CN116121440A - 一种与芝麻金黄色籽粒主效qtl位点紧密连锁的分子标记及其应用 - Google Patents

一种与芝麻金黄色籽粒主效qtl位点紧密连锁的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学及遗传育种学技术领域，涉及与芝麻金黄色籽粒主效QTL位点紧密连锁的分子标记SNP6804及其应用；本发明利用重组自交系的表型和高密度遗传图谱在芝麻第6连锁群LG06上定位了一个控制芝麻金黄色籽粒的主效QTL位点，在不同环境中可解释表型变异率的29.46%～35.79%，命名为qSC_LG06；同时开发出与qSC_LG06紧密连锁的SNP分子标记，命名为SNP6804，其引物序列为：SNP6804F1:5'‑GACAAAGTTGCGATACGCCA‑3'，SNP6804F2:5'‑TCGACGACAAAGTTGCGATACGACG‑3',SNP6804R:5'‑TGCAGGACTCAGTCTTCATGGGTG‑3'。通过本发明分子标记的应用，可以进行芝麻金黄色籽粒的分子标记辅助选择育种，缩短育种周期，节省育种过程中每代需要鉴定粒色的繁琐程序，节省了大量的劳动力，降低成本，提高工作效率。同时，将传统表型转化为基因型选择，提高了选择的准确性和科学性。

Description

一种与芝麻金黄色籽粒主效QTL位点紧密连锁的分子标记及其应用
技术领域
本发明属于本发明属于分子生物学及遗传育种学技术领域，具体涉及一种与芝麻金黄色籽粒主效QTL位点紧密连锁的分子标记SNP6804及其应用。
背景技术
芝麻是我国重要的优质油料作物和特色农产品，素有“油料皇后”的美誉，它具有较高的含油量(44％～58％)和蛋白质(18％～25％)(Uzun et al.,2008)，除此之外，芝麻种皮还富含芝麻素(Sesamin)、芝麻林素(Sesamolin)等抗氧化物质，研究表明不同粒色芝麻具有不同的营养价值，比如：白色芝麻含油量较高，而深色芝麻含有丰富的花色苷类化合物，因此，芝麻不仅是优质食用油的重要来源，也被广泛应用于食品加工、医疗保健和抗衰老等方面；近年来，随着国内人民生活水平的不断提高，消费者不仅对芝麻油的的需求量逐渐增加，对具有特殊色泽和特定营养成分的食用芝麻的需求也越来越大；但是目前市场上，芝麻品种主要是以黑芝麻和白芝麻为主，因此，开展芝麻粒色育种，满足人们对不同色泽和不同营养成分芝麻的需求已经成为芝麻育种的重要目标之一。
虽然通过传统的育种方法已经为生产提供了多个优良的芝麻品种，但由于传统育种周期长，选择效率低，已经无法完全满足当前芝麻生产的需要；随着分子生物学的快速发展，分子标记辅助选择育种已经成为一种新的育种手段，它直接利用与目标性状基因紧密连锁的分子标记提前对个体进行选择，有效提高了选择效率和缩短了育种年限；目前分子标记辅助选择育种不仅仅应用于质量性状，也可以应用于复杂的数量性状，芝麻粒色是由多个主效基因控制的复杂数量性状，自然成熟的芝麻粒色多种多样，包括黑色、灰色、棕色、黄色、米黄色、白色等一系列粒色。
随着分子标记技术的发展和连锁图谱的构建，研究人员对芝麻粒色进行了QTL定位；Zhang等利用COI1134(白芝麻)和RXBS(黑芝麻)构建的F2:3群体定位了4个芝麻粒色性状的QTL(QTL1-1,QTL11-1,QTL11-2和QTL11-3)；Wang等(2016)利用Zhongzhi13(白芝麻)和ZZM2748(黑芝麻)构建的重组自交系定位4个控制芝麻粒色的QTL位点；随后，Wei等(2016)利用Zhongzhi13(白芝麻)和Mishuozhima(黑芝麻)构建的重组自交系定位6个芝麻粒色性状的QTL；虽然上述报道定位了多个与芝麻粒色相关的QTL，但是构建群体所用亲本均为白芝麻和黑芝麻，其杂交后代粒色复杂多样，包含由黑色渐变至白色的一系列粒色，导致定位的主效QTL无法与单一粒色相关联，不利于开展芝麻粒色的分子标记辅助选择育种；本研究通过白色芝麻与金黄色芝麻构建的群体进行QTL定位，旨在鉴定到与金黄色籽粒相关的QTL位点，用于芝麻金黄色籽粒的标记辅助选择育种。
发明内容
本发明的目的之一在于提供金黄色芝麻籽粒的主效QTL位点qSC_LG06，其定位于第6连锁群的93.2－96.9cM区间内。
本发明的目的之二在于提供了上述与金黄色芝麻籽粒相关主效QTL位点紧密连锁的分子标记SNP6804及其引物序列。
本发明的目的之三在于提供上述分子标记SNP6804在芝麻金黄色籽粒标记辅助选择育种中的应用方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种芝麻金黄色籽粒主效QTL位点qSC_LG06的获得方法，包括以下步骤：
(1)利用白色籽粒品种和金黄色籽粒品种杂交获得F1种子，经自交得到F2，利用单籽传法，经8年8代自交，获得重组自交系群体RIL；
(2)分别在三个不同地理位置种植RIL群体，成熟收获后调查芝麻粒色，获得表现型数据；
(3)提取白色籽粒品种、金黄色籽粒品种及RIL群体叶片基因组总DNA；
(4)对亲本和RIL群体进行重测序，利用BWA软件、GATK软件开发SNP标记，筛选亲本间有差异的纯合变异位点，然后根据遗传学原理，将多态性的分子标记根据亲本进行编码，并进行质量过滤，筛选高质量的分子标记，获得RIL群体的基因型数据；
(5)结合RIL群体基因型数据，利用Mstmap软件进行遗传连锁图构建；
(6)结合RIL群体基因型、遗传连锁图和芝麻粒色表型数据，利用R/qtl软件进行QTL分析，在LG06连锁群上定位获得一个控制芝麻金黄色籽粒的主效QTL位点，并且在3个不同地理环境中重复检测到，分别解释表型变异的35.68％、35.79％、29.46％，命名为qSC_LG06。
利用上述方法鉴定了一个与芝麻金黄色籽粒相关的主效QTL位点qSC_LG06，并自主开发了与qSC_LG06紧密连锁的分子标记SNP6804，其引物序列为：SNP6804F1:5'-GACAAAGTTGCGATACGCCA-3'，SNP6804F2:5'-TCGACGACAAAGTTGCGATACG ACG-3'，SNP6804R:5'-TGCAGGACTCAGTCTTCATGGGTG-3'；以该引物进行PCR扩增，在白色籽粒‘豫芝8号’中仅能扩增出长度为105bp的片段；在金黄色籽粒材料‘兖州二红皮’中仅能扩增出110bp的片段；在杂合基因型的金黄色籽粒材料中则能扩增出两条片段，其中一条长度为105bp，另外一条长度为110bp。
上述分子标记SNP6804在芝麻金黄色籽粒的标记辅助选择中应用，具体方式是用分子标记SNP6804的引物序列进行PCR扩增，扩增样本是芝麻育种后代单株叶片或其他组织总DNA。
进一步，所述PCR扩增的体系为10μL，包含25-50ng的模板DNA，0.1μL的5U/μLTaq酶，1μL的10×PCRbuffer，0.2μL的10mM/μL dNTPs，0.2μL的10μM/μL正向引物，0.2μL的10μM/μL反向引物，余量用ddH2O补足至10μL。
进一步，所述PCR扩增的程序为：预变性94℃1min；变性94℃30s，退火57℃30s，延伸72℃30s，35个循环，延伸72℃10min。
进一步，PCR扩增产物采用电泳分离，即采用9％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；所述电泳分离时的电泳缓冲液为0.5×TBE，所述电泳分离为150V恒功率电泳分离；结果的判定方法为：若只扩增出105bp的片段，样本为白色籽粒的纯合材料；若只扩增出110bp的片段，样本为金黄色籽粒的纯合材料；若扩增出105bp和110bp两种片段，样本为金黄色籽粒的杂合材料。
本发明的有益效果在于：
1、本发明首次在芝麻中定位了一个控制芝麻金黄色粒色的主效QTL位点qSC_LG06，并开发了与qSC_LG06紧密连锁的SNP分子标记SNP6804。
2、本发明利用重组自交系的表型和高密度遗传图谱在芝麻第6连锁群LG06上定位了一个控制芝麻金黄色籽粒的主效QTL位点，在不同环境中可解释表型变异率的29.46％～35.79％，此位点的获得可作为芝麻金黄色籽粒的分子标记的基础，也是芝麻粒色辅助选择育种的应用基础。
3、本发明开发与金黄色芝麻籽粒相关主效QTL位点紧密连锁的分子标记SNP6804及其引物序列，利用PCR扩增技术，模板DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，延伸后得到的目的产物，根据产物片段的大小进行金黄色芝麻籽粒品种的筛选。
4、本发明的应用方法克服了常规育种中表型鉴定要等到种子收获后观察粒色，可以利用分子标记在幼苗期鉴定出芝麻粒色，早期剔除不需要的材料，节省人力物力，实现芝麻粒色早期世代选择而缩短育种周期，从而较快地筛选出金黄色籽粒的芝麻材料，显著提高育种效率。
附图说明
图1为控制芝麻金黄色籽粒主效QTL位点qSC_LG06的定位结果。
图2分子标记SNP6804在RIL群体中扩增产物检测示意图。
具体实施方式
本发明中芝麻金黄色籽粒主效QTL位点qSC_LG06的获得方法，包括以下步骤：
(1)利用白色籽粒品种‘豫芝8号’和金黄色籽粒品种‘兖州二红皮’杂交获得F1种子，经自交得到F2，利用单籽传法，经8年8代自交，获得重组自交系群体RIL；
(2)分别在河南驻马店、河南南阳、海南三亚种植RIL群体，成熟收获后调查芝麻粒色，获得表现型数据；
(3)提取‘豫芝8号’、‘兖州二红皮’及RIL群体叶片基因组总DNA；
(4)对亲本和RIL群体进行重测序，利用BWA软件、GATK软件开发SNP标记，筛选亲本间有差异的纯合变异位点，然后根据遗传学原理，将多态性的分子标记根据亲本进行编码，并进行质量过滤，筛选高质量的分子标记，获得RIL群体的基因型数据；
(5)结合RIL群体基因型数据，利用Mstmap软件进行遗传连锁图构建；
(6)结合RIL群体基因型、遗传连锁图和芝麻粒色表型数据，利用R/qtl软件进行QTL分析，在LG06连锁群上定位获得一个控制芝麻金黄色籽粒的主效QTL位点，并且在河南驻马店、南阳、海南三亚3个环境中重复检测到，分别解释表型变异的35.68％、35.79％、29.46％，命名为qSC_LG06。
利用上述方法，申请人最终鉴定了一个与芝麻金黄色籽粒相关的主效QTL q SC_LG06，并自主开发了与qSC_LG06紧密连锁的分子标记SNP6804，其引物序列为：SNP6804F1:5'-GACAAAGTTGCGATACGCCA-3'，SNP6804F2:5'-TCGACGACAAAGT TGCGATACGACG-3'，SNP6804R:5'-TGCAGGACTCAGTCTTCATGGGTG-3'；以该引物进行PCR扩增，在白色籽粒‘豫芝8号’中仅能扩增出长度为105bp的片段；在金黄色籽粒材料‘兖州二红皮’中仅能扩增出110bp的片段；在杂合基因型的金黄色籽粒材料中则能扩增出两条片段，其中一条长度为105bp，另外一条长度为110bp。
上述分子标记SNP6804在芝麻金黄色籽粒的标记辅助选择中应用方法为：用该标记引物扩增芝麻育种后代单株叶片或其他组织总DNA。
所述PCR扩增的体系为10μL，包含25-50ng的模板DNA，0.1μL的5U/μLTaq酶，1μL的10×PCRbuffer，0.2μL的10mM/μL dNTPs，0.2μL的10μM/μL正向引物，0.2μL的10μM/μL反向引物，余量用ddH2O补足至10μL。
所述PCR扩增的程序为：预变性94℃1min；变性94℃30s，退火57℃30s，延伸72℃30s，35个循环，延伸72℃10min。
所述电泳分离为采用9％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。
所述电泳分离时的电泳缓冲液为0.5×TBE，所述电泳分离为150V恒功率电泳分离。
采用电泳分离，结果的判定方法为：若只扩增出105bp的片段，表明在上述qFT_LG06位点上只存在与‘豫芝8号’相同的等位基因，样本为白色籽粒的纯合材料；若只扩增出110bp的片段，表明在上述qFT_LG06位点上只存在与‘兖州二红皮’相同的等位基因，样本为金黄色籽粒的纯合材料；若扩增出105bp和110bp两种片段，则表明在上述qSC_LG06位点上存在杂合等位基因，样本为金黄色籽粒的杂合材料。
以下实施例用于具体说明本发明，实施过程中涉及的所有试剂成分均可从商业途径获得，并按照实验手册中的条件或所用试剂制造厂商所建议的条件使用。
实施例1
一种金黄色芝麻籽粒主效QTL位点的获得方法，以及与金黄色芝麻籽粒主效QTL位点紧密连锁的分子标记SNP6804的开发方法及应用方法，具体包括如下内容：
(1)RIL群体构建：以‘豫芝8号’为母本，‘兖州二红皮’为父本，杂交获得F1种子，自交获得F2种子，利用单籽传法，经8年8代自交，获得重组自交系群体RIL。
(2)粒色表型鉴定：分别在河南驻马店、南阳、海南三亚种植RIL群体，采用随机区组设计，每个RIL个体材料种植1行，设置为两重复，每行随机混合收获10株成熟单株，待种子晒干后观察粒色，获得表型数据。
(3)DNA提取：采用CTAB法，提取‘豫芝8号’、‘兖州二红皮’和RIL群体单株的叶片DNA，具体步骤为：液氮研磨叶片0.5g，将粉末加入2ml的离心管中，加入1ml的提取缓冲液，冰上放置10min，12000rpm离心5min，弃上清液；加入裂解缓冲液600μl，混匀，65℃水浴30～60min；加入1ml苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1，V/V/V)混匀30次，静置5min，12000rpm离心5min，吸取上清液；加入等体积异丙醇，混匀后放置10min，12000rpm离心5min，弃上清液；75％的乙醇清洗两次，通风橱内吹干，加入1×TE溶解(500μl)，加入两倍体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1，V/V/V)，混匀50次，静置5min，12000rpm离心5min；吸上清液，加入等体积氯仿混匀50次，静置5min，12000rpm离心5min；吸取上清液，加入十分之一体积3mol/L NaAc(pH 5.2)，加入等体积异丙醇，混匀，12000rpm离心5min，弃上清液，75％乙醇清洗两次，通风橱内吹干，加入适量含有RNase的TE(50μl)溶解沉淀，37℃水浴30min，消化RNA。Nanodrop分析仪检测DNA浓度，琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，保存于-20℃备用。
(4)基因组重测序和SNP标记开发：利用超声波将‘豫芝8号’、‘兖州二红皮’和RIL群体单株的DNA序列片段化形成随机片段，对片段化的DNA依次进行末端修复、3端加A、连接测序接头后，再利用磁珠吸附富集基因组长度为400bp左右的片段，经过PCR扩增形成测序文库，然后在Illumina HiSeq 2000平台测序(上海美吉生物医药科技有限公司)，下机获得Raw data，利用fastp过滤获得Clean Reads，然后利用BWA软件将Clean Reads比对到中芝13号参考基因组上(Wang et al.2014)，再利用GATK4.0软件的Best Practices流程检测SNP标记，随后筛选在双亲中存在差异的纯合SNP标记，并根据遗传学原理，将已经获得的分子标记根据亲本进行aa×bb编码，进行质量过滤，筛选高质量的分子标记，最后获得7817个SNP标记。
(5)高密度遗传连锁图构建及QTL定位：利用MSTmap软件将7817个分子标记划分为13连锁群，构建高密度遗传图谱；结合RIL群体基因型、遗传连锁图和粒色数据，利用R/qtl软件进行QTL定位，鉴定获得一个定位于第6连锁群LG0693.2－96.9cM区间的主效QTL，该QTL在河南驻马店、南阳、海南三亚3个环境中被重复检测到，分别解释表型变异的35.68％、35.79％、29.46％，命名为qSC_LG06，如图1所示。
(6)与主效QTL紧密连锁标记的开发：在主效QTL区间内，双亲之间存在一个SNP变异位点，与qSC_LG06紧密连锁；该SNP位点在金黄色籽粒材料‘兖州二红皮’中为碱基G，在白色籽粒材料‘豫芝8号’中为碱基A，遵循SNP标记开发原则开发标记SNP6804，其引物序列为：SNP6804F1:5'-GACAAAGTTGCGAT ACGCCA-3'，SNP6804F2:5'-TCGACGACAAAGTTGCGATACGACG-3'，SNP6804R:5'-TGCAGGACTCAGTCTTCATGGGTG-3'。
(7)利用标记SNP6804的引物序列进行应用：用该标记引物序列分别对白色籽粒品种‘豫芝8号’、金黄色籽粒品种‘兖州二红皮’、重组自交系群体RIL的育种后代单株叶片或其他组织总DNA进行PCR扩增。
PCR扩增采用的体系为10μL，包含25-50ng的模板DNA，0.1μL的5U/μL Taq酶，1μL的10×PCRbuffer，0.2μL的10mM/μL dNTPs，0.2μL的10μM/μL正向引物，0.2μL的10μM/μL反向引物，余量用ddH2O补足至10μL。
PCR扩增的程序为：预变性94℃1min；变性94℃30s，退火57℃30s，延伸72℃30s，35个循环，延伸72℃10min。
PCR扩增产物采用电泳分离，即采用9％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；所述电泳分离时的电泳缓冲液为0.5×TBE，所述电泳分离为150V恒功率电泳分离；其结果的判定方法为：
该引物在金色籽粒材料‘兖州二红皮’中只能扩增出110bp的产物，在白色籽粒材料‘豫芝8号’中只能扩出105bp的产物，在杂合基因型中则能扩增出105bp和110bp两种产物。
实施例2
利用RIL群体验证分子标记SNP6804的辅助选择效果：
(1)RIL群体构建和DNA提取：以‘豫芝8号’为母本，‘兖州二红皮’为父本杂交获得F1种子，自交获得F2种子，利用单籽传法构建RIL群体；DNA提取方法同实施例1。
(2)RIL群体基因型鉴定：以RIL群体单株DNA为模板，利用SNP6804引物进行扩增，读取扩增条带，鉴定RIL群体基因型。PCR反应体系、凝胶及扩增产物观察方法同实施例1。在246个RIL单株中，114个单株的扩增产物为105bp的片段，记基因型为A；129个单株扩增产物为110bp的片段，记基因型为B；3个单株的扩增条带为105bp和110bp的产物，记基因型为H，具体见表1。
(3)分子标记SNP6804的辅助选择效果：为验证标记SNP6804的选择效果，在246个RIL群体的单株成熟收获后，调查其籽粒颜色，见表1。基因型和表型对照发现：114个扩增产物为105bp(基因型为A)片段的单株为白色籽粒；129个扩增产物为110bp片段(基因型为B)的单株为金黄色籽粒；3个扩增产物为110bp和105bp(基因型为H)片段的单株为金黄色籽粒。有以上结果说明利用分子标记SNP6804进行芝麻粒色辅助选择具有较好的效果。
上述各步骤中的表1为246个RIL单株基因型及开花天数，表1如下所示：
Figure BDA0004027086510000111
Figure BDA0004027086510000121

Claims (7)

1.一种与芝麻金黄色籽粒主效QTL位点紧密连锁的分子标记，其特征在于，在芝麻第6连锁群LG06的93.2－96.9 cM区间内，定位了一个控制芝麻金黄色籽粒的主效QTL位点qSC_LG06 ，在不同环境中可解释表型变异率的29.46%～35.79%；与芝麻金黄色籽粒主效QTL位点qSC_LG06紧密连锁的分子标记SNP6804。
2.根据权利要求1所述的一种与芝麻金黄色籽粒主效QTL位点紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述的分子标记SNP6804，其引物序列为：
SNP6804F1: 5'-GACAAAGTTGCGATACGCCA-3'，
SNP6804F2: 5'-TCGACGACAAAGTTGCGATACGACG-3',
SNP6804R: 5'-TGCAGGACTCAGTCTTCATGGGTG-3'。
3.根据权利要求2所述的一种与芝麻金黄色籽粒主效QTL位点紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记SNP6804在芝麻金黄色籽粒标记辅助选择中应用。
4.一种与芝麻金黄色籽粒主效QTL位点紧密连锁的分子标记的应用方法，其特征在于，根据权利要求3所述的一种与芝麻金黄色籽粒主效QTL位点紧密连锁的分子标记SNP6804在芝麻金黄色籽粒标记辅助选择中应用，应用方法具体为：用所述的分子标记SNP6804引物序列PCR扩增芝麻育种后代材料叶片或其他组织的总DNA样本，若扩增产物仅为一条105 bp的条带，则样本为白色籽粒纯合材料；若扩增产物仅为一条110 bp的条带，则样本为金黄色籽粒纯合材料；若扩增产物为105 bp和110 bp两条条带，则为金黄色籽粒的杂合材料。
5.根据权利要求4所述一种与芝麻金黄色籽粒主效QTL位点紧密连锁的分子标记的应用方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为10μL，包含25-50ng的模板DNA，0.1μL的5U/μL Taq酶，1μL的10×PCR buffer，0.2μL的10mM/μL dNTPs，0.2μL的10μM/μL正向引物，0.2μL的10μM/μL反向引物，余量用ddH2O补足至10μL；PCR扩增程序为：预变性94℃ 1min；变性94℃ 30s，退火57℃ 30s，延伸72℃ 30s，35个循环，再延伸72℃ 10min。
6.根据权利要求5所述一种与芝麻金黄色籽粒主效QTL位点紧密连锁的分子标记的应用方法，其特征在于，扩增产物采用9%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，150V恒功率电泳分离。
7.一种芝麻金黄色籽粒主效QTL位点的获得方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）利用白色籽粒品种和金黄色籽粒品种杂交获得F1种子，经自交得到F2，利用单籽传法，经8年8代自交，获得重组自交系群体RIL；
（2）分别在三个不同地理位置种植RIL群体，成熟收获后调查芝麻粒色，获得表现型数据；
（3）提取白色籽粒品种、金黄色籽粒品种及RIL群体叶片基因组总DNA；
（4）对亲本和RIL群体进行重测序，利用BWA软件、GATK软件开发SNP标记，筛选亲本间有差异的纯合变异位点，然后根据遗传学原理，将多态性的分子标记根据亲本进行编码，并进行质量过滤，筛选高质量的分子标记，获得RIL群体的基因型数据；
（5）结合RIL群体基因型数据，利用Mstmap软件进行遗传连锁图构建；
（6）结合RIL群体基因型、遗传连锁图和芝麻粒色表型数据，利用R/qtl软件进行QTL分析，在LG06连锁群上定位获得一个控制芝麻金黄色籽粒的主效QTL位点，并且在三个不同的地理环境中重复检测到，分别解释表型变异的35.68%、35.79%、29.46%，命名为qSC_LG06。
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