp ~26bp；产物大小为100 bp ~300bp；引物（G+C）含量为40%~60%，引物不出现二级结构、发夹结构和二聚体。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，设计合成了SSR引物297对。
（5）多态性引物筛选和SSR分子标记分析
选用所设计的297对引物，将在紫色亲本和非紫色亲本间表现出相同多态性的引物重复分析3次，然后选择在F2群体中30株极端个体间进行多态性验证，如果扩增结果与在两亲本间扩增结果一致，则将确实存在多态性的引物用于F2代单株的SSR分析。最后根据连锁交换规律，结合单株基因型材料与田间对叶球颜色调查统计的结果，利用JoinMap4.0软件构建了大白菜紫色叶球基因BrPur的分子遗传连锁图1，获得了与BrPur紧密连锁的6个SSR标记，图1是白菜紫色叶球基因BrPur的遗传连锁图，右侧为遗传连锁图的标记，左侧数据为标记间的遗传距离（cM）。
6对SSR引物对的脱氧核糖核苷酸引物序列如下：
引物对B-31：
上游引物（F）：5＇－GGTCAAAACCTTTCAGAACTCCC－3＇；
下游引物（R）：5＇－AATCTTATCTTTTGGTTTGGTGCTG－3＇；
引物对B-51：
上游引物（F）：5＇－TGGATTTGGTTAGGTGGTCAGC－3＇
下游引物（R）：5＇－CATGCACTTTGGGTGGAGATAC－3＇
引物对B-76：
上游引物（F）：5＇－TGGAACGCAAATGAACCCTC－3＇
下游引物（R）：5＇－GATGGCAAAATTCACATAAGTTCAG－3＇
引物对SSR14-36：
上游引物（F）：5＇－TAAACCTAAAAATACATCTGCTTCC－3＇
下游引物（R）：5＇－TTTAACGTGAGAGCTTGAATGC－3＇
引物对SSR14：
上游引物（F）：5＇－CGAGTTGACCTGCGAACATTG－3＇
下游引物（R）：5＇－CGATTCCTTCATATTTGGTTTCAC－3＇
引物对SSR17：
上游引物（F）：5＇－CTCTCAATCCCTCAATCAAACC－3＇
下游引物（R）：5＇－AGGAGGCGTGCGGTTATG－3＇
所述的PCR扩增包括：20 μL PCR 反应体系为： 50ng/μL的模板 DNA 为2μL， 2×Taq Master Mix 10μLM的上、下游引物各1μL，用无菌蒸馏水补充反应体系至20 μL；
PCR 反应程序为：
B-76引物：先94 ℃预变性5min；然后94 ℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共 30个循环；最后72℃再延伸10min，4℃保存。
SSR14-36引物：先94 ℃预变性5min；然后94 ℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共 30个循环；最后72℃再延伸10min，4℃保存。
以下是发明人给出的具体实施例。
实施例：SSR14-36引物的应用
（一）采用CTAB法提取大白菜基因组DNA，提取步骤如下所示：
A. 取0.2 g去掉主脉的新鲜嫩叶片，塞入装有钢珠（钢珠需要由质量分数为75%的酒精清洗过）的2 mL的离心管中，放入液氮中速冻，利用组织研磨仪磨成粉末；
B. 向离心管中加700 μL经65 ℃预热的CTAB提取液（CTAB：2％，Tris-HCl（pH8.0）：100 mmol/L，EDTA：20 mmol/L，NaCl：1.4 mol/L），再加入8 µl的β-巯基乙醇，迅速混匀；
C. 随后将离心管放入65 ℃水浴中，中间每间隔5-10 min分钟摇一次，水浴45min；
D. 取出离心管，加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物（酚：氯仿：异戊醇=25：24：1），摇匀15 min后，常温下10000 r/min离心10 min；
E. 将上层液相（约700 μL）转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿和异戊醇的混合物（氯仿：异戊醇=24：1），轻轻摇匀10 min，常温下10000 r/min离心10 min；
F. 取上清（约500 μL），加入2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30 min，4 ℃条件下8000 r/min离心5 min；
G. 弃上清，加入500 μL质量分数为75%的乙醇洗涤沉淀2次后，沉淀物室温晾干；
H. 加入500 μL的无菌蒸馏水溶解DNA，加入0.29 μL的RNaseA（10 µg/µL），混匀后离心，37 ℃保温30 min；
I.加入3 mol/L NaAc溶液50 µL和2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20 ℃条件下沉淀30 min；
J. 在4 ℃条件下，8000 r/min离心5 min，弃上清，加入质量分数为75％的乙醇清洗沉淀1～2次后，沉淀物室温晾干，加入400 -500 μL灭菌的ddH2O溶解使用，或加入质量百分数为75％乙醇-20℃保存备用；
（二）PCR扩增
用紫色亲本和非紫色亲本DNA作模板，按照下述PCR扩增条件和程序进行分析
20 μL PCR 反应体系为： 50ng/μL的模板 DNA 为2 μL，2×Taq Master Mix 10μL，10 μ M的上、下游引物各1 μL，用无菌蒸馏水补充反应体系至20 μL；
② PCR反应程序为：先94 ℃预变性5 min；然后94 ℃变性30 s，53 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共 30个循环；最后72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。PCR反应在Bio-RadS1000 96型PCR仪中进行。
（三）9%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
（1）9%非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备方法如下：
①玻璃板的清洗：用清水将玻璃板冲洗干净，再用无水乙醇冲洗并空置晾干，洗板时应将带有磨砂条的玻璃板和光滑玻璃板分开。
②装板：将带有磨砂条的玻璃板和光滑玻璃板两侧对齐，光滑玻璃板下侧突出插入到带有凹槽的橡皮封条中，利用1%的琼脂糖凝胶将磨砂玻璃板与橡皮封条之间的间隙封住，琼脂糖凝胶凝固后待用。
③灌胶：封底之后，取25 mL，9％的非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液，加250 μL浓度为10％的过硫酸氨（APS）和25 μL的TEMED，轻轻混匀，灌完后，将梳子插入适当位置，再将板调至水平，室温下胶板凝固30 min。
（2）电泳：
①点样：往胶槽内倒入适量1×TBE电泳缓冲液（中间槽的电泳液需要高于光滑玻璃板的高度，两侧液体高度10 cm以上），将梳子从胶板中轻轻地拔出，用移液器将梳孔中残余的凝胶和气泡清除干净，加入2 μL由SSR14-36引物扩增出的PCR扩增产物。
②电泳检测：接通电源，恒压180 V电泳检测，时间约为90 min，待二甲苯氰跑出胶底部，停止电泳。
③卸板：将电泳完毕的凝胶从玻璃板上剥离下来，该过程在水中进行，可以减少凝胶的损坏。
（3）银染步骤：
①冲洗：将电泳完毕的凝胶从玻璃板上剥离下来后，放入盛有蒸馏水的盘子里，轻晃5-6 s，倒掉，以洗去凝胶表面的残余电泳液；
②染色：将胶转入0.1 % 的硝酸银溶液中震荡染色8-10 min；
③水洗：将染完色的凝胶转入蒸馏水中漂洗2-3次，洗去凝胶表面的硝酸银残余；
④显色：将冲洗完毕的凝胶转入显色液（1.5% NaOH，0.4％甲醛）中显色至条带清楚显示；
⑤冲洗：将显色液倒掉，用自来水冲洗胶片2-3次；
⑥保存：将冲洗后的凝胶放在胶片观察灯上统计分析、照相，然后用保鲜膜封存，4℃可保存数月。
（四）结果判断
纯合紫色材料扩增出大约140bp的产物、纯合非紫色材料扩增出大约128bp的产物，杂合紫色材料扩增出共显性的产物见图3，图3是SSR14-36在紫色和橙色亲本及F2代单株中的扩增结果；泳道信息：（从左到右）M，50 bp DNA ladder；P是紫色亲本；O是橙色亲本；5个纯合紫色单株；5个杂合紫色单株；5个纯合非紫色单株。图5是标记SSR14-36的引物在亲本14S839和14S162间的扩增序列差异。SSR14-36-14S839表示标记SSR14-36的引物在亲本14S839中的扩增结果；SSR14-36-14S162表示标记SSR14-36的引物在亲本14S162中的扩增结果。
实施例：B-76引物的应用
（一）采用CTAB法提取大白菜基因组DNA，提取步骤如下所示：
A. 取0.2 g去掉主脉的新鲜嫩叶片，塞入装有钢珠（钢珠需要由质量分数为75%的酒精清洗过）的2 mL的离心管中，放入液氮中速冻，利用组织研磨仪磨成粉末；
B. 向离心管中加700 μL经65 ℃预热的CTAB提取液（CTAB：2％，Tris-HCl（pH8.0）：100 mmol/L，EDTA：20 mmol/L，NaCl：1.4 mol/L），再加入8 μL的β-巯基乙醇，迅速混匀；
C. 随后将离心管放入65 ℃水浴中，中间每间隔5－10 min分钟摇一次，水浴45min；
D. 取出离心管，加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物（酚：氯仿：异戊醇=25：24：1），摇匀15 min后，常温下10000 r/min离心10 min；
E. 将上层液相（约700 μL）转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿和异戊醇的混合物（氯仿：异戊醇=24：1），轻轻摇匀10 min，常温下10000 r/min离心10 min；
F. 取上清（约500 μL），加入2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30 min，4 ℃条件下8000 r/min离心5 min；
G. 弃上清，加入500 μL质量分数为75%的乙醇洗涤沉淀2次后，沉淀物室温晾干；
H. 加入500 μL的无菌蒸馏水溶解DNA，加入0.29 μL的RNaseA（10 µg/µL），混匀后离心，37 ℃保温30 min；
I.加入3 mol/L NaAc溶液50 µL和2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20 ℃条件下沉淀30 min；
J. 在4 ℃条件下，8000 r/min离心5 min，弃上清，加入质量分数为75％的乙醇清洗沉淀1～2次后，沉淀物室温晾干，加入400－500 μL灭菌的ddH2O溶解使用，或加入质量百分数为75％乙醇﹣20 ℃保存备用；
（二）PCR扩增
用紫色亲本和非紫色亲本DNA作模板，按照下述PCR扩增条件和程序进行分析
20 μL PCR 反应体系为： 50 ng/μL的模板 DNA 为2 μL，2×Taq Master Mix 10μL，10 μ M的上、下游引物各1 μL，用无菌蒸馏水补充反应体系至20 μL；
② PCR反应程序为：先94 ℃预变性5 min；然后94 ℃变性30 s，55 ℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共 30个循环；最后72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。PCR反应在Bio-RadS1000 96型PCR仪中进行。
（三）9%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
（1）9%非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备方法如下：
①玻璃板的清洗：用清水将玻璃板冲洗干净，再用无水乙醇冲洗并空置晾干，洗板时应将带有磨砂条的玻璃板和光滑玻璃板分开。
②装板：将带有磨砂条的玻璃板和光滑玻璃板两侧对齐，光滑玻璃板下侧突出插入到带有凹槽的橡皮封条中，利用1%的琼脂糖凝胶将磨砂玻璃板与橡皮封条之间的间隙封住，琼脂糖凝胶凝固后待用。
③灌胶：封底之后，取25 mL，9％的非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液，加250 μL浓度为10％的过硫酸氨（APS）和25 μL的TEMED，轻轻混匀，灌完后，将梳子插入适当位置，再将板调至水平，室温下胶板凝固30 min。
（2）电泳：
①点样：往胶槽内倒入适量1×TBE电泳缓冲液（中间槽的电泳液需要高于光滑玻璃板的高度，两侧液体高度10 cm以上），将梳子从胶板中轻轻地拔出，用移液器将梳孔中残余的凝胶和气泡清除干净，加入2 μL由B-76引物扩增出的PCR扩增产物。
②电泳检测：接通电源，恒压180 V电泳检测，时间约为90 min，待二甲苯氰跑出胶底部，停止电泳。
③卸板：将电泳完毕的凝胶从玻璃板上剥离下来，该过程在水中进行，可以减少凝胶的损坏。
（3）银染步骤：
①冲洗：将电泳完毕的凝胶从玻璃板上剥离下来后，放入盛有蒸馏水的盘子里，轻晃5－6 s，倒掉，以洗去凝胶表面的残余电泳液；
②染色：将胶转入0.1 % 的硝酸银溶液中震荡染色8-10 min；
③水洗：将染完色的凝胶转入蒸馏水中漂洗2－3次，洗去凝胶表面的硝酸银残余；
④显色：将冲洗完毕的凝胶转入显色液（1.5% NaOH，0.4％甲醛）中显色至条带清楚显示；
⑤冲洗：将显色液倒掉，用自来水冲洗胶片2－3次；
⑥保存：将冲洗后的凝胶放在胶片观察灯上统计分析、照相，然后用保鲜膜封存，4℃可保存数月。
（四）结果判断
纯合紫色材料扩增出大约152bp的产物、纯合非紫色材料扩增出大约160bp的产物，杂合紫色材, 料扩增出共显性的产物见图2，图2是B-76在紫色和橙色亲本及F2代单株中的扩增结果；泳道信息：（从左到右）M，50 bp DNA ladder；5个纯合紫色单株；5个杂合紫色单株；6个纯合非紫色单株；P是紫色亲本；O是橙色亲本。图4是标记B-76的引物在亲本14S839和14S162间的扩增序列差异。B-76-14S839表示标记B-76的引物在亲本14S839中的扩增结果；B-76-14S162表示标记B-76的引物在亲本14S162中的扩增结果。
图6中的 P1、P2分别是紫色亲本材料14S839成熟期的叶球外观和叶球剖面；O1、O2分别是橙色亲本材料14S162成熟期的叶球外观和叶球剖面。
Claims (2)
1.一种检测与大白菜紫色叶球基因BrPur紧密连锁的分子标记的引物对在紫色叶球大白菜分子辅助育种中的应用，其特征在于：所述引物对的上游引物序列为SEQ ID NO.5，下游引物序列为SEQ ID NO.6。
2. 一种检测与大白菜紫色叶球基因BrPur紧密连锁的分子标记的引物对在紫色叶球大白菜分子辅助育种中的应用，其特征在于：所述引物对的上游引物序列为SEQ ID NO.7，下游引物序列为SEQ ID NO.8。
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| Mapping the BrPur gene for purple leaf color on linkage group A03 of Brassica rapa;Wang W等;《Euphytica》;20140511;第199卷;第293-302页 * |
| 大白菜紫心性状遗传规律分析及其基因初步定位;吴俊清等;《园艺学报》;20160625;第43卷(第6期);第1079-1088页 * |
| 紫心大白菜遗传规律分析及紫色基因精细定位;吴俊清;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)农业科技辑》;20200915;D048-1 * |
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