CN114262741A

CN114262741A - 苏氏圆腹鲶抗病性状相关的snp分子标记及其应用

Info

Publication number: CN114262741A
Application number: CN202111283863.0A
Authority: CN
Inventors: 刘文生; 黎遗富; 阮灼豪; 蒋亮森; 卢志强; 张细权
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2021-11-01
Filing date: 2021-11-01
Publication date: 2022-04-01

Abstract

本发明公开了苏氏圆腹鲶抗病性状相关的SNP分子标记及其应用。本发明在苏氏圆腹鲶的补体C4基因上发现了与其抗病性相关的SNP分子标记位点，所述位点与苏氏圆腹鲶的抗病性显著相关，因而可将其运用到苏氏圆腹鲶的分子标记辅助选育中，为苏氏圆腹鲶的品种培育提供了有效的遗传标记，加速了育种进程。

Description

苏氏圆腹鲶抗病性状相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于鱼类分子标记辅助育种选育技术领域。更具体地，涉及苏氏圆腹鲶抗病性状相关的SNP分子标记及其应用。

背景技术

由嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染引起的细菌性败血症，可导致鱼体全身各部位充血，出现溃疡、肠道出血、肝脏发白、腹腔积水以及溃烂等症状，且一旦发病，很难用药物来进行控制和治疗，最终导致鱼类大量死亡，严重影响鱼类养殖业的发展。因此，筛选与鱼类抗嗜水气单胞菌相关的分子标记，对鱼类进行抗病选择育种具有重要意义。

例如，沈玉帮在对草鱼补体C6和C7基因与细菌性败血症的关联分析中发现，C6基因上的单倍型GCCC与细菌性败血症易感性显著相关(沈玉帮.草鱼4个补体基因克隆表达和连锁及与细菌性败血症的关联分析[D].上海海洋大学,2013.)，为草鱼抗病品种的选育提供了支持。

苏氏圆腹鲶(Pangasianodon hypophthalmus)又名巴沙鱼，具有生长快、耐低氧、无肌间小刺等特点，是东南亚国家重要的淡水养殖品种，在我国的养殖规模也日渐扩大。然而，随着养殖集约化程度的提高，近亲繁殖导致的经济性状退化，鱼药的滥用以及养殖环境的恶化等，使得嗜水气单胞菌等对苏氏圆腹鲶养殖过程中的危害越来越严重。因此，亟需寻找与苏氏圆腹鲶抗病性状相关的分子标记，进行抗病选择育种。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种与苏氏圆腹鲶抗病性状相关的SNP分子标记及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种与苏氏圆腹鲶生长性状相关的SNP分子标记。

本发明的第二个目的是提供所述SNP分子标记在苏氏圆腹鲶分子标记辅助选育中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种用于检测所述SNP分子标记的引物。

本发明的第四个目的是提供所述SNP分子标记的检测试剂盒。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明通过直接测序法对苏氏圆腹鲶的补体C4基因进行了单核苷酸多态性(SNP)检测，通过分析不同基因型与苏氏圆腹鲶抗病性状的相关性，最终筛选出了可作为苏氏圆腹鲶分子辅助育种的SNP，为辅助苏氏圆腹鲶的分子育种提供科学依据。

本发明提供了一种与苏氏圆腹鲶抗病性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记的序列如SEQ ID NO.1所示。

具体地，SEQ ID NO.1所示序列的第288位为SNP位点：SNP1 C>T。

具体地，SEQ ID NO.1所示序列的第269位为SNP位点：SNP2 A>T。

具体地，SNP1为T的苏氏圆腹鲶的抗病性显著高于为C的个体。

具体地，SNP2为A时苏氏圆腹鲶的抗病性显著高于为T的个体。

具体地，SNP2为AA基因型的苏氏圆腹鲶的抗病性显著高于AT或TT基因型个体。

具体地，所述抗病性状为抗细菌性败血症性状。

本发明在苏氏圆腹鲶的补体C4基因上发现了与其抗病性相关的SNP分子标记位点，所述位点与苏氏圆腹鲶的抗细菌性败血症性状显著相关，因而可将其运用到苏氏圆腹鲶的分子标记辅助选育中。因此，本发明申请保护上述SNP分子标记在苏氏圆腹鲶分子标记辅助选育中的应用。

本发明还提供了一种用于检测上述SNP分子标记的引物，所述引物的序列如SEQID NO.2～3所示。

本发明还提供了一种上述SNP分子标记的检测试剂盒，其包含SEQ ID NO.2～3所示引物。

本发明具有以下有益效果：

本发明在苏氏圆腹鲶的补体C4基因上发现了与其抗病(细菌性败血症)性相关的SNP分子标记位点，所述位点与苏氏圆腹鲶的抗病性显著相关，因而可将其运用到苏氏圆腹鲶的分子标记辅助选育中，为苏氏圆腹鲶的品种培育提供了有效的遗传标记，加速了育种进程。

附图说明

图1为SNP1 C>T位点的测序信息图。

图2为SNP2 A>T位点的测序信息图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1苏氏圆腹鲶补体C4基因的克隆及SNP位点筛选与分型

1、实验动物处理

本发明所用苏氏圆腹鲶样本均取自同一市场，共500尾，重量均在100g左右。苏氏圆腹鲶从养殖桶中打捞上来后，先在桶里暂养至稳定，水温保持在27～29℃，随后注射0.2mL嗜水气单胞菌菌液(菌液浓度为1×10⁷cfu/mL)，人工诱发感染。采集48h内最先死亡的鱼作为易感组，以及5d后无感染症状的个体作为抗病组，分别获得易感组121尾和抗病组124尾。剪取易感组和抗病组个体的鳍条样本，置于无水乙醇中暂时保存，并置于-20℃长期保存，作为提取基因组DNA的样本，用于后续多态性实验。

2、引物设计及PCR扩增

本发明根据GenBank数据库公布的苏氏圆腹鲶补体C4基因组序列，设计了引物C4-F/C4-R(SEQ ID NO.2～3)用于扩增C4基因的CDS区域。引物信息见表1。

表1 C4基因的CDS克隆及SNP筛选所需引物

随机选取保存的易感组和抗病组苏氏圆腹鲶样本各10个，提取DNA作为模板，提取的基因组DNA通过紫外分光光度计检测浓度，并稀释至100ng/μL用于目的基因的PCR扩增。反应体系见表2。

表2 C4基因CDS区域的PCR扩增体系

PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸5min。

PCR产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳检查其纯度和完整性，选择条带单一且明亮的产物委托广州天一辉远基因科技有限公司进行测序。

扩增所得序列如下(SEQ ID NO.1)所示：

GAATGATCTCTTCACAAATATTTACTTAACTGTTGGTGTATCAGAAGTTTAGTTATTGACAGACTACTCTACAATTGTGCAAATCTATTTAATTGGAATCAACTATCCAAAATAACTATCCAATTGATTTAAATACATGTAAATCAATGTACCATAGGAAAAGTGCTATATAAATAAATTTGGTAATTTGGTAACTTTCTGTGAAGGCCATATGAATAATAACTTATGAATACCTTCATAACATATTATAATTTATTCATAAGGCATTATAAGCATTGTTATAACTATTTATGAAAAGCCATTACAGTTTGTAGCATTGTTTTACTGCACTTATAAATGGATAAAATGATGCATTATAAGTAGTGCTTATAACACATTATAATCTCCATTATATCTTCTCATAATGCACTCTGCGCAATGGGGCTTGGTGATATAATGTATTATAAAGGCTACTTATAATGCATTTTGCTAAGTTAATCTTTAACTTACAATTCCACATCTGGAATAGTGACAGTCTTCTGCAGGATTTGTTCAGAACTCAGAATATGAGTGTAGACCAGCAGGCCTTTGGAGTTCTGTGAAGAATTTTCAGTCGGCTTATATTTCATTCTTACACTACAGAAATGTAATTGTTATTACCCAGTGTGCCCGTGAAAACACATAACAGGATACTCACAAATATCTGGACATTGACTAAATCGTTTATAGGGAGCAAGTAGTTATCTAGAGTGAAGATTCTATATTTCACTGAAAAAATGAAAAACAAACAGCAACAGTAATTAATACAATGGACTGTTATACATCAAATAAATTACATAAACATAATTTCTGTTTTCATAAAAATCTCCGATTTCTTACCATGTTCTCCTGGATTATAGATTGTCTTGTCTGTTTGGATGAAAATATAACCCCTTCTAGTTGACAAAAGGATATGGACCATTTTTTTACGTTCAAAAACATCTCCTCGCTCAGCAACAAGAAGGACATATGGATCATTCTG[T/C]TGTTTGAGACTGCGAAACTTAACTGGATCCACCTGAAGAGGCACAAAAAGCTGTCTGAATAAGTATATATTAGAGAATATAAGGAATATAACACAGCGGGTTTGCTGTTATAGGAAAATAATCAGCAATGGACTGGAGCGATCCATTATCAACAGCACATCCAAAGTGTTTTATTACCTATTTACAACAACAGTTATTCAAAGATTACAATTTTTTATTTATCAAAAAGTGAACCTTGCCAATATTTATCCATTTATAGTTGTGGATCAACCACAAAAACAGTTATCACTTACATTATAGTAGCTATAAACATCGTAATTCCCTTCCCCTTCCTCTCTTTTTTCACTCTCTTTTGAACTTAATAAGACAAAAATGTGGTTTATCATTTTACTGAGCAACCAGAAAGCACAAAGTCCTATGTCCTGAAGACTTTCCCATGTCAGAAAACAACAGCTTTATTCCTGACTTCCATAGAAACAACAATGTATTAGGAGAAGTGCATTAATATAAACCTGTGATTTACATCTGCACTATCATCAGAGCTGCTGTAGAAAATTCTGTTACAGAAAACATCTGAGCAATCAGATTTGAAAATTCAACAGCACTGGGTAGAAATACATCTACTATATATTGTATATTTAGAGTGTACTTTATATTCCATAAATATCTTTGGGGTAAATGATTATAGACTACATGTGACAAATAGGTAACAATAACATGGACTTGCCTTAAGTGTCACCACGGCTTGATATTGATTATCATCATTTAAGGTCACGGTTCTTGGTTCACATAACGTTGTGGATCCTAAAGCATCTTTGAAATATAGAGTTACACTGGCACTTTTAGTGGCTCCATGCAGTTGCACACTCACTGTCTCCTCCACTCCCAAGTGAATAATATTCGGGGCAGTAATTAGACATCTGGTGCATAAGTGCAAACACACAAAAACAAAGCTGCAAGATTGTTTTCATGCAAAAGACATGACAAAGCTGCATTTTTC

3、SNP位点筛选与分型

利用软件对测序所得的易感组的10条序列，抗病组的10条序列和1条参考序列(XM_034310914.1)进行对比分析，将同一位点不同碱基比例大于1/3的判定为SNP位点。通过筛选不一致的位点，初步获得2个SNP位点，依次命名为SNP1 C>T和SNP2 A>T，具体如表3所示。具体地，SNP1位于CDS区(SEQ ID NO.1)序列的第288位，属于外显子区域，SNP1位点突变为同义突变，而SNP2位于CDS区(SEQ ID NO.1)序列的第269位，属于内含子区域，SNP2位点不参与编码氨基酸。

表3苏氏圆腹鲶补体C4基因CDS区域单核苷酸多态性(SNP)位点统计

注：“—”表示没有(SNP2位于CDS区的内含子区域，不编码氨基酸)。

统计样品SNPs位点的碱基，通过测序峰分析确定SNPs位点基因型。SNP1C>T位点测序信息(三种基因型)如图1所示，SNP2 A>T位点测序信息如图2所示；图中单峰表示为纯合基因型，套峰表示为杂合基因型。

实施例2 SNP位点遗传性分析与抗病性状的关联分析

1、C4基因单核苷酸多态性(SNP)位点遗传性分析

苏氏圆腹鲶补体C4基因2个SNP位点在抗病群体和易感群体中的遗传性信息分别如表4和表5所示。由表4和表5可知，SNP1 A>G均是低度多态(PIC<0.25)，表明该位点的遗传纯度较高，基因交流较少。而SNP2 A >T位点处于中度多态性(0.25<PIC<0.5)，表明该位点作为遗传标记能够提供较为合理的遗传信息。

表4苏氏圆腹鲶C4基因2个SNP位点在抗病群体中的遗传信息

注：Na代表等位基因数；He代表观测杂合度；Ne代表期望杂合度；PIC代表多态信息含量；HW test代表哈迪温伯格平衡。

表5苏氏圆腹鲶C4基因2个SNP位点在易感群体中的遗传信息

利用表1所示引物，通过直接测序法对SNP位点进行PCR扩增。将PCR产物测序，根据测序峰图确定SNP位点的基因型。使用SPSS分析软件的广义线性模型(General LinearModel，GLM)程序和t检验，对SNP位点基因型与苏氏圆腹鲶的抗病性状进行关联分析，经方差分析检验呈显著性差异的特点，使用Duncan法进行多重比较。

分析结果分别如表6和7所示，等位位点为C在SNP 1T>C的抗病性状显著低于等位位点为T(p<0.05)，即SNP1为T的苏氏圆腹鲶的抗病性显著高于为C的个体；等位位点为T在SNP 2T>C的抗病性状显著低于等位位点为A(p<0.05)，即SNP2为A时苏氏圆腹鲶的抗病性显著高于为T的个体。AA基因型在SNP 2A>T的抗病性状显著高于基因型AT和TT(p<0.05)，即SNP2为AA基因型的苏氏圆腹鲶的抗病性显著高于AT或TT基因型个体。

表6 SNP1在易感群体和抗性群体中的基因型和等位基因情况

表7 SNP2在易感群体和抗性群体中的基因型和等位基因情况

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 苏氏圆腹鲶抗病性状相关的SNP分子标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2001

<212> DNA

<213> 苏氏圆腹鲶(Pangasianodon hypophthalmus)

<400> 1

gaatgatctc ttcacaaata tttacttaac tgttggtgta tcagaagttt agttattgac 60

agactactct acaattgtgc aaatctattt aattggaatc aactatccaa aataactatc 120

caattgattt aaatacatgt aaatcaatgt accataggaa aagtgctata taaataaatt 180

tggtaatttg gtaactttct gtgaaggcca tatgaataat aacttatgaa taccttcata 240

acatattata atttattcat aaggcattat aagcattgtt ataactattt atgaaaagcc 300

attacagttt gtagcattgt tttactgcac ttataaatgg ataaaatgat gcattataag 360

tagtgcttat aacacattat aatctccatt atatcttctc ataatgcact ctgcgcaatg 420

gggcttggtg atataatgta ttataaaggc tacttataat gcattttgct aagttaatct 480

ttaacttaca attccacatc tggaatagtg acagtcttct gcaggatttg ttcagaactc 540

agaatatgag tgtagaccag caggcctttg gagttctgtg aagaattttc agtcggctta 600

tatttcattc ttacactaca gaaatgtaat tgttattacc cagtgtgccc gtgaaaacac 660

ataacaggat actcacaaat atctggacat tgactaaatc gtttataggg agcaagtagt 720

tatctagagt gaagattcta tatttcactg aaaaaatgaa aaacaaacag caacagtaat 780

taatacaatg gactgttata catcaaataa attacataaa cataatttct gttttcataa 840

aaatctccga tttcttacca tgttctcctg gattatagat tgtcttgtct gtttggatga 900

aaatataacc ccttctagtt gacaaaagga tatggaccat ttttttacgt tcaaaaacat 960

ctcctcgctc agcaacaaga aggacatatg gatcattctg ttgtttgaga ctgcgaaact 1020

taactggatc cacctgaaga ggcacaaaaa gctgtctgaa taagtatata ttagagaata 1080

taaggaatat aacacagcgg gtttgctgtt ataggaaaat aatcagcaat ggactggagc 1140

gatccattat caacagcaca tccaaagtgt tttattacct atttacaaca acagttattc 1200

aaagattaca attttttatt tatcaaaaag tgaaccttgc caatatttat ccatttatag 1260

ttgtggatca accacaaaaa cagttatcac ttacattata gtagctataa acatcgtaat 1320

tcccttcccc ttcctctctt ttttcactct cttttgaact taataagaca aaaatgtggt 1380

ttatcatttt actgagcaac cagaaagcac aaagtcctat gtcctgaaga ctttcccatg 1440

tcagaaaaca acagctttat tcctgacttc catagaaaca acaatgtatt aggagaagtg 1500

cattaatata aacctgtgat ttacatctgc actatcatca gagctgctgt agaaaattct 1560

gttacagaaa acatctgagc aatcagattt gaaaattcaa cagcactggg tagaaataca 1620

tctactatat attgtatatt tagagtgtac tttatattcc ataaatatct ttggggtaaa 1680

tgattataga ctacatgtga caaataggta acaataacat ggacttgcct taagtgtcac 1740

cacggcttga tattgattat catcatttaa ggtcacggtt cttggttcac ataacgttgt 1800

ggatcctaaa gcatctttga aatatagagt tacactggca cttttagtgg ctccatgcag 1860

ttgcacactc actgtctcct ccactcccaa gtgaataata ttcggggcag taattagaca 1920

tctggtgcat aagtgcaaac acacaaaaac aaagctgcaa gattgttttc atgcaaaaga 1980

catgacaaag ctgcattttt c 2001

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caagccaggc agagagttat atca 24

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtgctttct ggttgctcag 20

Claims

1.一种与苏氏圆腹鲶抗病性状相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的与苏氏圆腹鲶抗病性状相关的SNP分子标记，其特征在于，SEQID NO.1所示序列的第288位为SNP位点：SNP1 C>T。

3.根据权利要求1所述的与苏氏圆腹鲶抗病性状相关的SNP分子标记，其特征在于，SEQID NO.1所示序列的第269位为SNP位点：SNP2 A>T。

4.根据权利要求2所述的与苏氏圆腹鲶抗病性状相关的SNP分子标记，其特征在于，SNP1为T的苏氏圆腹鲶的抗病性显著高于为C的个体。

5.根据权利要求3所述的与苏氏圆腹鲶抗病性状相关的SNP分子标记，其特征在于，SNP2为A时苏氏圆腹鲶的抗病性显著高于为T的个体。

6.根据权利要求3所述的与苏氏圆腹鲶抗病性状相关的SNP分子标记，其特征在于，SNP2为AA基因型的苏氏圆腹鲶的抗病性显著高于AT或TT基因型个体。

7.根据权利要求1～6任一所述SNP分子标记，其特征在于，所述抗病性状为抗细菌性败血症性状。

8.权利要求1～6任一所述SNP分子标记在苏氏圆腹鲶分子标记辅助选育中的应用。

9.一种用于检测权利要求1～6任一所述SNP分子标记的PCR引物，其特征在于，所述引物的序列如SEQ ID NO.2～3所示。

10.一种用于检测权利要求1～6任一所述SNP分子标记的检测试剂盒，其特征在于，包含SEQ ID NO.2～3所示引物。