CN114164294A - 与大白菜持绿性相关的snp位点及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了与大白菜持绿性相关的SNP位点及其应用。本发明提供了检测SNP位点0513基因型的物质在鉴定待测大白菜是否具有持绿性中的应用；所述SNP位点0513为序列表中序列1第24位。本发明在大白菜中开发一个与持绿性连锁的SNP标记，通过对该竞争性等位基因特异性引物的扩增，可鉴定材料持绿与否以及纯合与否，可用于持绿性育种材料的辅助选择，可以有效的解决常规育种周期长，易受到环境影响的问题。

Description

与大白菜持绿性相关的SNP位点及其应用
技术领域
本发明属于分子遗传学领域，涉及与大白菜持绿性相关的SNP位点及其应用。
背景技术
植物叶色是叶片中多种色素的综合表现，正常叶片中叶绿素占优势，通常表现为绿色。叶片衰老是植物叶片发育的最后阶段，是植物营养物质再循环的一个重要环节(Parket al.,2007)。叶片衰老最明显的标志是由叶绿素降解而引起的绿色褪去和之后的花青素或类黄酮类物质的显色(Matileet al.,1999)。持绿性(stay-green)是指植物衰老叶片叶绿素不降解或降解不明显，较长时间保持绿色甚至完全不黄化的特性(Kusaba et al.,2013)。持绿性变异因其显著的特征而被相继发现并引起广泛研究。孟德尔在遗传定律中所使用的绿色豌豆，便是最早发现的植物持绿性变异材料。随后利用理化诱变又创制出多份持绿性变异材料。迄今，已在模式作物(拟南芥、烟草)、主要农作物(水稻、大豆、高粱、玉米、小麦)、园艺作物(白菜、番茄、辣椒、菜豆、柑橘)及观赏作物(结缕草、苜蓿)中鉴定到了持绿性变异(Wang et al.,2020)。
持绿突变体是研究植物衰老进程、叶绿素代谢、光合电子传递、植物应对激素响应、抗逆性(抗旱，盐胁迫，耐高温等)等生理代谢过程的理想材料。持绿突变体的研究，不仅可以获得一些抗衰、高产、抗性新材料，还可以丰富作物抗逆基因资源，对于作物品种改良有重要意义。
大白菜(Brassica campestris ssp.pekinensis)是起源于我国的重要蔬菜作物，南北各地广泛栽培。在大白菜生产中，植株进入结球期后外叶往往就开始衰老变黄，影响叶球产量和品质。此外，叶球采收后贮运期间，球叶黄化也会造成大量损耗。
发明内容
本发明的一个目的是提供检测SNP位点0513基因型的物质的用途。
本发明提供的检测SNP位点0513基因型的物质在鉴定或辅助鉴定待测大白菜是否具有持绿性中的应用；
所述SNP位点0513为序列表中序列1第24位。
上述应用中，所述SNP位点0513基因型为CC、TT或CT。
本发明另一个目的是提供检测SNP位点0513基因型的物质的另一个用途。
本发明提供的检测SNP位点0513基因型的物质在选育具有持绿性状的大白菜中的应用；
所述SNP位点0513为序列表中序列1第24位。
上述应用中，所述检测SNP位点0513基因型的物质如下1)或2)：
1)KASP成套引物，
所述KASP成套引物由序列表中序列2所示的单链DNA分子或其衍生物、序列表中序列3所示的单链DNA分子或其衍生物和序列表中序列4所示的单链DNA分子或其衍生物组成；
2)含有所述成套引物的PCR试剂或试剂盒。
上述序列表中序列2所示的单链DNA分子的衍生物为如下1)或2)：
1)序列2所示的单链DNA分子的5'端连接一种荧光序列或荧光基团；
2)序列2所示的单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子的5'端连接一种荧光序列或荧光基团；
所述序列表中序列3所示的单链DNA分子的衍生物为如下3)或4)：
3)序列3所示的单链DNA分子的5'端连接另一种荧光序列或荧光基团；
4)序列3所示的单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子的5'端连接另一种荧光序列或荧光基团；
所述序列表中序列4所示的单链DNA分子的衍生物为序列4所示的单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子。
或，所述荧光基团为FAM或HEX。在本发明的实施例中，序列2连接的荧光基团为FAM，序列3连接的荧光基团为HEX。
本发明还有一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测大白菜是否具有持绿性的方法。
本发明提供的方法，为检测大白菜基因组中SNP位点0513基因型是CC、TT或CT，
若待测大白菜中SNP位点0513基因型为TT，则待测大白菜具有或候选具有持绿性；
若待测大白菜中SNP位点0513基因型为CC或CT，则待测大白菜不具有或候选不具有持绿性。
本发明还提供了一种选育具有持绿性大白菜的方法，为检测大白菜基因组中SNP位点0513基因型是CC、TT或CT.
选育SNP位点0513基因型为TT的待测大白菜，得到具有持绿性大白菜；
所述SNP位点0513为序列表中序列1第24位。
上述方法中，所述检测大白菜基因组中SNP位点0513基因型是CC、TT或CT的方法，为如下A)或B)：
A)直接测序；
B)用上述成套引物对所述待测大白菜基因组DNA进行KASP检测，实现基因分型。
本发明还提供了一种成套引物，由序列表中序列2所示的单链DNA分子或其衍生物、序列表中序列3所示的单链DNA分子或其衍生物和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成；
所述序列2所示的单链DNA分子的衍生物为在序列2所示的单链DNA分子的5'端连接一种荧光序列(FAM基团)；
所述序列3所示的单链DNA分子的衍生物为在序列3所示的单链DNA分子的5'端连接另一种荧光序列(HEX基团)。
含有上述成套引物的PCR试剂或试剂盒也是本发明保护的范围。
上述成套引物或上述的PCR试剂或试剂盒在如下至少一种中的应用也是本发明保护的范围：
1)鉴定或辅助鉴定待测大白菜是否具有持绿性；
2)选育具有持绿性状的大白菜；
3)制备鉴定或辅助鉴定待测大白菜是否具有持绿性产品；
4)制备选育具有持绿性状的大白菜产品。
本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定待测大白菜是否具有持绿性的方法，为用上述的成套引物对大白菜进行KASP扩增，检测扩增产物，
若待测大白菜扩增产物仅显示序列3所示引物5'端连接荧光序列的颜色，则待测大白菜具有或候选具有持绿性；
若待测大白菜扩增产物仅显示序列2所示引物5'端连接荧光序列的颜色或显示序列3所示引物5'端连接荧光序列的颜色和序列2所示引物5'端连接另一种荧光序列的颜色，则待测大白菜不具有或候选不具有持绿性。
或，本发明提供了一种选育具有持绿性大白菜的方法，为用上述的成套引物对大白菜进行KASP扩增，检测扩增产物，选育扩增产物仅显示序列3所示引物5'端连接荧光序列的颜色的待测大白菜，得到具有持绿性大白菜。
上述待测大白菜为野生型FT与突变体cl(持绿)杂交后代或F2代。
上述持绿性为大白菜生长至莲座期仍然表现出稳定的叶色持绿表型。
本发明中，大白菜突变体cl于2021年6月21日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO.21579，分类命名为Brassica campestris ssp.pekinensis。
本发明的实验证明，本发明发现的与持绿性相关的SNP标记，通过对该竞争性等位基因特异性引物的扩增，可鉴定材料持绿与否以及纯合与否，可用于持绿性育种材料的辅助选择，可以有效的解决常规育种周期长，易受到环境影响的问题。通过早期利用该分子标记可以快速筛选到满意的植株，有效的减小了种植规模，减少了后期鉴定的工作量。提高了选择的效率和准确性。因此，本发明在持绿大白菜育种实践中具有重要意义。
附图说明
图1为持绿突变体cl与野生型FT。
图2为持绿突变体cl与野生型FT衰老叶片叶绿素含量图，注:DAD表示Day afterDark-induced senescence，暗诱导衰老天数。
图3为持绿相关SNP标记在持绿和非持绿大白菜材料中的分型结果，注：图中正方形框图内为非持绿纯合CC基因型，三角形框图内为非持绿杂合TC基因型，长方形框图内为持绿纯合TT基因型。
图4为SNP20194801标记在持绿和非持绿大白菜材料中的分型结果，注：图中长方形框图内为非持绿纯合CC基因型，三角形框图内为非持绿杂合TC基因型，半圆形框图内为持绿纯合TT基因型。
图5为SNP18246940标记在持绿和非持绿大白菜材料中的分型结果，注：图中长方形框图内为非持绿纯合CC基因型，三角形框图内为非持绿杂合TC基因型，半圆形框图内为持绿纯合TT基因型。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
大白菜优异小孢子DH系‘FT’；公众可从申请人获得，记载过‘FT’的非专利文献是：Huang et al.，Screening of Chinese cabbage mutants produced by 60Co c-raymutagenesis of isolated microspore cultures，Plant Breeding,133,480–488(2014)；Huang et al.，A new method for generation and screening of Chinese cabbagemutants using isolated microspore culturing and EMS mutagenesis，Euphytica(2016)207:23–33)；
大白菜持绿突变体cl于2021年6月21日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNO.21579，分类命名为Brassica campestris ssp.pekinensis。
cl在整个生长期表现出稳定的持绿表型，除叶色持绿突变外其他性状与野生型无明显差异(图1，a、b、c分别为：幼苗期、成株期、莲座期，突变体与野生型(FT)的叶片颜色；d:突变体与野生型的叶球形态)。野生型FT(图中以WT表示)与突变体cl的叶片表型如图2a所示(0DAD-16DAD分别指突变体和野生型离体叶片经黑暗诱导衰老0天、4天、8天、16天。野生型FT与突变体cl的衰老叶片叶绿素含量如图2b所示，横坐标为突变体和野生型离体叶片经黑暗诱导衰老0天、8天、16天，看出，突变体cl衰老叶片Chla(叶绿素a)、Chlb(叶绿素b)含量都显著高于野生型(图中以WT表示)。
实施例1、与持绿性状相关的SNP分子标记的开发及应用
一、SNP分子标记的设计
以大白菜DH系‘FT’为试材，采用萌动种子EMS诱变处理方法，创制出一份稳定遗传的持绿性突变体cl。通过野生型‘FT’和突变体cl基因组重测序，筛选到一个与大白菜持绿性相关的SNP位点。通过对该竞争性等位基因特异性引物的扩增，可以鉴定持绿与否以及是否纯合，可用于持绿性育种材料的辅助选择。具体如下：
对野生型大白菜FT、大白菜突变体cl及二者杂交得到F1代的自交后代F2代基因组进行检测，在大白菜中发现一个与持绿性状相关的SNP位点0513，该位点为序列表中序列1第24位，该SNP位点0513的基因型为CC、TT或CT。
根据SNP所在的序列设计竞争性等位基因特异性PCR(KompetitiveAlellSpecific PCR)引物，简称KASP引物，包括：
正向引物0513-K1F：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCTCTGTCTCTTCTTCCTGTAACC(序列2)，且5'端标记FAM基团，用于检测SNP位点0513的核苷酸为C的SNP位点0513，
正向引物0513-K2F：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGCTCTGTCTCTTCTTCCTGTAACT(序列3)，且5'端标记HEX基团，用于检测SNP位点0513的核苷酸为T的SNP位点0513；
通用引物0513-KR CTCTAAAGAAACCATCCTCAGCAT(序列4)。
2、SNP分子标记鉴定持绿性状植物的方法的建立
1)提取待测样本的基因组DNA；
2)用上述KASP引物对上述基因组DNA进行扩增，检测扩增产物的基因型。
若扩增产物中SNP位点基因型为TT，则待测样本具有或候选具有持绿性；
若扩增产物中SNP位点基因型为CC或CT，则待测样本不具有或候选不具有持绿性。
二、SNP分子标记的应用
1、SNP分子标记鉴定
通过不同基因型不同表型的F2植株验证分子标记的实用性。
对野生型大白菜FT、大白菜突变体cl及二者杂交得到F1代的自交后代F2代91株个体进行SNP分子标记鉴定，检查分子标记的基因型(野生型基因型：CC；突变体基因型TT，CT代表非持绿基杂合基因型)在91个F2群体中的分布情况，具体如下：
1、采用CTAB法提取待测样本：野生型大白菜FT、大白菜突变体cl及F2代91株的叶片的基因组DNA。
2、以待测大白菜的基因组DNA为模板，利用KASP引物，进行KASP扩增反应；
KASP基因分型试验参照LGC的方法。反应总体系为5μL，包括2.5μL DNA模板(15ng/μL)，2.5μL V4.0 2KASP Master Mix(LGC Biosciences)，0.07μL引物混合物(12mol/L正向引物0513-K1F，12mol/L正向引物0513-K2F，30mol/L通用引物0513-KR，其中引物浓度均为在反应体系的终浓度)。反应条件如下：(1)94℃，15min，变性；(2)94℃，20s，61℃-55℃，1min，退火，共进行10个循环，每个循环退火温度降低0.6℃；(3)94℃，20s，55℃，1min，可进行26-31个循环。
反应在Scientific QuantStudioTM12K Flex实时PCR系统(Applied Biosystems)上进行。荧光信号的读取温度为37℃，时间为1min。利用SNP Viewer v2(LGC Biosciences)分析结果。
SNP标记在91个F2单株的基因型簇图如图3所示，其中带有FAM标签的SNP位点0513标记对应Allele1(CC基因型)，而带有HEX标签的SNP位点0513标记对应Allele2(TT基因型)，两种基因型在参试材料中能够明显地区分为两组，另外还有既有FAM标签又显示HEX标签的SNP位点0513标记对应TC基因型；可见，本发明的KASP引物对能够用于标记持绿性状的基因分型。
统计基因型结果如表1所示，且跟踪F2代91株个体在莲座期的持绿性状，可以看出，23份待测样本的SNP位点为TT基因型，均为持绿表型，鉴定表型准确率为100％；
63份待测样本的SNP位点为CC基因型，均为非持绿表型，鉴定表型准确率为100％；
5份待测样本的SNP位点为TC基因型，均为非持绿表型，鉴定表型准确率为100％。
上述结果表明，该分子标记或其对应的SNP可用于辅助检测待测白菜是否为持绿株系。
表1 SNP标记在cl与FT构建的F2群体中91个叶片颜色及对应的基因分型情况
Figure BDA0003399496230000061
Figure BDA0003399496230000071
Figure BDA0003399496230000081
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。
对比例、
一、对比例SNP分子标记的设计
为检测上述与持绿性状相关的SNP的特异性，利用上述野生型大白菜FT、大白菜突变体cl及二者杂交得到F1代的自交后代F2代基因组检测获得的纯合SNP标记，选择2个与持绿性状相关的SNP位点0513紧密连锁的SNP标记，分别为SNP20194801及SNP18246940，对不同表型的F2植株验证分子标记的实用性。
SNP20194801位点为序列表中序列5第30位，该SNP位点的基因型为CC、TT或CT。
SNP18246940位点为序列表中序列9第25位，该SNP位点的基因型为CC、TT或CT。
根据SNP所在的序列设计竞争性等位基因特异性PCR(KompetitiveAlellSpecific PCR)引物，简称KASP引物，包括：
(1)SNP20194801位点：
正向引物20194801-K1F：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGTTGGAAACGCATCTAGCTTAAC(序列6)，且5'端标记FAM基团，用于检测SNP20194801位点的核苷酸为C的SNP位点，
正向引物20194801-K2F：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGTTGGAAACGCATCTAGCTTAAT(序列7)，且5'端标记HEX基团，用于检测SNP20194801位点的核苷酸为T的SNP位点；
通用引物20194801-KR GCGTATAGTCTATCATACCGGAGC(序列8)。
(2)SNP18246940位点：
正向引物18246940-K1F：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAACTACCGCACATGCACGC(序列10)，且5'端标记FAM基团，用于检测SNP18246940位点的核苷酸为C的SNP位点，
正向引物18246940-K2F：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAACTACCGCACATGCACGT(序列11)，且5'端标记HEX基团，用于检测SNP18246940位点的核苷酸为T的SNP位点；
通用引物18246940-KR TGGACTAGTGTTGTATCGACGTTT(序列12)。
二、对比例SNP分子标记的鉴定应用
提取待测样本的基因组DNA；用上述KASP引物SNP20194801及SNP18246940对待测样本基因组DNA进行扩增，检测扩增产物的基因型。对野生型大白菜FT、大白菜突变体cl及二者杂交得到F1代的自交后代F2代91株个体基因型进行统计，且跟踪F2代91株个体在莲座期的持绿性状，可以看出，
SNP20194801标记在91个F2单株的基因型簇图如图4所示，统计基因型结果如表2所示，23份持绿表型待测样本，其SNP位点为TT(持绿纯合)基因型有6份，TC基因型(黄化杂合)10份，CC(黄化纯合)基因型7份，鉴定表型准确率为26％；
68份黄化表型待测样本，其SNP位点为TT(持绿纯合)基因型17份，TC基因型(黄化杂合)29份，CC(黄化纯合)基因型22份，鉴定表型准确率为75％；
SNP18246940标记在91个F2单株的基因型簇图如图5所示，统计基因型结果如表3所示，23份持绿表型待测样本，其SNP位点为TT(持绿纯合)基因型有5份，TC基因型(黄化杂合)11份，CC(黄化纯合)基因型7份，鉴定表型准确率为21％；
68份黄化表型待测样本，其SNP位点为TT(持绿纯合)基因型25份，TC基因型(黄化杂合)22份，CC(黄化纯合)基因型21份，鉴定表型准确率为63％；
上述结果表明，该SNP20194801分子标记及SNP18246940标记或其对应的SNP无法用于辅助检测待测白菜是否为持绿株系。
表2 SNP20194801标记在cl与FT构建的F2群体中91个叶片颜色及对应的基因分型情况
Figure BDA0003399496230000101
Figure BDA0003399496230000111
Figure BDA0003399496230000121
表3 SNP18246940标记在cl与FT构建的F2群体中91个叶片颜色及对应的基因分型情况
Figure BDA0003399496230000122
Figure BDA0003399496230000131
Figure BDA0003399496230000141
SEQUENCE LISTING
<110>沈阳农业大学
<120>与大白菜持绿性相关的SNP位点及其应用
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 65
<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> n is c, or t
<400> 5
gttttaggtt ggaaacgcat ctagcttaan aatgacagta acagctccgg tatgatagac 60
tatacgctc 69
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
gaaggtgacc aagttcatgc tggttggaaa cgcatctagc ttaac 45
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
gaaggtcgga gtcaacggat tggttggaaa cgcatctagc ttaat 45
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
gcgtatagtc tatcataccg gagc 24
<210> 9
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> n is c, or t
<400> 9
ttacgcaact accgcacatg cacgntgtcc ggtcgctacg tagcgaccga gcgtgcgttc 60
tgttcggtcg ctacgtagcg accgagctct tacgaaacgt cgatacaaca ctagtccatg 120
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
gaaggtgacc aagttcatgc taactaccgc acatgcacgc 40
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 11
gaaggtcgga gtcaacggat taactaccgc acatgcacgt 40
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
tggactagtg ttgtatcgac gttt 24

Claims (10)

1.检测SNP位点0513基因型的物质在鉴定或辅助鉴定待测大白菜是否具有持绿性中的应用；
所述SNP位点0513为序列表中序列1第24位。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述SNP位点0513基因型为CC、TT或CT。
3.检测SNP位点0513基因型的物质在选育具有持绿性状的大白菜中的应用；
所述SNP位点0513为序列表中序列1第24位。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：
所述检测SNP位点0513基因型的物质如下1)或2)：
1)KASP成套引物，
所述KASP成套引物由序列表中序列2所示的单链DNA分子或其衍生物、序列表中序列3所示的单链DNA分子或其衍生物和序列表中序列4所示的单链DNA分子或其衍生物组成；
2)含有所述成套引物的PCR试剂或试剂盒。
5.一种鉴定或辅助鉴定待测大白菜是否具有持绿性的方法，为检测大白菜基因组中SNP位点0513基因型是CC、TT或CT,
若待测大白菜中SNP位点0513基因型为TT，则待测大白菜具有或候选具有持绿性；
若待测大白菜中SNP位点0513基因型为CC或CT，则待测大白菜不具有或候选不具有持绿性；
或，一种选育具有持绿性大白菜的方法，为检测大白菜基因组中SNP位点0513基因型是CC、TT或CT,
选育SNP位点0513基因型为TT的待测大白菜，得到具有持绿性大白菜；
所述SNP位点0513为序列表中序列1第24位。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述检测大白菜基因组中SNP位点0513基因型是CC、TT或CT的方法，为如下A)或B)：
A)直接测序；
B)用权利要求4中的所述成套引物对所述待测大白菜基因组DNA进行KASP检测，实现基因分型。
7.一种成套引物，由序列表中序列2所示的单链DNA分子或其衍生物、序列表中序列3所示的单链DNA分子或其衍生物和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成；
所述序列2所示的单链DNA分子的衍生物为在序列2所示的单链DNA分子的5'端连接一种荧光序列；
所述序列3所示的单链DNA分子的衍生物为在序列3所示的单链DNA分子的5'端连接另一种荧光序列。
8.含有权利要求7所述成套引物的PCR试剂或试剂盒。
9.权利要求7所述的成套引物或权利要求8所述的PCR试剂或试剂盒在如下至少一种中的应用：
1)鉴定或辅助鉴定待测大白菜是否具有持绿性；
2)选育具有持绿性状的大白菜；
3)制备鉴定或辅助鉴定待测大白菜是否具有持绿性产品；
4)制备选育具有持绿性状的大白菜产品。
10.一种鉴定或辅助鉴定待测大白菜是否具有持绿性的方法，为用权利要求7所述的成套引物对大白菜进行KASP扩增，检测扩增产物，
若待测大白菜扩增产物仅显示序列3所示引物5'端连接荧光序列的颜色，则待测大白菜具有或候选具有持绿性；
若待测大白菜扩增产物仅显示序列2所示引物5'端连接荧光序列的颜色或显示序列3所示引物5'端连接荧光序列的颜色和序列2所示引物5'端连接另一种荧光序列的颜色，则待测大白菜不具有或候选不具有持绿性；
或，一种选育具有持绿性大白菜的方法，为用权利要求7所述的成套引物对大白菜进行KASP扩增，检测扩增产物，选育扩增产物仅显示序列3所示引物5'端连接荧光序列的颜色的待测大白菜，得到具有持绿性大白菜。
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