CN115786367B - 控制稻米谷蛋白含量基因lgc2及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了控制稻米谷蛋白含量基因LGC2及其应用，其CDS序列如SEQ ID NO.1所示，其蛋白序列如SEQ ID NO.2所示，并公开了该基因在培育低谷蛋白水稻中的应用。根据本发明LGC2基因，本发明通过基因编辑技术快速获得了2种水稻背景下的籽粒低谷蛋白的基因编辑水稻材料。此外，通过回交结合分子标记辅助选择精准的创制了其他农艺性状不变，籽粒谷蛋白降低的水稻新材料。为低谷蛋白功能水稻生物育种提供了新的基因遗传资源与技术支持，也可为其他作物类似研究提供借鉴。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域，具体涉及控制稻米谷蛋白含量基因LGC2及其应用。
背景技术
水稻作为东南亚国家第一大粮食作物，随着人民生活水平的提高，人们对稻米品质有了更高的消费需求，希望将常规饮食与食疗、保健相结合，通过饮食来提高健康水平和预防疾病。水稻蛋白质含量占粒重的10％左右,根据溶解度不同可以分为四种：碱溶性的谷蛋白、醇溶性的醇溶蛋白、水溶性的清蛋白以及盐溶性的球蛋白，其中谷蛋白占蛋白质总量的70％～80％，是水稻种子种含量最高且最容易被人体吸收的蛋白质。虽然谷蛋白含量越高的稻米营养价值越高，但对肾脏病人来说，长期食用高谷蛋白含量的稻米会增加肾脏的负担甚至导致氨中毒。目前生产上大规模推广的水稻品种谷蛋白含量较高，育成的低谷蛋白水稻品种较少，无法满足这类人群在蛋白代谢方面的特殊要求，因此，培育低谷蛋白水稻新品种作为食疗辅助品，对于肾病患者或出现肾功能障碍的患者这一特殊人群具有重大意义。低谷蛋白水稻育种已成为功能性水稻育种的一个热点，具有非常良好的市场应用前景。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供控制稻米谷蛋白含量基因LGC2及其应用的技术方案。
本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明第一方面提供了控制稻米谷蛋白含量基因LGC2，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明第二方面提供了LGC2基因的编码蛋白，该编码蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明第三方面提供了LGC2基因的突变基因lgc2，该基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
本发明第四方面提供了突变基因lgc2的编码蛋白，该编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明第五方面提供了LGC2基因或突变基因lgc2在培育低谷蛋白水稻中的应用。
本发明第六方面提供了含有上述LGC2基因靶点的基因编辑敲除载体CRISPR/Cas9-LGC2，所述LGC2基因靶点序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
本发明第七方面提供了含有上述基因编辑敲除载体的大肠杆菌DH5α和农杆菌EHA105基因工程菌株。
本发明第八方面提供了利用上述基因编辑敲除载体进行LGC2基因敲除获得的敲除LGC2基因的插入或缺失纯合突变体，突变体中LGC2基因的核苷酸序列突变体中LGC2基因核苷酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.13所示，突变体中LGC2基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.14所示。
本发明第九方面提供了一种低谷蛋白水稻材料的获得方法，该方法具体为利用上述基因编辑敲除载体在不同水稻材料中敲除LGC2基因，获得低谷蛋白水稻材料。
本发明第十方面提供了一种低谷蛋白水稻材料的获得方法，该方法包括以下步骤：
1)以含有如权利要求3所述突变基因lgc2的突变体材料为供体，与普通水稻杂交、回交并多代自交；
2)对突变体与普通水稻回交并多代自交的后代利用突变体突变位点与普通非突变体水稻材料DNA差异开发的特异性分子标记辅助选择，快速精准的获得低谷蛋白水稻材料；
所述分子标记为dCAPS-Pst1-F和dCAPS-Pst1-R，dCAPS-Pst1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，dCAPS-Pst1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
本发明具有以下有益效果：
针对目前存在的低谷蛋白水稻种质资源缺乏问题，本发明从水稻突变体库中筛选到一个低谷蛋白材料，并鉴定了控制稻米低谷蛋白含量的基因LGC2，通过基因编辑技术快速获得了2种水稻背景下的籽粒低谷蛋白的基因编辑水稻材料。此外，通过回交结合分子标记辅助选择精准的获得了其他农艺性状不变，籽粒谷蛋白降低的水稻新材料。为低谷蛋白功能水稻生物育种提供了新的基因遗传资源与技术支持，也可为其他作物类似研究提供借鉴。
附图说明
图1.(A)lgc2突变体中LGC2的基因结构及在Os07g0644100基因中一个SNP(T到C)导致第139位亮氨酸突变为脯氨酸。(B)利用Sanger测序检测到lgc2突变中Os07g0644100的第416位碱基C突变为T。(C)野生型ZH11和突变体lgc2籽粒谷蛋白,醇溶蛋白，清蛋白，球蛋白含量测定，数值表示为平均值±标准差，t检验统计差异显著性(P值标示)，柱形图中左侧为野生型ZH11，右侧为突变体lgc2。(D)野生型ZH11和突变体lgc2种子总蛋白SDS-PAGE分析，pGlu：57-kDa谷蛋白前体；αGlu：谷蛋白酸性亚基；aGlb：球蛋白；βGlu：谷蛋白碱性亚基；Pro：醇溶蛋白。
图2.(A)LGC2基因在水稻不同组织中的时空表达模式分析，数据表示为平均值±标准差(n＝3)。(B)LGC2基因启动子在水稻不同组织中GUS染色分析，比例尺＝2毫米。
图3.(A)本发明用到的基因编辑载体CRISPR/Cas9-LGC2的线性示意图。(B)基因编辑载体CRISPR/Cas9-LGC2的环状示意图。
图4.利用CRISPR/Cas9在华占背景下编辑LGC2基因获得纯合突变体。(A)LGC2基因靶位点突变示意图。(B)华占和敲除突变体cr-lgc2-hz种子总蛋白SDS-PAGE分析。(C)华占和敲除突变体cr-lgc2-hz种子总蛋白含量,数值表示为平均值±标准差，t检验统计差异显著性(P值标示)。
图5.利用CRISPR/Cas9在宁粳1号背景下编辑LGC2基因获得纯合突变体。(A)LGC2基因靶位点突变示意图。(B)宁粳1号和敲除突变体cr-lgc2-nj1种子总蛋白SDS-PAGE分析。(C)宁粳1号和敲除突变体cr-lgc2-nj1种子总蛋白含量,数值表示为平均值±标准差，t检验统计差异显著性(P值标示)。
图6.突变体lgc2与93-11回交自交后的BC3F3群体的dCAPS分子标记电泳检测。红色框表示lgc2纯合突变的单株(泳道-4，9,15,16,18)，杂合单株在图中显示为三条带,LGC2的93-11基因型单株在图中显示为两条带,
图7.图6中BC3F3群体的部分单株SDS-PAGE分析，红色框指示筛选出的低谷蛋白含量的单株(单株-2，7，13分别对应图6中泳道-15,16,18)。
图8.(A)9311和近等基因系9311lgc2种子总蛋白SDS-PAGE分析。(B)9311和近等基因系9311lgc2种子总蛋白含量。数值表示为平均值±标准差，t检验统计差异显著性(P值标示)。
具体实施方式
为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1：低谷蛋白材料的筛选和鉴定
(1)SDS-PAGE分析谷蛋白含量
从粳稻品种中花11经EMS诱变获得的突变体库中单株收种脱粒，每个单株各取一粒成熟种子，放入2.0毫升离心管中加入一颗钢珠，于打样机70赫兹频率碾碎后，加入700微升蛋白提取液(8mol/L尿素，4％ SDS，5％β-巯基乙醇，20％甘油，50mmol/L Tris-HCl pH＝6.8，少量溴酚蓝指示剂)，涡旋混匀，放入50℃烘箱静置6小时，期间颠倒样品几次以提取充分，12000r/min离心5分钟，取5微升上清进行聚丙烯凝胶电泳SDS-PAGE分析，电泳完成后用考马斯亮蓝R250染色，脱色液脱色后观察，拍照。如图1所示，经SDS-PAGE筛选获得一个低谷蛋白水稻突变体，命名为lgc2。
(2)PCR测序
采用高效植物基因组DNA提取试剂盒，对中花11单株和筛选获得的低谷蛋白突变体lgc2提取高质量基因组DNA，进行全基因组测序，测序深度为20X以上，进行全基因组比对分析，发现基因Os07g0644100第一外显子第416位碱基T突变为C，导致第139位亮氨酸突变为脯氨酸(如图1A，B所示)。将该基因命名为LGC2。经分析，本实施例中基因LGC2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。突变基因lgc2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
(3)实时荧光定量PCR
采用SYBR Green Real-time PCR Master Mix(Toyobo)试剂盒进行实时荧光定量PCR检测，反应体系如下：2x SYBR Premix Ex Taq II 10微升，10μMPCRForward Primer 2微升，10μM PCR Reverse Primer 2微升,cDNA模板4微升,用水添至20微升。PCR程序为：95℃3分钟；95℃30秒，95℃5秒，60℃30秒，循环数为40；60℃5分钟。分析LGC2基因在各组织中的表达量。结果显示LGC2基因呈组成型表达，且在发育的种子中表达量较高(如图2A所示)。
(4)组织GUS染色
取野生型ZH11和Pro-LGC2：：GUS转基因T0代阳性植株的不同新鲜组织(根、茎、叶、叶鞘、穗、小花和不同发育时期的胚乳)，将根、茎、叶、叶鞘切成3～5厘米的小片段，将不同发育时期的种子去壳，用锋利的刀片横切或纵切，置于合适大小的离心管中，加入没过体积的X-Glu染色液,锡箔纸包裹遮光，放入37℃培养箱孵育染色，染色时间根据着色程度适当调整。染色完成后无水乙醇进行脱色，拍照。GUS染色结果如图2B所示，发育的种子染色较深，表示LGC2基因在发育的种子中表达量相对较高。
X-Glu染色液组分：
将以上成分溶解在50mM磷酸钠缓冲液里，定容到100mL，混匀后进行分装，用锡箔纸包好(或装入棕色瓶)，放入4℃冰箱里避光保存。
(5)分类蛋白的提取和含量测定
a)称取3.0克米粉于50毫升圆底离心管中，加入30毫升蒸馏水，室温下磁力搅拌4小时(200rpm/min)，10000rpm离心10分钟，弃上清，重复提取3次，留沉淀；
b)提取过清蛋白的米粉沉淀中加入30毫升5％ NaCl，磁力搅拌4小时(200rpm/min),10000rpm离心10分钟，弃上清，重复提取3次，留沉淀；
c)提取过球蛋白的米粉沉淀中加入30毫升70％乙醇，磁力搅拌4小时(200rpm/min)，10000rpm离心10分钟，弃上清，重复提取3次，留沉淀；
d)提取过醇溶蛋白的米粉沉淀中加入30毫升0.1mol/L NaOH，4℃磁力搅拌2小时(200rpm/min)，10000rpm 4℃离心10分钟，将上清液倒入100毫升容量瓶中，重复提取3次，合并提取液，提取液定容至100毫升。移取3毫升到消化管中，加入5毫升浓硫酸，置于420℃的消化炉上，消化60分钟。冷却后加入200微升浓度为30％双氧水加热至样品无色。冷却后定容至100毫升，混匀后取3毫升参照凯氏定氮法测定。测定结果显示，lgc2突变体中谷蛋白含量显著下降(如图1C和1D所示)。
实施例2：低谷蛋白基因编辑材料的创制
(1)基因编辑背景材料选取
基因编辑背景材料为粳稻宁粳1号和籼稻华占。
(2)gRNA靶位点设计
应用在线网站http://crispr.dbcls.jp/设计LGC2基因的两条gRNA靶点引物序列，得到以下引物，LGC2-gRNA-F1：5’tgtgtgTCCCCGACTTCCCGACCCTC 3’(SEQ ID NO.17)；LGC2-gRNA-R1：5’aaacGAGGGTCGGGAAGTCGGGGAca 3’(SEQ ID NO.18)。LGC2-gRNA-F2：5’tgtgtgGGAGAGCGCGCACCAGTCG 3’(SEQ ID NO.19)；LGC2-gRNA-R2：5’aaacCGACTGGTGCGCGCTCTCCca 3’(SEQ ID NO.20)。
(3)将上述gRNA序列经过PCR反应制成二聚体后与线性载体CRISP-Cas9连接，转化大肠杆菌DH5a，挑取单克隆测序获得CRISP-Cas9-LGC2基因编辑载体(如图3所示)。转化至农杆菌EHA105。该CRISP-Cas9-LGC2基因编辑载体包含的LGC2基因靶点序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
(4)将携带CRISP-Cas9-LGC2基因编辑载体的农杆菌转化到受体华占(HZ)的愈伤中，经潮霉素筛选和靶位点测序获得LGC2纯合突变的基因编辑植株(如图4A所示)，对种子经过SDS-PAGE筛选和谷蛋白含量测定，获得种子谷蛋白含量低于4％的基因编辑单株和株系(如图4B,C所示)。经测序，突变体植株中LGC2基因核苷酸序列如SEQ ID NO.7(HZ-lgc2-1)和SEQ ID NO.9(HZ-lgc2-2)所示，突变体植株中LGC2基因编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.8(HZ-lgc2-1)和SEQ ID NO.10(HZ-lgc2-2)所示。
(5)将携带CRISP-Cas9-LGC2基因编辑载体的农杆菌转化到受体宁粳1号(NJ1)的愈伤中，经潮霉素筛选和靶位点测序获得LGC2纯合突变的基因编辑植株(如图5A所示)，对种子经过SDS-PAGE筛选和谷蛋白含量测定，获得种子谷蛋白含量低于4％的基因编辑单株和株系(如图5B,C所示)。经测序，突变体植株中LGC2基因核苷酸序列如SEQ ID NO.11(NJ1-lgc2-1)和SEQ ID NO.13(NJ1-lgc2-2)所示，突变体植株中LGC2基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.12(NJ1-lgc2-1)和SEQ ID NO.14(NJ1-lgc2-2)所示。
上述得到的株系均可作为中间材料，可应用于低谷蛋白品种选育。
实施例3：93-11背景下lgc2近等基因系创制
(1)DNA的提取：用CTAB法提取待测水稻植株的叶片DNA备用。稀释DNA，制备DNA工作溶液，其浓度为50～100ng/uL左右，4℃冰箱保存备用。
(2)通过lgc2突变位点与普通非突变体水稻材料如ZH11的DNA差异开发特异性dCAPS分子标记。由于LGC2基因第1个外显子第416位处的C变为G，引入PstI酶切位点，设计的低谷蛋白dCAPS-Pst1分子标记检测引物F：dCAPS-Pst1-F 5’-ATGATGAGGCGAAGCGGCGC-3’(SEQ ID NO.15所示)；引物R：dCAPS-Pst1-R：5’-TCACCTTCACCTTCCCCTGC-3’(SEQ ID NO.16所示)。
(3)采用以上dCAPS-Pst1标记引物对从待测植株提取到的叶片DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行酶切后于琼脂糖凝胶电泳检测进行基因型筛选：如图6所示，PCR扩增可得到111bp的片段。将该PCR产物在37℃下经PstI酶切30分钟后，酶切产物经过3％琼脂糖凝胶电泳分析。如果在其对应LGC2基因第1个外显子第416位处具有T到C的碱基突变，导致CTGCAG被突变成CTGCGG，则此点突变造成了该位置处引进的限制性内切酶PstI的酶切位点丧失。因此，酶切结果只有111bp一条谱带，判断植株为LGC2基因型纯合单株(如图6中方框所示)；若出现90bp和21bp两条谱带，判断植株为野生型；有三条谱带，判断植株为LGC2基因型杂合的(如图6所示)。
(4)以籼稻93-11为轮回亲本，以lgc2为供体亲本，杂交获得F1代种子，并与93-11连续回交3代，并自交2代，获得BC3F3群体。
(5)在BC3F3群体中筛选株型与93-11相似的单株，然后采用dCAPS-Pst1分子标记对单株进行LGC2基因型检测，筛选得到LGC2纯合突变的单株，收种后进行SDS-PAGE分析和谷蛋白含量测定，筛选出籽粒中谷蛋白含量低于4％的水稻材料，即为93-11背景下lgc2的近等基因系。经分析，如图7所示，单株-2，7和13为93-11背景下lgc2的近等基因系，将其重新命名为9311lgc2-1，9311lgc2-2，9311lgc2-3。经测定，近等基因系9311lgc2-1，9311lgc2-2，9311lgc2-3中谷蛋白含量低于4％(如图8所示)。
综上所述,LGC2为控制稻米谷蛋白含量的基因，该基因突变导致谷蛋白含量下降。通过基因编辑创制了在宁粳1号和华占2种背景下的低谷蛋白含量的水稻材料NJ1-lgc2-1，NJ1-lgc2-1和HZ-lgc2-1，HZ-lgc2-2。通过与籼稻93-11多次回交、自交并经分子标记筛选获得93-11背景下lgc2的近等基因系，这些株系是用于培育低谷蛋白功能稻米的理想遗传材料。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (9)
1.控制稻米谷蛋白含量基因LGC2在培育低谷蛋白水稻中的应用，所述控制稻米谷蛋白含量基因LGC2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.控制稻米谷蛋白含量基因LGC2的突变基因lgc2，其特征在于该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.如权利要求2所述突变基因的编码蛋白，其特征在于该编码蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.4所示。
4.如权利要求2所述突变基因在培育低谷蛋白水稻中的应用。
5.含有控制稻米谷蛋白含量基因LGC2基因靶点的基因编辑敲除载体CRISPR/Cas9-LGC2，所述LGC2基因靶点序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示，所述控制稻米谷蛋白含量基因LGC2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.含有如权利要求5所述基因编辑敲除载体的大肠杆菌DH5α和农杆菌EHA105基因工程菌株。
7.利用权利要求5所述的基因编辑敲除载体进行LGC2基因敲除获得的敲除LGC2基因的插入或缺失纯合突变体，突变体中LGC2基因的核苷酸序列突变体中LGC2基因核苷酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.13所示，突变体中LGC2基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.14所示。
8.一种低谷蛋白水稻材料的获得方法，其特征在于利用权利要求5或6所述基因编辑敲除载体在不同水稻材料中敲除LGC2基因，获得低谷蛋白水稻材料。
9.一种低谷蛋白水稻材料的获得方法，其特征在于包括以下步骤：
1）以含有如权利要求2所述突变基因lgc2的突变体材料为供体，与普通水稻杂交、回交并多代自交；
2）对突变体与普通水稻回交并多代自交的后代利用突变体突变位点与普通非突变体水稻材料DNA差异开发的特异性分子标记辅助选择，快速精准的获得低谷蛋白水稻材料；
所述分子标记为dCAPS-Pst1-F和dCAPS-Pst1-R，dCAPS-Pst1-F的核苷酸序列如 SEQID NO.15所示，dCAPS-Pst1-R的核苷酸序列如 SEQ ID NO.16所示。
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