CN106701751B - 与小麦旗叶长QTL QFll.sicau-4D紧密连锁的分子标记及应用 - Google Patents

与小麦旗叶长QTL QFll.sicau-4D紧密连锁的分子标记及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种与小麦旗叶长QTL QFll.sicau‑4D紧密连锁的分子标记，其为分子标记HRM4，核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；分子标记HRM4与小麦旗叶长QTL QFll.sicau‑4D之间的遗传距离为0.5cM，二者共定位于小麦4D染色体上。检测分析表明，该分子标记能准确跟踪所述小麦旗叶长QTL，预测小麦的旗叶长特性，进而方便进行分子设计育种。本发明还提供分子标记HRM4在小麦育种中的应用。利用本发明提供的方法能够加强旗叶长预测的准确性，以便快速筛选出具有增加旗叶长的QTL的小麦品种或品系用于育种，可大大加快小麦高产品种的选育进程。

Description

与小麦旗叶长QTL QFll.sicau-4D紧密连锁的分子标记及 应用
技术领域
本发明涉及小麦分子育种领域，具体地说，涉及一种与小麦旗叶长QTLQFll.sicau-4D紧密连锁的分子标记及应用。
背景技术
小麦是世界重要粮食作物，我国是小麦生产与消费大国，小麦在保障国家粮食安全中占有重要地位，常年种植面积在2666.67万公顷以上，约占粮食作物面积的27％；总产量为1亿吨以上，约占粮食作物产量的22％。
旗叶是小麦生长后期光合效率最高的叶片，是小麦籽粒碳水化合物的重要来源。研究表明，旗叶对小麦籽粒产量的贡献可达1/3，在籽粒和产量形成中起着重要的作用(左宝玉,段续川.冬小麦不同层次叶片中叶绿体超微结构及其功能的研究[J].Journal ofIntegrative Plant Biology,1978(3):29-34+93-95.)。旗叶主要是通过影响小麦的穗粒数、单穗粒重和千粒重，从而影响小麦产量。旗叶形态包括：旗叶长、旗叶宽、旗叶面积、旗叶周长、旗叶长宽比等，对旗叶形态性状相关基因进行定位可为选育高产小麦品种提供理论依据。
旗叶相关性状是数量性状(Quantitative trait locus，QTL)，受到多基因的控制，并且受环境作用影响很大。近年来，合理的旗叶长、旗叶宽等逐渐成为研究的热点。在水稻、玉米、大麦中都有对旗叶QTL研究的相关报道，而小麦旗叶的却是很少。Jia等在5A染色体的Xbarc303～Xwmc区段上定位到了控制旗叶宽的QTL：Qflw.nau-5A，可解释25％的表型变异(Jia H,Wan H,Yang S,et al.Genetic dissection of yield-related traits in arecombinant inbred line population created using a key breeding parent inChina’s wheat breeding[J].Theoretical and Applied Genetics,2013,126(8):2123-39.)。Xue等利用绵阳99-323和PH691构建的NIL对旗叶宽Qflw.nau-5A进行了精细定位，发现其位于5AL上与抗赤霉病基因Fhb5紧密连锁(Xue S,Xu F,Li G,et al.Fine mappingTaFLW1,a major QTL controlling flag leaf width in bread wheat(Triticumaestivum L.).[J].Theoretical and Applied Genetics,2013,126(8):1941-9.)。
小麦材料H461相对于小麦品种川麦107(国审品种，简称CM107)具有长旗叶、寡分蘖、多穗粒数、多小穗数、高千粒重和高穗粒重等特性(侯永翠，郑有良，蒲至恩，魏育明，李伟.穗数型小麦新品种川农16与大穗型寡分蘖品系H461遗传差异研究初报.四川农业大学学报.2003,21:94-9)。同时，小麦品种川麦107的旗叶长数显著低于H461。因此，利用H461和川麦107构建遗传研究群体，进一步验证小麦H461的旗叶长特性，定位控制旗叶长基因，寻找紧密连锁的分子标记，促进旗叶长基因的图位克隆，同时为小麦特异旗叶长材料的创制及株型育种提供新基因资源，进一步利用分子标记辅助选择，将增强旗叶长测的准确性，提高育种效率，加速实现增加小麦单产的目标。
分子标记辅助选择，不依赖于表现型选择，即不受环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素的影响，而是直接对基因型进行选择，因而能大大提高育种效率。高分辨熔解曲线(High Resolution Melting,HRM)技术近年来国际上兴起的一种SNP及突变研究工具。这种检测方法具有操作简便、特异性好、高通量、快速、检测成本低、结果准确等优势，并且实现了真正的闭管操作而受到普遍的关注。因此，筛选出与旗叶长QTL紧密连锁的，且适用于荧光定量PCR平台HRM技术的分子标记，不仅能对小麦旗叶基因进行选择，有效调控小麦旗叶形态，塑造合理的旗叶形态群体，同时提高了选择通量、速度和准确性，解决了大规模推广应用的技术瓶颈，对规模化改良小麦育种群体质量和产量具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种与小麦旗叶长QTL QFll.sicau-4D紧密连锁的分子标记。
本发明的另一目的是提供所述分子标记在小麦育种中的应用。
为了实现本发明目的，本发明提供的与小麦旗叶长QTL QFll.sicau-4D紧密连锁的分子标记，其为分子标记HRM4，核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
分子标记HRM4与小麦旗叶长QTL QFll.sicau-4D之间的遗传距离为0.5cM，二者共定位于小麦4D染色体上标记MK7472和MK3367之间2.89cM区段内(图1)，小麦旗叶长QTLQFll.sicau-4D能显著增加小麦旗叶长，LOD值大于4，解释约15.9％的表型变异。
本发明还提供用于荧光定量PCR扩增所述分子标记HRM4的引物对，包括上游引物和下游引物，序列分别如SEQ ID No:2-3所示。
本发明还提供所述分子标记HRM4在小麦育种中的应用。
本发明还提供所述分子标记HRM4在筛选或鉴定长旗叶小麦品种中的应用。
包括以下步骤：
1)提取待测小麦的基因组DNA；
2)以待测小麦的基因组DNA为模板，设计用于荧光定量PCR扩增所述分子标记的引物对(SEQ ID No:2-3)，进行荧光定量PCR扩增；
3)分析PCR扩增产物，进行基因分型。
其中，步骤2)荧光定量PCR扩增反应体系：SsoFast EvaGreen超混合液5μL、上游引物和下游引物各300ng、模板DNA100ng、DNase/RNase-free去离子水加至总量为10μL。
荧光定量PCR扩增程序：95℃预变性5min；94℃变性15s、55℃退火30s，共50个循环；熔解曲线范围为65～95℃，每0.2℃读一次数，时间为10s。
步骤3)利用高分辨熔解曲线进行基因分型，含有小麦旗叶长QTL QFll.sicau-4D的小麦品种均出现与小麦H461相同的熔解曲线，而不含有小麦旗叶长QTL QFll.sicau-4D的小麦品种均出现与小麦H461明显不同的熔解曲线。
本发明还提供所述分子标记HRM4在鉴定小麦旗叶长QTL QFll.sicau-4D中的应用。
本发明还提供SEQ ID No:2-3所示引物对在小麦分子标记辅助育种中的应用。
在本发明中，小麦旗叶长QTLQFll.sicau-4D及分子标记HRM4是通过以下方法获得的：
(1)利用长旗叶小麦H461作为母本，以川麦107为父本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，采用单粒传法获得含有200个株系的F8代RIL群体，随机选择165个株系构成遗传作图群体。
(2)用CTAB法提取所述的遗传作图群体的各株系的DNA，用DArT芯片技术，以亲本H461和川麦107的DNA为模板，进行基因分型，获得所述RIL群体的基因型资料。亲本H461的带型记为A，亲本川麦107的带型记为B。F8群体株系带型来源于H461的记为A，来源于川麦107的记为B，杂合型为H。
(3)小麦抽穗期田间鉴定所述F8群体植株的旗叶长。
(4)利用JoinMap4.0作图软件将获得的所述RIL群体基因型资料构建小麦分子连锁图谱，寻找最优的标记数和标记顺序，确定后续使用的连锁群。利用软件MapQTL 6.0的区间作图模型(Interval Mapping)和多重QTL作图模型(Multiple QTL Model)，并结合F8群体旗叶表型数据将旗叶长QTL QFll.sicau-4D定位于4D染色体上一个2.89cM的区段内。
(5)获取该区段内的DArT探针序列，通过在IWGSC小麦中国春的基因组测序数据(ftp://ftpmips.helmholtz-muenchen.de/plants/wheat/IWGSC/)，获得目标区段更多的序列信息，电子延长DArT探针序列两端对应的序列，并进行序列分析，初步筛选用于后续荧光定量PCR引物设计的目标区域。
(6)设计荧光定量PCR引物，用于后续筛选。利用Beacon Designer 7.0软件设计荧光定量PCR引物10对(表1)。荧光定量PCR引物设计标准：引物长度18～25bp，扩增产物长度65～100bp，退火温度60℃，GC含量在40％～60％之间，SNP差异位点产物退火温度差异大于0.2℃。
表1 10对HRM引物序列及扩增片段长度
(7)高分辨熔解曲线(HRM)分析
a)亲本之间多态性分子标记的筛选：选取上述设计的10对引物，以亲本H461和CM107的DNA为模板，进行PCR扩增，共获得1对效果良好的荧光定量PCR分子标记引物，命名为HRM4-F/R(核苷酸序列如SEQ ID No:2-3所示)。扩增产物为具有多态性的分子标记HRM4，核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
b)F8群体的HRM分析：用上述步骤获得的具有多态性的分子标记HRM4的PCR引物，扩增亲本H461、CM107和F8群体植株的DNA，进行基因型鉴定，获得分子标记数据。亲本H461的类型记为A，扩增片段大小长91bp，单碱基差异位点为“C”。亲本CM107的类型记为B，扩增片段长91bp，单碱基差异位点为“T”。F8群体株系类型来源于H461的记为A，来源于CM107的记为B。
本发明具有以下优点：
本发明首次公开了来自小麦H461的旗叶长QTL QFll.sicau-4D，位于小麦4D染色体，显著增加了小麦旗叶长。该QTL在小麦产量(调控旗叶长)育种中具有较高的利用价值。
本发明首次公开了基于荧光定量PCR平台精确检测小麦H461新旗叶长QTLQFll.sicau-4D的分子标记HRM4，且为共显性标记，检测准确高效、扩增方便稳定。
本发明公开的分子标记HRM4与旗叶长QTL QFll.sicau-4D显著相关，呈现共分离标记特征，用于分子标记辅助选择的准确性高，提高适应不同环境的小麦特定分蘖品种的选择鉴定效率，且成功率高。
附图说明
图1为本发明小麦H461旗叶长QTL QFll.sicau-4D在4D染色体上的位置及与分子标记HRM4之间的连锁遗传图谱。
图2为本发明实施例2中利用荧光定量PCR引物对H461、川麦107三叶期的叶片DNA做基因型分型的结果。
图3为本发明实施例2中H461×川农16的F8RIL群体后代利用荧光定量PCR引物进行基因型分型的结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1小麦旗叶长QTL QFll.sicau-4D的定位及分子标记HRM4的获得
1、利用长旗叶小麦H461作为母本，以小麦川麦107为父本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，采用单粒传法获得含有200个株系的F8代RIL群体，随机选择165个株系构成遗传作图群体。
2、用CTAB法提取所述的遗传作图群体的各株系的DNA，用DArT芯片技术，以亲本H461和川麦107的DNA为模板，进行基因分型，获得所述RIL群体的基因型资料。亲本H461的带型记为A，亲本川麦107的带型记为B。F8群体株系带型来源于H461的记为A，来源于川麦107的记为B，杂合型为H。
3、小麦抽穗期田间鉴定所述F8群体植株的旗叶长。
4、利用JoinMap4.0作图软件将获得的所述RIL群体基因型资料构建小麦分子连锁图谱，寻找最优的标记数和标记顺序，确定后续使用的连锁群。利用软件MapQTL 6.0的区间作图模型(Interval Mapping)和多重QTL作图模型(Multiple QTL Model)，并结合F8群体旗叶表型数据将旗叶长QTLQFll.sicau-4D定位于4D染色体上一个2.89cM的区段内。
5、获取该区段内的DArT探针序列，通过在IWGSC小麦中国春的基因组测序数据，获得目标区段更多的序列信息，电子延长DArT探针序列两端对应的序列，并进行序列分析，初步筛选用于后续荧光定量PCR引物设计的目标区域。
6、设计荧光定量PCR引物，用于后续筛选。利用Beacon Designer 7.0软件设计荧光定量PCR引物10对(表1)。荧光定量PCR引物设计标准：引物长度18～25bp，扩增产物长度65～100bp，退火温度60℃，GC含量在40％～60％之间，SNP差异位点产物退火温度差异大于0.2℃。
7、高分辨熔解曲线(HRM)分析
(a)亲本之间多态性分子标记的筛选：选取上述设计的10对引物，以亲本H461和CM107的DNA为模板，进行PCR扩增，共获得1对效果良好的荧光定量PCR分子标记。
(b)F8群体的HRM分析：以上述步骤获得的具有多态性的分子标记HRM4，扩增亲本H461、CM107和F8群体植株的DNA，进行基因型鉴定，获得分子标记数据。亲本H461的类型记为A，扩增片段大小长91bp，单碱基差异位点为“C”。亲本CM107的类型记为B，扩增片段长91bp，单碱基差异位点为“T”。F8群体株系类型来源于H461的记为A，来源于CM107的记为B。分子标记HRM4的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
(c)利用软件MapQTL 6.0的区间作图模型(Interval Mapping)，并结合F8群体旗叶长表型数据，发现分子标记HRM4位于旗叶长QTL位点QFll.sicau-4D 0.5cM的区段内，结果如图1所示，由图1可知，旗叶长QTL QFll.sicau-4D定位在标记MK7472和MK3367之间的2.89cM的区段内，而分子标记HRM4位于该区间内，与QTL呈紧密连锁。
实施例2与小麦旗叶长QTL QFll.sicau-4D紧密连锁的分子标记HRM4的应用
1.1 DNA的提取
试验材料选取H461、川农16(CN16)及川麦107(CM107)，其中川农16、川麦107为短旗叶长品种，H461为长旗叶长品种。采用CTAB法提取小麦样品三叶期的叶片DNA。
1.2检测小麦旗叶长QTLQFll.sicau-4D的引物的筛选
1.2.1引物设计
(1)获取该区段内的DArT探针序列，通过在IWGSC小麦中国春的基因组测序数据，获得目标区段更多的序列信息，电子延长DArT探针序列两端对应的序列，并进行序列分析，初步筛选用于后续荧光定量PCR引物设计的目标区域。
(2)设计荧光定量PCR引物，用于后续筛选。设计荧光定量PCR引物。荧光定量PCR引物设计标准：引物长度18～25bp，扩增产物长度65～100bp，退火温度60℃，GC含量在40％～60％之间，SNP差异位点产物退火温度差异大于0.2℃。
1.2.2荧光定量PCR平台测试引物及其亲本间的差异性
(1)提取川农16、H461、川麦107三叶期的叶片DNA。
(2)以步骤(1)所得的DNA作为模板，HRM4-F(SEQ ID No:2)和HRM4-R(SEQ ID No:3)为引物进行荧光定量PCR扩增。
(3)荧光定量PCR扩增反应体系：SsoFast EvaGreen超混合液5μL、上下游引物各300ng、模板DNA 100ng、DNase/RNase-free去离子水加至总量为10μL。
(4)荧光定量PCR程序：95℃预变性5min；94℃变性15s、55℃退火30s，共50个循环；熔解曲线范围为65～95℃，每0.2℃读一次数，时间为10s。
(5)将步骤(4)所得结果文件，导入BioRadPrecisionMelt软件进行基因分型，结果如图2所示。在绘制熔解曲线过程中，根据碱基对A＝T，C≡G解链的温度不同，BioRadPrecisionMelt将样本分为两种类型。H461为类型A，川农16/川麦107为类型B。
1.3群体检测过程中引物序列HRM4-F/R的适用性
(1)以H461为母本，川农16为父本杂交得到F1，F1自交获得F2，通过单粒传法加代至F8代RIL验证群体。提取群体中各株系三叶期的叶片DNA。
(2)以步骤(1)所得的DNA作为模板，利用本发明所提供的引物进行荧光定量PCR扩增，荧光染料为SsoFast EvaGreen。
(3)荧光定量PCR扩增反应体系：5μL SsoFast EvaGreen超混合液、上下游引物各300ng、100ng模板DNA、DNase/RNase-free去离子水加至总量为10μL。
(4)荧光定量PCR程序：95℃预变性5min；94℃变性15s、55℃退火30s，共50个循环；熔解曲线范围为65～95℃，每0.2℃读一次数，时间为10s。
(5)将步骤(4)所得结果文件，导入BioRadPrecisionMelt软件进行基因分型，结果如图3所示。随机抽检96株株系，42株能扩增出与H461相同类型的片段，为含有旗叶长QTLQFll.sicau-4D的植株，预测株系植株在抽穗后旗叶长较长。54株能扩增出与川农16、川麦107相同的B型片段，为不含有旗叶长QTL QFll.sicau-4D的植株，预测这些植株在抽穗后旗叶长较短。
(6)小麦抽穗期间田间鉴定该96个F8植株的旗叶长，结果见表2，旗叶长QTLQFll.sicau-4D的分子标记HRM4预测遗传群体旗叶长的结果。与H461类型相同的植株平均旗叶长为24.17cm，显著高于与川农16、川麦107类型的植株旗叶长(平均22.65cm)。实际结果与预期结果一致，说明本发明的旗叶长QTL QFll.sicau-4D确实具有显著增加旗叶长的作用，且分子标记HRM4可以用于跟踪鉴定旗叶长QTL QFll.sicau-4D。
表2
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 与小麦旗叶长QTL QFll.sicau-4D紧密连锁的分子标记及应用
<130> KHP171111047.3TQ
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 91
<212> DNA
<213> HRM4
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(44)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
tgacagcgtc gagaagaagc agcgcgggca agacatagaa aacnggattt catcccagca 60
gcagaagatc gctgcattga ggcaagaggt c 91
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgacagcgtc gagaagaa 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gacctcttgc ctcaatgc 18

Claims (9)

1.与小麦旗叶长QTL QFll.sicau-4D紧密连锁的分子标记，其特征在于，其为分子标记HRM4，核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；分子标记HRM4与小麦旗叶长QTL QFll.sicau-4D之间的遗传距离为0.5cM，二者共定位于小麦4D染色体上标记MK7472和MK3367之间2.89cM区段内，小麦旗叶长QTL QFll.sicau-4D能显著增加小麦旗叶长，LOD值大于4，解释15.9％的表型变异。
2.用于荧光定量PCR扩增权利要求1所述分子标记的引物对，其特征在于，包括上游引物和下游引物，序列分别如SEQ ID No:2-3所示。
3.权利要求1所述分子标记在小麦育种中的应用。
4.权利要求2所述引物对在筛选或鉴定长旗叶小麦品种中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测小麦的基因组DNA；
2)以待测小麦的基因组DNA为模板，设计用于荧光定量PCR扩增所述分子标记的引物对，进行荧光定量PCR扩增；所述引物对包括上游引物和下游引物，序列分别如SEQ ID No:2-3所示；
3)分析PCR扩增产物，进行基因分型。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤2)中荧光定量PCR扩增反应体系：SsoFast EvaGreen超混合液5μL、上游引物和下游引物各300ng、模板DNA 100ng、DNase/RNase-free去离子水加至总量为10μL；
荧光定量PCR扩增程序：95℃预变性5min；94℃变性15s、55℃退火30s，共50个循环；熔解曲线范围为65～95℃，每0.2℃读一次数，时间为10s。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，步骤3)利用高分辨熔解曲线进行基因分型，含有小麦旗叶长QTL QFll.sicau-4D的小麦品种均出现与小麦H461相同的熔解曲线，而不含有小麦旗叶长QTL QFll.sicau-4D的小麦品种均出现与小麦H461明显不同的熔解曲线。
8.权利要求2所述引物对在鉴定小麦旗叶长QTL QFll.sicau-4D中的应用。
9.权利要求2所述引物对在小麦分子标记辅助育种中的应用。
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