CN108220470B - 一种检测青稞籽粒蛋白的试剂盒和方法 - Google Patents

一种检测青稞籽粒蛋白的试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测青稞低籽粒蛋白质含量的试剂盒，它包括任选的用于检测HvNAM1基因上第+234bp和+1433bp位点处变异的试剂。本发明一种检测青稞低籽粒蛋白质含量的方法。本发明试剂盒可以准确预测青稞品种的籽粒蛋白含量，为农业生产有重要的指导作用。

Description

一种检测青稞籽粒蛋白的试剂盒和方法
技术领域
本发明涉及青稞的质量检测，具体涉及青稞籽粒蛋白的检测试剂盒和方法。
背景技术
青稞，即六棱裸大麦(Hordeum valgare L.var.nudum Hook.f.)，属于禾本科大麦属 (Hordeum vulgare)作物。大麦具有丰富的营养价值和经济价值，六棱裸大麦主要用来食用和而二棱皮大麦则主要用于啤酒酿造业。大麦作为动物的饲料是牲畜的主要蛋白来源，大麦作为人类的食物使用量很少，青藏高原地区是世界上最大的以六棱裸大麦(青稞)为人类口粮的地区。大麦籽粒蛋白质含量与大麦品质之间有复杂的交互作用(Fox et al.,2003)。籽粒蛋白质含量是决定谷物品质的重要因素，高籽粒蛋白质含量的大麦(12％以上)由于对品质有较好的影响和较高的营养价值，通常被用作饲料和食用，而低籽粒蛋白质含量的大麦(11.5％以下)通常被用于啤酒酿造(Distelfeld et al.,2008)或饼干等。
籽粒蛋白质含量是衡量谷类作物品质的重要指标，其含量受包括基因型和环境因素在内的多重因素的影响(Jukanti&Fischer,2008；Smith,1990；Blanco et al.,2012；Bogard et al., 2010)。传统的育种过程在籽粒蛋白质含量品质改良方面进展很慢，因为籽粒蛋白质含量受复杂的基因调控的影响(Simmonds,1995)。因此，通过基因手段提前检测青稞品种的籽粒蛋白有非常重要的实际意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种检测青稞籽粒蛋白含量的方法。
本发明检测青稞低籽粒蛋白质含量的试剂盒，它包括任选的用于检测HvNAM1基因上第+234bp和+1433bp位点处变异的试剂。
优选地，它包括检测HvNAM1基因上第+234bp为C和+1433bp为A的试剂。
优选地，它还包括任选的用于检测HvNAM1基因上第+54bp、+544bp、+563bp和 +1004bp位点处变异的试剂。
优选地，它包括检测HvNAM1基因上第+54bp为G、+544bp为C、+563bp为A和 +1004bp为G的试剂。
优选地，所述试剂为测序用试剂、Snapshot试剂、限制性片段长度多态性方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。
优选地，所述试剂还包括扩增HvNAM1基因全长序列并检测第+54bp、第+234bp、+544bp、+563bp、+1004bp和+1433bp位点的试剂。
本发明还提供了检测HvNAM1基因上第+234bp和+1433bp位点处变异的试剂在制备检测青稞低籽粒蛋白质含量的试剂中的用途。
本发明还提供了一种检测青稞低籽粒蛋白质含量的方法，其特征在于：步骤如下：
1)检测HvNAM1基因上第+234bp和+1433bp位点处的碱基；
2)根据步骤1)的结果预测青稞低籽粒蛋白质含量。
步骤1)中，还同时检测HvNAM1基因上第+54bp、+544bp、+563bp和+1004bp位点的碱基。
步骤1)中，所述检测基因的碱基的方法是测序、Snapshot、限制性片段长度多态性方法或者单链构象多态性分析方法。
步骤2)中，若HvNAM1基因上第+234bp为C和+1433bp为A，则青稞低籽粒蛋白质含量低。
本发明的关键在于发现了青稞HvNAM1基因上的SNP位点与青稞的籽粒蛋白相关，通过测序或者其他现有常规方法确定青稞品种的HvNAM1基因上的第+234bp和+1433bp 位点处的碱基，或者还可以进一步第+54bp、+544bp、+563bp和+1004bp位点的碱基，就可以准确预测青稞品种的籽粒蛋白的含量，如，若检测多青稞品种的HvNAM1基因上第 +234bp为C和+1433bp为A，则其栽种得到的青稞低籽粒蛋白质较低，营养价值低，可以选择不栽种此类青稞。
本发明方法检测方法简单，通过测序即可确定青稞籽粒蛋白含量，不需要栽种后选取大规模的样品进行检测，操作简便。
本发明首次阐明了青稞HvNAM1基因上的位点多态性与籽粒蛋白的相关性。使用本发明提供的试剂盒，可以预测青稞品种的籽粒蛋白含量，为农业生产有重要的指导作用。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1本发明青稞HvNAM1基因单倍型Hap3与青稞籽粒蛋白含量的相关性
一、实验方法
1、实验材料
参试材料共计302份。从地理来源上覆盖了青藏高原及其毗邻的青稞各大种植区(西藏、青海、甘肃、云南、贵州、四川)，另外还包含部分青藏高原以外的外引大麦栽培品种。从材料类型上划分，包含青藏高原野生大麦品种185份，青稞地方品种73份，青稞育成品种(系)30份，外引大麦栽培品种14份(参试材料详细信息见附表1)。所有参试材料于2013年和2014年在青海省湟中县大源乡地窑村(N 36°28'29.36”，E 101°31'9.15”，海拔2700m)进行种植，每份材料种植两行，行长2m，行距20cm，每行种植40粒种子，三次重复，生育期内采取相同的田间管理措施。
2、籽粒蛋白质含量测定
按不同材料收获后的种子，经过充分的自然干燥直到达到恒定的质量(多次称重间质量差异<0.01g)，取适量种子粉碎，用近红外谷物分析仪(型号：DA7250，Perten，Sweden) 测定蛋白含量。取三次重复的平均值作为该材料的籽粒蛋白质含量。
3、青稞HvNAM1基因单倍型的测定
(1)参试材料DNA提取
采用改进的CTAB法(Stewart Jr&Via,1993)提取参试材料基因组DNA，每份材料取5粒种子种于培养皿中，至3叶-4叶期取新鲜叶片进行DNA的提取，详细步骤如下：
(1)取幼嫩植株叶片置于研钵，液氮冷冻研磨至粉末，转移至2ml EP管中(粉末的量大约为EP管的1/4-1/3)；
(2)EP管中加入980μL 65℃预热的2×CTAB缓冲液及20μLβ-巯基乙醇，充分混匀；
(3)EP管置于水浴锅65℃水浴60min(根据情况可适当调整)；每隔15min轻轻混匀一下；
(4)水浴结束后，取出EP管，10,000rpm离心10min；
(5)将上清液转移至2ml干净EP管中(大约1000ul)。加入500μL Tris-饱和酚与500ul 氯仿，充分混匀，轻摇20min。静置至分层，10,000rpm，离心15min；
(6)取上清于另一干净1.5ml EP管中，加入等体积的氯仿，混匀，轻摇10min。静置至分层，10,000rpm，离心10min；
(7)取上清，加入等体积的-20℃预冷的异丙醇，混匀。-20℃下放置30min；
(8)10,000rpm，离心10min。倒掉上清，留沉淀；
(9)70％乙醇清洗沉淀两遍，无水乙醇洗一遍；
(10)沉淀自然晾干，加入200μL ddH2O溶解沉淀；
(11)至沉淀充分溶解，加入适量RnaseA，37℃水浴中降解1h；
(12)加入300μL水，补充体积至500μL；
(13)重复步骤5、6；
(14)加入10％体积的5M醋酸钠，2倍体积的预冷无水乙醇，混匀至出现絮状沉淀。15-20℃下放置30min，10,000rpm，离心10min。倒掉上清，留沉淀；
(15)重复步骤9；
(16)沉淀晾干，加入100μL 1×TE，溶解沉淀；
(17)用1％浓度的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，紫外分光光度计进行DNA浓度测定。
(2)PCR扩增
PCR反应所用引物
Figure RE-GDA0001653785450000041
用前述表格中的引物，以100×供试材料基因组DNA为模板，采用rTaq酶(上海生工生物工程股份有限公司)进行PCR扩增，三次重复。
PCR反应体系：
Figure RE-GDA0001653785450000042
10×PCR Buffer(Mg2+Plus)
Tris-HCl(pH8.3) 100mM
KCl 500mM
MgCl2 15mM
PCR反应程序：
HvNAM1：
Figure RE-GDA0001653785450000051
(3)PCR产物检测与测序
取上述PCR扩增产物2μL，用1％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测。参试材料HvNAM1基因序列采用PCR产物直接测序的方法，在全长序列的1/3和2/3处分别设计两对测序引物进行双向测序测定，确定青稞HvNAM1基因第+54位、第+234位、第+544 位、第+563位、第+1004位、第+1433位的碱基。所有测序工作在生工生物工程(上海) 股份有限公司进行。
青稞HvNAM1基因(NCBI DQ869678)第+54位、第+234位、第+544位、第+563 位、第+1004位、第+1433位的碱基的不同可以形成8种单倍型，分别为：TGGAGG(Hap1)、 GCCAGG(Hap2)、GCCAGA(Hap3)、GGCAGG(Hap4)、GGCAGA(Hap5)、GGCCGG (Hap6)、GGGAGG(Hap7)、GGCAAG(Hap8)。
基因单倍型Hap3为GCCAGA：即HvNAM1—SNP1为第+54位，该位点的碱基为G；HvNAM1—SNP2为第+234位，该位点的碱基为C；HvNAM1—SNP3为第+544，该位点的碱基为C；HvNAM1—SNP4为第+563位，该位点的碱基为A；HvNAM1—SNP5为第 +1004位，该位点的碱基为G；HvNAM1—SNP6为第+1433位，该位点的碱基为A。
二、实验结果
1、HvNAM1基因单倍型与籽粒蛋白质含量的相关性
结果如表1所示：
表1 8个HvNAM1单倍型在不同类型材料群体中的出现频率(F)及其对应的籽粒蛋白质含量平均值
Figure RE-GDA0001653785450000052
Figure RE-GDA0001653785450000061
参试材料群体籽粒蛋白质含量平均值为13.563％(表1)。携带不同HvNAM1基因单倍型的材料间，其籽粒蛋白质平均含量差异较大。其中，携带单倍型Hap4的材料籽粒蛋白质平均含量最高(14.773％)，携带Hap3单倍型的材料籽粒蛋白质平均含量最低 (11.813％)。对携带不同单倍型材料的蛋白质平均含量排序，依次为Hap4(14.773％)> Hap7(14.340％)>Hap8(14.130％)>Hap5(13.875％)>Hap2(13.855％)>Hap1 (13.240％)>Hap6(12.430％)>Hap3(11.813％)。
2、HvNAM基因与表型性状的关联分析
选取TASSEL软件的一般线性模型(GLM)和混合线性模型(MLM)，对参试材料群体HvNAM基因序列中发掘到的单倍型和SNP位点与籽粒蛋白质含量性状进行关联分析，在计算过程中舍弃最小等位基因频率(Minor Allele Frequency,MAF)小于0.05的SNP 位点。当P<0.05(-lgP>1.30)时，该位点被认为与目标性状显著关联。
两种方法在HvNAM1基因内都检测到HvNAM1有2个SNP位点与GPC显著关联，分别是Exon1的+234bp处的G/C替换和Exon3的+1433bp处的G/A替换，两种方法检测结果完全一致。Exon1中+234bp处G/C替换引起编码氨基酸的色氨酸/半胱氨酸(Trp/Cys) 的错义突变，两种模型下的变异解析率分别是8.84％和1.39％。Exon3中+1433bp处的G/A 替换引起编码氨基酸的丙氨酸/苏氨酸(Ala/Thr)的错义突变，两种模型下的变异解析率分别是1.58％(GLM)和4.01％(MLM)。单倍型Hap3在上述两个位点同时发生碱基替换，而携带有Hap3单倍型的材料其GPC均值仅有11.81％，在所有8种单倍型中最低。同时，单倍型Hap3同蛋白质含量间在“GLM”和“MLM”两种模型下均存在显著关联，其变异解析率分别是9.11％和1.30％，说明Hap3单倍型同低蛋白质含量这一性状密切相关。
根据上述实验结果可以看出，青稞HvNAM1基因第+54位、第+234位、第+544位、第+563位、第+1004位、第+1433位SNP变异形成的基因型与籽粒蛋白的含量相关，如，基因型为Hap4时，籽粒蛋白的含量平均高达14.773，显著高于其余基因型的含量，基因型Hap3时，籽粒蛋白的含量为11.813，显著低于其余基因型的含量；经过进一步关联分析，特别是与+234bp和+1433bp处的变异显著关联，特别是+234bp为C，第+1433位为 A时，青稞品种籽粒蛋白的含量低。因此，可以通过检测青稞HvNAM1基因第+234位、和第+1433位SNP位点的碱基，来预测青稞品种籽粒蛋白的含量，进一步地，还可以进一步补充检测第+54位、第+544位、第+563位、第+1004位SNP位点的碱基。
本发明首次阐明了青稞HvNAM1基因上的SNP位点与籽粒蛋白的相关性，使用本发明提供的试剂盒，可以预测青稞品种的籽粒蛋白含量，为农业生产有重要的指导作用。
序列表
<110> 中国科学院西北高原生物研究所
<120> 一种检测青稞籽粒蛋白的试剂盒和方法
<130> GY417-18P1025
<141> 2018-01-22
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> HvNAM1F（Hordeum valgare）
<400> 1
ctccctcccc acggttattt cct 23
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> HvNAM1R（Hordeum valgare）
<400> 2
cattgcttat ttacatacac gcctag 26

Claims (8)

1.一种检测青稞低籽粒蛋白质含量的试剂盒，其特征在于：它包括任选的用于检测HvNAM1基因上第+234bp为C和+1433bp为A的试剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：它还包括任选的用于检测HvNAM1基因上第+54bp、+544bp、+563bp和+1004bp位点处变异的试剂。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：它包括检测HvNAM1基因上第+54bp为G、+544bp为C、+563bp为A和+1004bp为G的试剂。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂为测序用试剂、Snapshot试剂、限制性片段长度多态性方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。
5.根据权利要求1～3任意一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂还包括扩增HvNAM1基因全长序列并检测第+54bp、第+234bp、+544bp、+563bp、+1004bp和+1433bp位点的试剂。
6.检测HvNAM1基因上第+234bp和+1433bp位点处变异的试剂在制备检测青稞低籽粒蛋白质含量的试剂中的用途。
7.一种检测青稞低籽粒蛋白质含量的方法，其特征在于：步骤如下：
1)检测HvNAM1基因上第+234bp和+1433bp位点处的碱基；
2)根据步骤1)的结果预测青稞低籽粒蛋白质含量；若HvNAM1基因上第+234bp为C和+1433bp为A，则青稞低籽粒蛋白质含量低。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤1)中，还同时检测HvNAM1基因上第+54bp、+544bp、+563bp和+1004bp位点的碱基；
和/或，步骤1)中，所述检测基因的碱基的方法是测序、Snapshot、限制性片段长度多态性方法或者单链构象多态性分析方法。
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Colinearity between the barley grain protein content (GPC) QTL on chromosome arm 6HS and the wheat Gpc-B1 region;Assaf Distelfeld等;《Mol Breeding》;20080115;25-38 *
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EU368852.1;GenBank;《GenBank》;20080206;"DEFINITION"和"FEATURES"部分 *
Grain protein content variation and its association analysis in barley;Shengguan Cai等;《BMC Plant Biology》;20131231;1-11 *

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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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