CN112521468A - 一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsGPA10及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsGPA10及其编码基因与应用。本发明通过水稻谷蛋白分选突变体gpa10的表型分析和目标基因的初步定位，最终克隆得到谷蛋白分选相关蛋白OsGPA10，该相关蛋白由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成，或将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且仍具有谷蛋白分选相关的由序列SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。本发明的谷蛋白分选相关蛋白影响水稻胚乳中谷蛋白的分选过程，将所述蛋白的编码基因导入成熟谷蛋白含量降低的植物中，可以得到成熟谷蛋白含量正常的转基因植物，因此，本发明所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

Description

一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsGPA10及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsGPA10及其编码基因与应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一。随着第一次绿色革命和杂交稻的大面积推广，我国稻米总产量得到了两次分跃。但我国稻米品质整体水平欠佳，远远不能满足人民群众对稻米食味、营养品质日益增长的需求，导致“国产稻米粮满仓”与大米进口不断增长的矛盾日益突出。因我过稻米品质育种急需加强。淀粉是稻米中最主要的营养物质，是影响稻米食味品质的最重要因素。贮藏蛋白作为稻米的第二大营养物质，他的含量和组成也直接影响稻米食味品质和营养价值，但长期以来稻米蛋白品质育种受重视程度不够。谷蛋白是稻米中最重要的贮藏蛋白，是稻米蛋白品质改良的首选目标。因此，解析水稻谷蛋白合成、转运、加工和积累的分子机制对稻米的品质改良至关重要。

57H突变体是稻米蛋白品质改良研究的良好遗传材料。目前已经克隆了8个调控谷蛋白分选的关键基因，并初步描绘了谷蛋白分选的分子途径，但谷蛋白分选的确切机理我们仍知之甚少。本发明人从粳稻品种宁粳3号的辐射突变体库中筛选到一个新的突变体gpa10，OsGPA10有 3 个 Login-like 结构域，参与膜的动态调节。目前尚无报道关于含有Login-like 结构域蛋白参与水稻谷蛋白分选的研究。

发明内容

本发明通过水稻谷蛋白分选突变体gpa10的表型分析和目标基因的初步定位，最终克隆得到谷蛋白分选相关蛋白OsGPA10，因而本发明提供一种谷蛋白分选相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明提供的谷蛋白分选相关蛋白（OsGPA10），来源于稻属水稻（Oryza sativavar.Kitaaake），是如下（a）或（b）的蛋白质：

（a）由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且仍具有所述功能的衍生蛋白质。

SEQ ID NO.1所示序列由567个氨基酸残基组成，自氨基末端第137至258位，第296至393位，第453至554位为Longin结构域。

为了使（a）中的OsGPA10便于纯化，可在由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1 标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述（b）中的OsGPA10可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的OsGPA10的编码基因可通过将SEQ ID NO.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5´端和/或3´端连上表1所示的标签的编码序列得到。

同时，本发明还提供编码上述贮藏蛋白分选相关蛋白的基因（OsGPA10）。

所述基因OsGPA10可为如下1）或2）或3）或4）的DNA分子：

1）序列表中序列2所示的DNA分子；

2）序列表中SEQ ID NO.3所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4）与1）或2）或3）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码谷蛋白分选相关蛋白的DNA分子。

SEQ ID NO.2由2133个核苷酸组成。

所述严格条件可为在0.1×SSPE (或 0.1×SSC)，0.1% SDS的溶液中，在65^oC下杂交并洗膜。

含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin），它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体可为在pCAMBIA1305.1载体(http://www.cambia.org/daisy/cambia/585) 的多克隆位点SmaI之间重组插入所述基因（OsGPA10）得到的重组质粒。所述重组质粒具体可为pCAMBIA1305.1-OsGPA10；所述pCAMBIA1305.1-OsGPA10是将由OsGPA10基因组编码序列连同上游2174bp的启动子区和下游1424bp的片段通过重组技术插入到pCAMBIA1305.1多克隆位点SmaI之间得到的(Clontech公司，Infusion重组试剂盒)。

将含有OsGPA10的pCAMBIA1305.1命名为pCAMBIA1305.1-OsGPA10。

含有以上任一所述基因（OsGPA10）的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

本发明还提供一种培育谷蛋白分选正常的转基因植物的方法。

本发明提供的培育谷蛋白分选正常的转基因植物的方法，是将所述基因导入谷蛋白分选异常的植物中，得到谷蛋白分选正常的转基因植物；所述谷蛋白分选异常植物为胚乳中谷蛋白前体剧增并伴随成熟谷蛋白含量降低的植物；所述谷蛋白分选正常的转基因植物为谷蛋白前体能被正常加工成为成熟谷蛋白的转基因植物。具体来说，所述基因通过所述重组表达载体导入谷蛋白分选异常植物中；所述谷蛋白分选异常植物可为gpa10。

所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述方法均可应用于水稻育种。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

本发明的谷蛋白分选相关蛋白影响水稻胚乳中谷蛋白的分选过程。将所述蛋白的编码基因导入成熟谷蛋白含量降低的植物中，可以得到成熟谷蛋白含量正常的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

附图说明

图1野生型宁粳3号和突变体gpa10的外观表型，其中，A为宁粳3号和gpa10干种子以及胚乳横切表型，B为宁粳3号和gpa10胚乳横切扫描电镜图片；

图2野生型宁粳3号和突变体gpa10 SDS-PAGE和Western blot分析，其中，A为宁粳3号和gpa10胚乳储藏蛋白组分SDS-PAGE图，B为宁粳3号和gpa10谷蛋白和球蛋白Western-Blot分析图；

图3野生型宁粳3号和突变体gpa10发育胚乳的半薄切片观察，其中，A-C分别为宁粳3号和为gpa10的考马斯亮蓝染色观察，D-F分别为宁粳3号和为gpa10 的免疫荧光观察；

图4野生型宁粳3号和突变体gpa10发育胚乳的免疫胶体金观察，其中，A、B为宁粳3号和gpa10发育中期胚乳中致密囊泡和高尔基体的形态结构，C、D为宁粳3号和gpa10发育中期胚乳中胞外空间结构，E、F、G为gpa10发育中期胚乳中壁旁体（PMB）异常结构，H、I、J为gpa10发育中期胚乳中蛋白体II（PBII）形态结构；

图5突变基因的图位克隆，其中，A为gpa10的精细定位图，B为gpa10的突变位点，C为宁粳3号和gpa10目的基因扩增；

图6转基因互补株系的表型分析，其中，A为宁粳3号和转基因互补家系目的基因测序结果，B为宁粳3号和gpa10以及转基因互补家系胚乳横切，C为宁粳3号和gpa10以及转基因互补家系贮藏蛋白组分图；

图7pCAMBIA1305.1载体图谱。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1：水稻中谷蛋白分选相关蛋白及其编码基因的发现

一、水稻谷蛋白分选突变体gpa10的表型分析

在粳稻品种宁粳3号的⁶⁰Co辐射突变体库中筛选出籽粒粉质的突变株系gpa10。与野生型相比，gpa10的主要特征是籽粒粉质，不透明（见图1A）。扫描电镜分析证实gpa10中淀粉颗粒松散，可能是导致胚乳粉质不透明的主要原因（见图1B）。gpa10种子蛋白的SDS-PAGE图谱显示谷蛋白57 kDa前体增加，相应成熟的谷蛋白酸性亚基和碱性亚基含量降低，同时球蛋白含量也有所降低（见图2A）；Western blot分析进一步验证了上述变化（见图2B）。

发育中期胚乳半薄切片经过考马斯亮蓝染色以及免疫荧光观察发现，野生型存在两类蛋白体，球形的蛋白体I和不规则形状的蛋白体II，蛋白体II略大于蛋白体I（见图3A和3D，白色三角标示蛋白体I，黑色三角和箭头标示蛋白体II）。有趣的是，在gpa10中除上述两种蛋白体外，在细胞壁附件还发现一类填充有大量蛋白质的壁旁体类结构（见图3C和3F，星号标示）。此外，gpa10中蛋白体II相比野生型明显填充不完全（见图3B和3E，三角标示）。上述结果表明gpa10突变体中蛋白体II发育异常，大量蛋白质填充在细胞壁附近形成的壁旁体类结构中。

为了解析壁旁体类结构的形成过程，利用透射电镜结合免疫胶体金技术观察了发育中期的胚乳（见图4）。研究表明谷蛋白的后高尔基体运输由一类称之为致密囊泡的运输工具介导完成（图4A）。和野生型一样，突变体gpa10中致密囊泡可以从高尔基体正常出芽（图4A和4B）。然而，有趣的是，gpa10中大量致密囊泡错误分选到胞外体空间（图4D），逐渐积累并形成大的壁旁体类结构（图4E-4G），因此，导致gpa10中的蛋白体II填充不完全（图4I-4J）。

综上所述，上述结果证实gpa10中负责运输谷蛋白的致密囊泡发生错误分选，进而导致大量谷蛋白前体进入胞外体空间而不能被切割为成熟的酸性亚基和碱性亚基。

二、目标基因定位

1、目标基因的初步定位

利用突变体gpa10与广亲和品种9311（购自中国农业科学院作物科学研究所种质资源库）杂交，在gpa10/9311的F2分离群体中选取10粒gpa10表型（籽粒粉质不透明且谷蛋白前体增加）的隐性极端个体，抽提种子DNA。利用覆盖水稻全基因组的182对InDel及SSR标记进行连锁分析，将负责gpa10突变体表型的突变基因定位在第1号染色体InDel标记S15和S18之间，物理距离为389.9kb。

2、目标基因的精细定位

依据初定位结果，在InDel标记S15和SSR标记S18之间寻找公共图谱上的分子标记，并依据NCBI公布的水稻基因组序列信息在此区间自行开发InDel标记。利用58个隐性极端个体对目标基因进行了精细定位（用于精细定位的分子标记见表2）。

表2 用于精细定位的分子标记

最终将目标基因OsGPA10精细定位在InDel标记S186和SSR标记S18之间，物理距离为92.6 kb（图5A）。经过对该区间内基因进行测序，发现第8个ORF的第9个外显子上存在5个单碱基的缺失，使得目标蛋白翻译提前终止（图5B和5C）。

三、目标基因OsGPA10的获得

提取粳稻品种宁粳3号叶片cDNA，以cDNA为模板，采用引物primer1和引物primer2进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，测序结果如SEQ ID NO.2所示，其编码的蛋白质如SEQID NO.1所示。

primer1：5'-ATGGATATGGATCCTCCCACCAA-3'；

primer2：5'-TCACCAGGAAAGGGTGCTTTCTC-3'。

将SEQ ID NO.1所示的蛋白质命名为OsGPA10蛋白，由567个氨基酸残基组成。将编码OsGPA10蛋白的基因命名为OsGPA10基因，其开放阅读框如SEQ ID NO.2所示。

实施例2：OsGPA10蛋白及其编码基因的应用

一、基因组互补载体的构建

将pCAMBIA1305.1载体（参考文献：He Gao, Mingna Jin, et al., Days to heading 7, a major quantitative locus determining photoperiod sensitivity andregional adaptation in rice. Proc Natl Acad Sci USA,2014, 111(46): 16337-16342）的EcoRI和NcoI酶切位点之间的小片段替换为序列表中SEQ ID NO.3所示的双链DNA分子（包括OsGPA10基因上游2.1kb的启动子序列和下游1.4kb的终止子序列），得到pCAMBIA1305.1-OsGPA10基因组互补载体（已测序验证），pCAMBIA1305.1载体图谱见图7。

二、过表达转基因植物的获得

1、将步骤一得到的pCAMBIA1305.1-OsGPA10过表达载体导入农杆菌EHA105菌株（美国英俊公司），得到重组农杆菌。

2、采用步骤1得到的重组农杆菌转化粳稻品种kitaake（野生型），具体步骤如下：

（1）取步骤1得到的重组农杆菌菌体，采用N6液体培养基（Sigma公司，C1416）重悬并调整菌液OD_600nm为0.5。

（2）将培养至一个月的粳稻品种kitaake（野生型）成熟胚胚性愈伤组织在步骤（1）得到的菌液中侵染30 min，滤纸吸干菌液后转入含有10 g/L 琼脂的固体N6培养基（Sigma公司，C1416）中，24℃共培养3天；

（3）将步骤（2）培养的愈伤组织接种在含有10 g/L 琼脂，100 mg/L潮霉素的固体筛选N6固体培养基（Sigma公司，C1416）上培养16天（第一次筛选）；

（4）将步骤（3）培养后的健康愈伤组织接种在含有10 g/L 琼脂，100 mg/L潮霉素的固体筛选N6培养基（Sigma公司，C1416）上培养15天（第二次筛选）；

（5）将步骤（4）培养后的健康愈伤组织接种在含有10 g/L 琼脂，100 mg/L潮霉素的固体筛选N6培养基（Sigma公司，C1416）上培养15天（第三次筛选）；

（6）将步骤（4）培养后的健康愈伤组织接种在分化培养基（PhytoTechnologyLaboratories 公司，M524）上分化，得到T₀代植株。

3、对步骤2得到的T₀代植株进行鉴定，提取待测植株叶片的总DNA，采用引物primer3和引物primer4进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，缺失位点后为双峰的为转基因阳性植株（结果如图6A所示）。

primer3：5'- GTGTGAGCACAAGGTTTGTCC -3'；

primer4：5'- ATCACACCTCAATACATTAGCACT-3'。

三、表型鉴定

分别将T0代转pCAMBIA1305.1-OsGPA10植株，gpa10和野生型宁粳3号种植在中国农业科学院转基因试验田内。结果显示转基因株系T2种子中出现了透明的籽粒（图6B），SDS-PAGE检测透明种子（L1，L2和L3）与野生型表现一样。由此验证了转基因前的不透明粉质和谷蛋白前体增加性状是由OsGPA10基因控制的，即该OsGPA10基因为谷蛋白分选相关基因。将pCAMBIA1305.1-OsGPA10转化水稻gpa10突变体，可以使其成熟谷蛋白含量上升至正常水平（图6C）。

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsGPA10及其编码基因与应用

<160> 3

<210> 1

<211> 567

<212> 氨基酸

<400> 1

MDMDPPTNNP SPPGPPDSPP PEKRLASLSL RTSHLPPDFE IHDDYDDDDD EGYLTAVSRVGSISTSASAW KDDLEDADVA PPSPSSSGYA AERGTSLASS AAANDDPQPQ PDDDDWPRDK KHLHEDDTSASWRKRKKHFF ILSNSGKPIY SRYGDEHKLA GFSATLQAII SFVENSGDHI KFVRAAKHQI VFLVKGPIYLVCISCTEESY EGLRGQLELM YGQMLLILTK SVNRCFEKNP KFDMAPLLGG TDAVFLSLIH AFSWNPATFLHAYTCLPLAQ STRQAASAVL QDIADSGVLF ALLMCEHKVI SLVGAQKATL HPDDIFLLSN FILSSESFRTSESFSPICLP RYNSMAFLYA YVHFFDENTY LTLLTARSDA FYDLKDSRSR IQNVLLKANV LVEVQRSLRESALRIEDLPA DPSSQSVSPP PQFSQDLHFQ LLSSEMAIGG PAGLWHFIYK SIYLDQYVSS EFPLIISNPKQQKRLYKAYQ KLYASMHDKA TGPHKTQFRR DEDYVLFCWI TQDFELYAAF NPLADKSQAI KVCNRVCQWIRDLENEIFVY GESTLSW

<210> 2

<211> 1701

<212> DNA

<400> 2

1 atggatatgg atcctcccac caataaccct agcccccctg gtccccccga ctccccgccg

61 ccggagaaga ggctcgcctc cctctccctc cgcacctctc acctccctcc cgacttcgag

121 atccacgacg actacgacga cgacgacgac gagggctacc tcactgccgt ctccagggta

181 gggagcatca gcacctccgc ctccgcctgg aaggacgacc tcgaagacgc cgacgtggct

241 ccacccagcc ccagcagcag cggctacgcc gccgagaggg gcaccagcct cgcctccagc

301 gccgccgcca acgacgatcc ccaaccccaa cccgacgacg acgattggcc ccgcgacaag

361 aagcatctcc acgaggacga tacttctgct tcatggcgca aacggaaaaa gcacttcttc

421 atcttgagca attctggcaa gccaatttat tctaggtatg gagatgagca taagcttgct

481 gggttttccg ccacgttgca agcaatcatt tctttcgttg agaacagtgg tgaccatatc

541 aaatttgtaa gggctgccaa acatcagata gttttccttg tcaagggtcc aatatactta

601 gtttgtataa gttgcactga agagtcatat gaaggattga ggggacaact agagctcatg

661 tatggtcaga tgctgctgat tttgaccaag tctgtcaaca gatgctttga gaagaaccct

721 aaatttgata tggcaccatt gctaggtggc acagatgcag ttttcctatc acttatacat

781 gcattcagct ggaatcctgc tacatttctt catgcgtaca catgccttcc cctcgcccaa

841 tccacaaggc aggcggctag tgcagtttta caagacattg ctgattcagg agttttgttt

901 gcactgttga tgtgtgagca caaggttatt agtctagtgg gagcacaaaa ggcaactttg

961 catcctgatg atatttttct actttcaaat ttcatattgt cctctgaatc ttttaggact

1021 tcggagtctt tttcacccat atgccttcca agatacaatt ctatggcttt cttatatgct

1081 tatgttcatt tttttgatga aaatacatac ttgacacttc ttactgcaag atcagacgcc

1141 ttttatgatc tgaaagattc caggtcccgc attcagaatg ttctcttgaa ggcaaatgtc

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<210> 3

<211> 8568

<212> DNA

<400> 3

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61 tgatttatat gggatttggg acagaggaag tatcaaatgt gacatatcca aaaatgggaa

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2761 acgtatgaaa aacaaacagt gaattgtatt taataaataa atcaaaatac aatacctttt

2821 ctgttgcttt ggattgctta tgattaaggg gaactcagat gatacatatt gatcaaggta

2881 aatgctttta tatataaaat gccaaagtcc agctggtcca ccaattgcca tttcagaaga

2941 taataactga aagtgcagat cttgagagaa ctgtggaggt ggtgatacag attgagaaga

3001 tggatcagca gggagatctt caatgcgcag tgcgctctca cgcagagacc tttggacttc

3061 cacaaggaca tttgccttca agagaacatt ctgaatgcgg gacctacaca atgttcataa

3121 aagggaaagg aaattaattc catatacact taagacagga catgctcagg catcatgata

3181 tttttaagag acgtggtcac ttgattgtat agctcacctg gaatctttca gatcataaaa

3241 ggcgtctgat cttgcagtaa gaagtgtcaa gtatgtattt tcctgccatg aattaaataa

3301 gattacttaa gaagctacaa tatagtttcc ccctcaaata tgatacaaat tatataatga

3361 atgattagaa gcatggccct gcactcgcca attctattca ttcatatgtt ttgtccaaaa

3421 gttgaattcc cctataggaa aaagaaaagg agtcccagca tgctaggtgc ttagtatttt

3481 ttacaggacc tggattctta ctccgatttt gcccctcaac actgttttct tttatatttg

3541 tcttctctac attcctctct accaacactg tcattatgca tcaccctcat ttccattgat

3601 cctcagtttt caacatgcat atttcaagct caaggttttt cgaagtgtta ctgcgattgt

3661 tgactatgta gaccatgctt cgtaaaatat aaattgttgt ctgtagagag gaaaatggac

3721 aatagacaaa gaggccaact aagctaaagt tcagcaaggg agataaaagg cattatagta

3781 tgatctgctg agggcaagac tttgcttttc ttttagttca aagcttaatt aacctaacca

3841 acagtaaaga ttcaatagtg aggaaattta gtctaatatg aggacagatc aaactgagat

3901 atcacacctc aatacattag cactatttat tgtacttata agttatttcg acacagatta

3961 aaaagcatac atattcagat gatatatttg actcacatca aaaaaatgaa cataagcata

4021 taagaaagcc atagaattgt atcttggaag gcatatgggt gaaaaagact ccgaagtcct

4081 gcattaaaga aaatgtagta agaacgtctc aaagtaaaga ttaccatttc agagtgtgtg

4141 tcgtgatgat tacctaaaag attcagagga caatatgaaa tttgaaagta gaaaaatatc

4201 atcaggatgc aaagttgcct tttgtgctcc cactagacta ataacctgaa aaataacaaa

4261 gaatgaaatc ccagaaacac gaacaagtag gattgaagag aaagatcgag gacaggccct

4321 atcttagcct gcctcaggat gggatgctag cagcacataa caaacctaga tagacagaac

4381 aaagagcgag acatacagat ccttttgtaa aattataggg caaagaacta cagataattg

4441 ttggctgaag cgtgggacgg cgacaaaacg aatgacgcct cataaagacc ttaacagaat

4501 tgtaaattca gcatagttaa ggacataagg tgaagacatg tcaggtttgg ttaaccaata

4561 aaaatgacga gagataccat tgtatatagt atatacgcat ctctaataga tgaatgtgga

4621 catgtggtac ctaaattgtg ctcagaaatt cagcacacta aacttaaata cttcatttat

4681 gcccaaaaag tcacataatt taatatccca gtaaaagttt tccctggcgt gaaaatggac

4741 aaaccttgtg ctcacacatc aacagtgcaa acaaaactcc tgaatcagca atgtcttgta

4801 aaactgcact agccgcctgc cttgtggatt gggcgagggg aaggcatgtg tacgcatgaa

4861 gaaatgtagc aggattcctg cagaatggtt tggtgagatt tagttgggca actagagtgt

4921 aaaatatttc aggcaaagga aaaaacaaaa ctgaccagct gaatgcatgt ataagtgata

4981 ggaaaactgc atctgtgcca cctagcaatg gtgccatatc aaatttaggg ttcttctcaa

5041 agcatctgtt gacagacttg gtcaaaatca gcagcatcta caaattaaat tttcagatag

5101 agaaatctgg atgagaactt tagaaagtaa gtttgtgtaa tcacaaccaa aagcccacag

5161 aaattaattg tgttaggatg aatgcagcag gggaagcacc tgaccataca tgagctctag

5221 ttgtcccctc aatccttcat atgactcttc agtgcaactt atacaaacta agtatattgg

5281 acccttgaca aggaaaacta tctgaaagat ggagaatagg taggagttag aaagatttgg

5341 aaataagaag tccatgttaa ttatgcttgg atttatcttc gaatgcggca taaaagtata

5401 caagttttgg acaggaagcc cacatcacct gatgtttggc agcccttaca aatttgatat

5461 ggtcaccact ggaatgaatg aaaacaatag gtcattgccg aaaagaaagc accaattgaa

5521 gaagacagac agacaaacag ataaggttag gccacaagag aagagaaaag aatagaagaa

5581 atgtgatcat tgggtatcat tacacacctg ttctcaacga aagaaatgat tgcttgcaac

5641 gtggcggaaa acccagcaag cttatgctca tctccatacc taagaattgg tttgtttttt

5701 gcacaagtgg tggaaaaatt gaaggggaaa gagaatgcat taagtgaggg tggcaaaggg

5761 tcgtttgttt tgtgcataag tggttgttct tctttttata aaagaaaaga aaatacctag

5821 aataaattgg cttgccagaa ttgctcaaga tgaagaagtg ctttttccgt ttgcgccatg

5881 aagcagaagt atcgtcctgg aaaaagaagg gaataatggt acagtacagg agtagtagtt

5941 agtccagatt agaggatgta gttagtgcgg agtggtgatc catggagatt ggagggagga

6001 ggcatatgat atggaaaacc tcgtggagat gcttcttgtc gcggggccaa tcgtcgtcgt

6061 cgggttgggg ttggggatcg tcgttggcgg cggcgctgga ggcgaggctg gtgcccctct

6121 cggcggcgta gccgctgctg ctggggctgg gtggagccac gtcggcgtct tcgaggtcgt

6181 ccttccaggc ggaggcggag gtgctgatgc tccctaccct ggagacggca gtgaggtagc

6241 cctcgtcgtc gtcgtcgtcg tagtcgtcgt ggatctcgaa gtcgggaggg aggtgagagg

6301 tgcggaggga gagggaggcg agcctcttct ccggcggcgg ggagtcgggg ggaccagggg

6361 ggctagggtt attggtggga ggatccatat ccatgggggg ccttcccgac gcgatgccga

6421 tgcctcttct tcttcttcct tgctcgctcg ctcccctccc ctgtagagaa tgtactctat

6481 tcgattcgat cgtgtctttg ctgggttggg tcgcctccgt cggtcggatt cgatggaacg

6541 agaccggttg ttggctccct ttggctacac tacacacagt ttctctccct tccctggatc

6601 tcttctcctc tacatacagt ccttcattca ttcacttggg ttcaaatcta catatacata

6661 catgttatac cagcaattcc ttactattag taaatccctc gtgccttcgt ttcagcacgc

6721 acgcgactga cacccaccaa aaaccgcatt tcgtctttgg ctatcgcatt ttgctagcac

6781 atgatgtgtt tctaactccc atctctcttt ccccctacac tacagggatg tactacacca

6841 ggatagatat agatattaac cacacaagag aggggcaaaa cacacacaac cggaaatata

6901 accaactctt ccgccgcccc atcattccat tcaacaaccc agagctttgc tccattacca

6961 aactgagtgt atcaacaaat taattaccag tgcgcctgct taaacatgat caaacaagaa

7021 tacctaccca ctcccacttc cagcacacct atgcccaaaa ttacttctac tacttccacc

7081 aaaacaaata taatatccct tccctaatta cacttcaatg cagtaccaaa ctacacaaca

7141 cacccccccc cccccaccaa gaattccatt taagtgtcaa aaataaaatg ccaaaactac

7201 atcacactat cacaatgaac aaatccgatc taataacgat cagttacaaa aatgaatgaa

7261 taggcaggca gcgcagcaca tggaatgttg accaattcca tgtgctatat gctattccgg

7321 actcatcaaa ctctcaagtc aatgttggag tggattcaat gggacagcgc atctcagctt

7381 cacctccttt atgccgcatg ctatatgcta ttccggactc ttcatctcaa agctttatta

7441 cagcaaagca aattaaaata tcatgtgtcc agactccaga gcctgtgcca atgcctatgc

7501 ctatcctgtc agatcgcaac acaaatactt gtaccatctc atactgtctc caagctgcct

7561 tccacgtttc cagtcactag ttagtgaagc agagtgagca atgtacaaat gctaccaggg

7621 gttcttatat tagtctacgt tgacggaatc ctttggtgaa atgaggttgc atcaacttga

7681 catacaaccc attcttttgc accagtgaat catgcgttcc ctgctcaact atctttccac

7741 cattcagaac aacaatgtta tccacatgct tcatcattgc cgccctatgt gcaatgagaa

7801 ctgtcgtctt attccccata atcaatgtgt cgagggcctc ctgcaccact ctactggact

7861 cggattcaat tgcagaactg gcttcgtcaa gcagcaaaat gggtgcattc ttcagcacta

7921 cacgggcaat ggcgattcgc tgcttctgcc caggagttaa atccactccc ctcattccca

7981 catgtgtgtc atagccatgt ggcaaactgc taatgaaatg gtgagcgttc gcaatcctag

8041 ccgcctcttt catctcagac tctgttgcat tgtgccttgc atagattatg ttctccctta

8101 tggttgtgga gaatataact gggtcttgag gaactaaacc catgtggctc cgcaaccatc

8161 tcaagttgaa cagcttcaga tcacggccat ccaataaaac ttgcccggcg gttggatcat

8221 agaatctctc tatcaaagaa attatcgtgc tcttccctga tccagataca cctaccacag

8281 caacagtttg tcctccattg actctaaggc tgaaattact caaaaccatc gtctcagggc

8341 gtgtaggata gcaaaaatca acattcctga attcaatgct accatagaca ttggggggtt

8401 ttagcccact tgcatcatct ggatcaatct tgggtgcacg atcaataatt tcaaataccg

8461 acgtcagaga ttttcgacgc ttgagaatat atggcgcaag gccaaatggc tccaccagtg

8521 caaaagtcgc aaaagagaag acaatgtact ctttaagtgc tgttacca

Claims (10)

1.一种谷蛋白分选相关蛋白，其特征在于选自如（a）或（b）所示的任一种：

（a）由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且仍具有谷蛋白分选相关的由序列1衍生的蛋白质。

2.如权利要求1所述的谷蛋白分选相关蛋白，其特征在于其末端增加有标签序列，优选为Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tag II、或c-myc。

3.编码权利要求1或2所述谷蛋白分选相关蛋白的基因。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述基因是如下1）至4）任一所示的DNA分子：

1）SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

2）SEQ ID NO.3所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码SEQ ID NO.1所述蛋白的DNA分子；

4）与1）或2）或3）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码谷蛋白分选相关蛋白的DNA分子。

5.含有权利要求3或4所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是在pCAMBIA1305.1载体的多克隆位点EcoR I和Nco I之间插入权利要求3或4所述基因得到的重组质粒。

7.权利要求1或2所述蛋白，权利要求3或4所述基因，权利要求5所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在植物育种中的应用。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于其在培育谷蛋白分选正常的转基因植物中的应用，优选的所述植物是水稻。

9.一种培育谷蛋白分选正常的转基因植物的方法，是将权利要求3或4所述基因导入谷蛋白分选异常植物中，得到谷蛋白分选正常的转基因植物；其中所述谷蛋白分选异常为谷蛋白前体异常积累。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述基因通过重组表达载体导入谷蛋白分选异常的植物中，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物，优选为烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、或苜宿。

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